Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.
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Articolo metodologico
Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cardiomiociti, la cellula cavallo di battaglia del cuore, contengono elementi citoscheletrici e contrattili squisitamente organizzati che generano la forza contrattile utilizzata per pompare il sangue. I singoli cardiomiociti sono stati isolati per la prima volta oltre 40 anni fa al fine di studiare meglio la fisiologia e la struttura del muscolo cardiaco. Le tecniche sono rapidamente migliorate per includere la digestione enzimatica tramite perfusione coronarica. Più recentemente, l'analisi della contrattilità e del flusso di calcio dei miociti isolati ha fornito uno strumento vitale nell'analisi cellulare e subcellulare dell'insufficienza cardiaca. L'ecocardiografia e l'ECG forniscono informazioni sul cuore solo a livello di organo. Esistono sistemi di coltura cellulare di cardiomiociti, ma le cellule mancano di strutture fisiologicamente essenziali come i sarcomeri organizzati e i tubuli T necessari per la funzione dei miociti all'interno del cuore. Nel protocollo qui presentato, i cardiomiociti vengono isolati tramite perfusione di Langendorff. Il cuore viene rimosso dal topo, montato attraverso l'aorta su una cannula, perfuso con enzimi della digestione e le cellule vengono introdotte per aumentare le concentrazioni di calcio. Il software di rilevamento dei bordi e dei sarcomeri viene utilizzato per analizzare la contrattilità e un colorante fluorescente legante il calcio viene utilizzato per visualizzare i transitori di calcio dei cardiomiociti stimolati elettricamente; Aumentare la comprensione del ruolo che i cambiamenti cellulari svolgono nella disfunzione cardiaca. Tradizionalmente utilizzato per testare gli effetti dei farmaci sui cardiomiociti, impieghiamo questo sistema per confrontare i miociti di topi WT e topi con una mutazione che causa cardiomiopatia dilatativa. Questo protocollo è unico nel suo confronto di cellule vive di topi con funzione cardiaca nota e genetica nota. Molte condizioni sperimentali vengono confrontate in modo affidabile, tra cui la manipolazione genetica o ambientale, l'infezione, il trattamento farmacologico e altro ancora. Oltre ai dati fisiologici, i cardiomiociti isolati sono facilmente fissati e colorati per gli elementi del citoscheletro. L'isolamento dei cardiomiociti tramite perfusione è un metodo estremamente versatile, utile nello studio dei cambiamenti cellulari che accompagnano o portano all'insufficienza cardiaca in una varietà di condizioni sperimentali.
Introduzione
I cardiomiociti forniscono la forza contrattile per il cuore. Ogni miocita contiene elementi citoscheletrici e contrattili organizzati essenziali per la contrazione. Il cuore non contiene solo cardiomiociti, ma anche fibroblasti, tessuto connettivo e miociti modificati come le fibre di Purkinje. Cambiamenti in uno o tutti questi tipi di cellule possono essere osservati nell'insufficienza cardiaca, rendendo difficile determinare la causa ultima della disfunzione cardiaca. La diminuzione della contrattilità ventricolare di un cuore in insufficienza cardiaca è preceduta da vari gradi di accumulo di tessuto fibroso, ipertrofia e disfunzione dei cardiomiociti1. Le aritmie possono essere causate da disfunzione nelle cellule conduttrici2, fibrosi che interrompe la conduzione cardiaca3 o cambiamenti nell'espressione dei canali ionici nei cardiomiociti1,4. In effetti, questi problemi spesso coesistono in modo complicato.
L'isolamento e lo studio dei cardiomiociti consentono di esaminare la disfunzione contrattile ed elettrica dei singoli miociti nel contesto della funzione cardiaca complessiva. Le tecniche per isolare i singoli miociti cardiaci sono state sviluppate oltre 40 anni fa nel tentativo di studiare meglio la fisiologia di questa cellula "cavallo di battaglia" del cuore. Le tecniche di isolamento sono state migliorate per aumentare la resa e la qualità delle cellule, con lo sviluppo vitale della perfusione coronarica attraverso l'incannulamento dell'aorta, eseguito per la prima volta nel 19705. Questo articolo descrive l'isolamento dei cardiomiociti seguito dalla misurazione della contrattilità e dei transienti di calcio utilizzando la fluorescenza raziometrica e il software di acquisizione dati di dimensionamento cellulare. Sia nei modelli genetici che ambientali delle malattie cardiache, l'utilizzo di questo protocollo fornisce informazioni chiave sulla contrattilità cellulare, la contrattilità sarcomerica e il rilassamento, i transitori del calcio e l'interruzione del citoscheletro. Questo sistema viene spesso utilizzato per testare l'effetto dei farmaci sui cardiomiociti isolati6,7. Utilizziamo il sistema per confrontare la contrattilità e i transitori del calcio dei cardiomiociti tra topi wild type e topi con una mutazione che porta a cardiomiopatia dilatativa.
