Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.
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Articolo metodologico
Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cardiomiociti, la cellula cavallo di battaglia del cuore, contengono elementi citoscheletrici e contrattili squisitamente organizzati che generano la forza contrattile utilizzata per pompare il sangue. I singoli cardiomiociti sono stati isolati per la prima volta oltre 40 anni fa al fine di studiare meglio la fisiologia e la struttura del muscolo cardiaco. Le tecniche sono rapidamente migliorate per includere la digestione enzimatica tramite perfusione coronarica. Più recentemente, l'analisi della contrattilità e del flusso di calcio dei miociti isolati ha fornito uno strumento vitale nell'analisi cellulare e subcellulare dell'insufficienza cardiaca. L'ecocardiografia e l'ECG forniscono informazioni sul cuore solo a livello di organo. Esistono sistemi di coltura cellulare di cardiomiociti, ma le cellule mancano di strutture fisiologicamente essenziali come i sarcomeri organizzati e i tubuli T necessari per la funzione dei miociti all'interno del cuore. Nel protocollo qui presentato, i cardiomiociti vengono isolati tramite perfusione di Langendorff. Il cuore viene rimosso dal topo, montato attraverso l'aorta su una cannula, perfuso con enzimi della digestione e le cellule vengono introdotte per aumentare le concentrazioni di calcio. Il software di rilevamento dei bordi e dei sarcomeri viene utilizzato per analizzare la contrattilità e un colorante fluorescente legante il calcio viene utilizzato per visualizzare i transitori di calcio dei cardiomiociti stimolati elettricamente; Aumentare la comprensione del ruolo che i cambiamenti cellulari svolgono nella disfunzione cardiaca. Tradizionalmente utilizzato per testare gli effetti dei farmaci sui cardiomiociti, impieghiamo questo sistema per confrontare i miociti di topi WT e topi con una mutazione che causa cardiomiopatia dilatativa. Questo protocollo è unico nel suo confronto di cellule vive di topi con funzione cardiaca nota e genetica nota. Molte condizioni sperimentali vengono confrontate in modo affidabile, tra cui la manipolazione genetica o ambientale, l'infezione, il trattamento farmacologico e altro ancora. Oltre ai dati fisiologici, i cardiomiociti isolati sono facilmente fissati e colorati per gli elementi del citoscheletro. L'isolamento dei cardiomiociti tramite perfusione è un metodo estremamente versatile, utile nello studio dei cambiamenti cellulari che accompagnano o portano all'insufficienza cardiaca in una varietà di condizioni sperimentali.
Introduzione
I cardiomiociti forniscono la forza contrattile per il cuore. Ogni miocita contiene elementi citoscheletrici e contrattili organizzati essenziali per la contrazione. Il cuore non contiene solo cardiomiociti, ma anche fibroblasti, tessuto connettivo e miociti modificati come le fibre di Purkinje. Cambiamenti in uno o tutti questi tipi di cellule possono essere osservati nell'insufficienza cardiaca, rendendo difficile determinare la causa ultima della disfunzione cardiaca. La diminuzione della contrattilità ventricolare di un cuore in insufficienza cardiaca è preceduta da vari gradi di accumulo di tessuto fibroso, ipertrofia e disfunzione dei cardiomiociti1. ....
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Protocollo
Assicurarsi che tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono approvati con l'uso appropriato degli animali e la cura del corpo.
1 Preparare buffer di archivio in anticipo
- Preparare 2 L stock Ca 2 + libero di Tyrode (Tabella 1). Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
- Preparare 2 L stock di 1.2 mM Ca 2 + Tyrode (Tabella 2). Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
2 Sul giorno dell'esperimento, preparare perfusione, trasferimento, e digestione Buffer
- Preparare il tampone di perfusione 150 ml di Ca 2 + libero di ....
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Risultati
Una volta che la contrattilità e tracciati transitori vengono raccolti (Figura 2), i dati possono essere facilmente analizzati con il software appropriato. L'intero tracciato, o parti di essi possono essere mediate (Figura 3). Contrattilità può essere analizzato in una varietà di modi. Per la funzione sistolica, si può valutare l'ampiezza della contrazione con accorciamento frazionale, o la velocità di contrazione con il tempo al picco accorciando, e la velocità di contrazione. .......
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Discussione
Isolamento di cardiomiociti di qualità richiede un certo livello di pratica e di ottimizzazione. Questo protocollo contiene passaggi chiave che possono influenzare notevolmente il risultato della digestione. Questi dovrebbero essere considerate attentamente quando si esegue la risoluzione dei problemi e il protocollo. Il tempo dalla rimozione del cuore di cannulazione e perfusione deve essere ridotto al minimo, idealmente meno di cinque minuti. Sciacquare immediatamente il cuore in tampone di perfusione ghiacciato dopo .......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Marc Wozniak per l'utilizzo del Dipartimento di Cell e Developmental Biology attrezzature videografia.
Vanderbilt University cellulare Imaging risorsa condivisa.
Questo lavoro è supportato da AHA concessione 12PRE10950005 di ERP, AHA concessione 11GRNT7690040 a DMB, NIH concedere R01 HL037675 a DMB. DMB è il presidente Gladys P. Stahlman di Ricerca Cardiovascolare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-glucosio | Sigma | G7528 | |
| 2,3-butandione-monoxima (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurina | Sigma | T-0625 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenasi B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenasi D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Proteasi XIV | Sigma | P-5147 | |
| Eparina | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO - anidro | Sigma 276855 | ||
| Sistema di stimolazione cellulare e analisi fluorescente IonOptix | IonOptix | ||
| 250 μ m filtro a rete in nylon | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Adattatore Luer-stub | Becton Dickinson | 1482619E | |
| Tubo PE-50 | Becton Dickinson | 427410 |
Riferimenti
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
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Ristampe e permessi