Studiare i singoli miociti cardiaci ha numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi comunemente usati per studiare l'anatomia e la fisiologia cardiaca. L'ecocardiografia e l'elettrocardiografia forniscono informazioni sulla funzione contrattile e sulla conduzione elettrica del cuore in generale. Nessuno di questi metodi spiega la causa o la natura della disfunzione al di sotto del livello dell'intero organo. La misurazione della contrattilità dei singoli cardiomiociti utilizzando algoritmi di rilevamento dei bordi e di lunghezza del sarcomero può dimostrare che i cambiamenti all'interno della cellula contrattile del cuore sono presenti all'interno della disfunzione cardiaca globale. La misurazione dei transitori del calcio dimostra l'influenza dei cambiamenti nel flusso ionico a livello cellulare sulla disfunzione contrattile o sulle aritmie.
Oltre a integrare gli studi sull'intero organo, questo protocollo fornisce cellule facilmente colorabili per i componenti subcellulari. È possibile vedere i cambiamenti del citoscheletro colorando sezioni di tessuto dell'intero cuore; Tuttavia, si è in grado di visualizzare solo una sezione trasversale di cellule. Un cardiomiocita intero è più spesso della tipica sezione di tessuto e, data la disposizione e la lunghezza dei cardiomiociti, è difficile vedere cellule intere in una singola sezione. I cardiomiociti isolati possono essere fissati immediatamente e colorati per una varietà di elementi citoscheletrici e canali ionici. Le immagini confocali possono essere compilate in z-stack a tutto spessore della cella. Inoltre, la colorazione dei miociti cardiaci isolati consente la colorazione di componenti impossibili da visualizzare in sezioni, come le invaginazioni di membrana note come tubuli t.
Esistono linee cellulari coltivate di miociti cardiaci, alcune delle quali hanno profili trascrizionali e caratteristiche fenotipiche simili ai miociti cardiaci. Alcune, come la linea cellulare HL-1, conservano persino una certa organizzazione sarcomerica e una rudimentale capacità contrattile8. Nonostante queste qualità, le cellule in coltura mancano della forma a "scatola di car" e della struttura del tubulo t dei cardiomiociti e hanno una minore organizzazione sarcomerica. Questi componenti sono essenziali per la funzione dei cardiomiociti in vivo. Inoltre, l'utilizzo di cellule in coltura consente la manipolazione genetica ma non la manipolazione fisiologica in vivo. I cardiomiociti isolati mantengono la loro organizzazione cellulare abbastanza a lungo da poter essere studiati, ma sono ancora facilmente riproducibili e persino trasdotti9.
I cardiomiociti isolati sono estremamente versatili, fornendo un substrato per analizzare in modo identico le cellule provenienti da varie condizioni sperimentali. L'isolamento e l'analisi fisiologica dei miociti sono stati utilizzati da innumerevoli laboratori per una varietà di esperimenti, tra cui lo studio dell'effetto di farmaci6,7 o piccole molecole10, fattori di stress ambientale11, infezioni12, malattie13 o mutazioni genetiche14,15 sulla contrattilità e/o sui transitori del calcio e lo studio della regolazione della contrattilità e del rilascio di calcio all'interno di un cardiomiocita15-17. Con l'applicazione di uno qualsiasi di questi fattori di stress, i cambiamenti nella funzione cardiaca potrebbero essere dovuti a qualsiasi combinazione di cambiamenti nei cardiomiociti stessi e cambiamenti nell'ambiente circostante del cuore, come cicatrici, cambiamenti nella conduttività o cambiamenti nella matrice extracellulare. Questo è un protocollo ideale per rispondere a domande di ricerca riguardanti la struttura e la funzione dei singoli miociti nel contesto dell'insufficienza cardiaca per qualsiasi causa.
Sebbene abbia innumerevoli vantaggi rispetto ad altre tecniche, l'analisi fisiologica dei cardiomiociti isolati non è l'ideale per tutte le domande di ricerca. L'isolamento è una procedura terminale, quindi i cardiomiociti possono essere valutati solo in una volta nella vita del topo. Questo può essere parzialmente superato utilizzando coorti e sacrificando singoli topi lungo il corso dello sviluppo della malattia o monitorando il topo per determinare se ha un'insufficienza cardiaca clinicamente significativa prima dell'isolamento. Sebbene questo protocollo possa determinare se si è verificata una disfunzione dei cardiomiociti, non si può trarre la conclusione che questa disfunzione sia la causa principale dell'insufficienza cardiaca senza ulteriori informazioni sperimentali. È possibile che la stessa disfunzione dei cardiomiociti sia secondaria ad altri cambiamenti nel cuore. Nonostante queste sfide, lo studio dei cardiomiociti offre informazioni preziose per determinare la natura della disfunzione nel cuore, soprattutto se combinato con altri esperimenti.
Il seguente protocollo è adattato da quello fornito dal Dr. Chee Lim, Vanderbilt University. Sebbene i dati sulla contrattilità e sul flusso di calcio siano altamente riproducibili e utili nel confrontare i cuori con la manipolazione genetica o ambientale, l'isolamento stesso rimane un protocollo dipendente dalla tecnica, che richiede un'ottimizzazione. Ridurre al minimo il tempo che intercorre tra la rimozione del cuore dal topo e la perfusione del cuore tramite incannulamento aortico è essenziale per una digestione di qualità. Inoltre, il tempo di digestione e la concentrazione degli enzimi possono essere ottimizzati per ottenere miociti di altissima qualità. Di seguito sono riportati i passaggi che probabilmente richiedono l'ottimizzazione, insieme ai suggerimenti per l'ottimizzazione.
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Protocollo
Assicurarsi che tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono approvati con l'uso appropriato degli animali e la cura del corpo.
1 Preparare buffer di archivio in anticipo
- Preparare 2 L stock Ca 2 + libero di Tyrode (Tabella 1). Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
- Preparare 2 L stock di 1.2 mM Ca 2 + Tyrode (Tabella 2). Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
2 Sul giorno dell'esperimento, preparare perfusione, trasferimento, e digestione Buffer
- Preparare il tampone di perfusione 150 ml di Ca 2 + libero di Tyrode (Tabella 3) e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron.
- Preparare 35 ml di Ca 2 + trasferimento gratuito "Buffer A" (Tabella 4) e 25 ml di Ca 2 + contenente "Buffer B" (Tabella 5). Filtrare ciascuno attraverso un filtro da 0,2 micron.
- Preparare soluzioni di 0.06, 0.24, 0.6, e 1.2 mM Ca 2 + mescolando tampone A e B per ogni tabella 6.
- Preparare tampone di digestione 25 ml sciogliendo enzimi digestivi in 25 ml di tampone di perfusione (Tabella 7) sulla base del peso corporeo (BW) del mouse. Filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron prima dell'uso.
3 setup sperimentale
- Assemblare un apparato Langendorff flusso costante, disponibile in commercio o utilizzando una pompa peristaltica, tubi, e una batteria di scambio termico per consentire un flusso di 3 ml / min di perfusato riscaldato a 37 ° C. Un semplice schema è previsto nel 2011 recensione di Bell, et al 18.
- Impostare circolante temperatura del bagno d'acqua (~ 47 ° C) dell'apparato Langendorff cosicché deflusso dalla cannula è a 37 ° C ad una velocità di flusso di 3 ml / min.
- Eseguire il 70% di etanolo attraverso il sistema di perfusione per 15 minuti, seguita da 100 ml di acqua ultrapura di tipo I. Buffer di perfusione Corri attraverso il system per 5 min, eliminando le bolle d'aria.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con un metodo desiderato.
- Crea cannula allegando un breve pezzo (circa 3 mm) di PE-50 tubo alla punta di un adattatore Luer-stub 23 G. Punta di calore dei tubi per creare un labbro sul quale l'aorta sarà posizionato.
4. Cardiomyocyte Isolamento
- Iniettare mouse con 0,2 ml di soluzione di eparina (1.000 UI / ml), mediante iniezione intraperitoneale.
- Dopo 5 minuti, anestetizzare mouse con isofluorane. Quando è completamente anestetizzato (nessuna risposta al forte pizzico piedi), spruzzare il petto con il 70% EtOH. Aprite la cassa, asportare rapidamente il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l'aorta, e posto a 4 ° C buffer di perfusione. Utilizzare pinze curve di afferrare e sollevare sotto il cuore. Questo crea lo spazio per tagliare gli allegati dietro il cuore con le forbici sottili.
- Cannulate cuore afferrando delicatamente il bordo della aorta con due coppie di pinze sottili e tirando con attenzione la opening dell'aorta sopra il labbro della cannula. Assicurarsi che la punta della cannula non è oltre la valvola aortica e nel ventricolo, perché impedirebbe perfusione del cuore attraverso le arterie coronarie.
- Fissare l'aorta alla cannula legando un cappio di sutura di seta 5-0 intorno all'aorta immediatamente sopra il labbro della cannula.
- Nota: I passaggi 4.2 con 4.4 dovrebbe essere completata il più rapidamente possibile per la digestione migliore qualità.
- Nota: Il cuore può essere appeso direttamente sulla cannula già attaccato al Apparato Langendorff con fluente buffer di perfusione. Tuttavia, appeso il cuore su una cannula collegata ad una piccola siringa di buffer di perfusione al microscopio dissezione è stato trovato per essere di maggior successo. Questo permette una piccola quantità di buffer di perfusione deve essere spinto attraverso, guardando per la compensazione delle arterie coronarie e garantendo il cuore è attaccato saldamente alla cannula. La cannula viene poi appeso alla Langendorff con tampone di corsa perfusione.
- Perfuseil cuore con Ca 2 + buffer di perfusione libero a un flusso di 3 ml / min per 2-3 minuti.
- Passare al buffer di digestione enzimatica e profumato per 7-10 minuti, il cuore diventerà più morbida e di colore più chiaro.
- Nota: tempo di digestione può essere regolata in base alle attività enzimatica e la dimensione del cuore.
- Una volta che il cuore è palpabile flaccido, rimuovere il cuore dalla cannula e mettere in un piatto p60 sterile con tampone A (Ca 2 + buffer di trasferimento gratuito).
- Rimuovere atri e dei grossi vasi. Rimuovere ventricolo destro se lo si desidera. Con pinze, separare il ventricolo in piccoli pezzi. Pipettare più volte con una sterile 5 ml trasferimento pipetta per disperdere ulteriormente le cellule.
- Filtrare la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml attraverso un filtro a rete di nylon da 250 micron.
- Lasciare che la sospensione a pellet per circa 10 min.
- Trasferire il pellet nella soluzione 0,06 mM Ca 2 +. Consentono alle cellule di pellet per 10 min. Le cellule sane saranno pellet, mentre la maggior parte delle cellule morte galleggia.
- Aspirare il surnatante e trasferire il pellet al Ca 2 + 0,24 mM soluzione.
- Ripetere 10 min di incubazione, aspirazione, e trasferire attraverso i restanti due Ca 2 + soluzioni fino a quando le cellule sono nella soluzione 1.2 mM. A questo punto, la maggioranza delle cellule dovrebbe essere miociti forma di bastoncello.
5. misura contrattilità e calcio Transients
- Nota: Sia la contrattilità e transienti di calcio possono essere misurate simultaneamente.
- Preparare Fura-2 AM soluzione risospendendo in DMSO anidro ad una concentrazione di 1 mg / mL. Soluzione Fura-2 AM può essere immagazzinato in un essiccatore a -20 ° C.
- Carico 1 ml di cellule in sospensione con 1 ml Fura-2 del mattino. Consentono alle cellule di sedersi nel buio 10 min poi aspirare il surnatante. Lavare due volte con la soluzione di Ca 2 + Tyrode, permettendo alle cellule di pellet al buio per 10 minuti tra un lavaggio.
- Posizionare un coprioggetto di vetro in un inserto fase che permette pe riscaldatarfusion / aspirazione ed elettrodo di stimolazione con uno stimolatore campo miociti. Luogo inserto sul palco microscopio invertito istituito per la misurazione della fluorescenza, aggiungendo una goccia di olio di lente se si utilizza un obiettivo ad immersione in olio.
- Impostare perfusione gravità riscaldata con soluzione 1,2 mM Ca 2 + Tyrode così soluzione sul palco raggiunge i 37 ° C. Fissare l'aspirazione a vuoto. Attaccare gli elettrodi.
- Accendere il sistema microscopio, e aprire la fluorescenza e di acquisizione dati dimensionamento delle cellule software raziometrico.
- Aggiungere qualche goccia di cellule caricate Fura-02:00 all'inserto fase, bloccando perfusione momentaneamente per consentire le cellule sane a stabilirsi.
- Utilizzare obiettivo 40X per individuare cella desiderata. Una cellula sana dovrebbe essere cilindriche e non spontaneamente contraente. Dovrebbe visibilmente e contratto uniforme quando la cella viene stimolato a 5-20 V.
- Nota: Analisi fisiologica richiede una digestione di alta qualità. E 'possibile avere le cellule che sembrano in buona salute, ma non lo fanno pa Ce bene per l'analisi fisiologica. Protocollo di digestione può richiedere raffinatezza per ottenere alta qualità, miociti sani. Inoltre, cuori mutanti o malati possono richiedere modifiche al protocollo.
- Regolare la rotazione della lente e il cambiamento di apertura così cella desiderata è allineata orizzontalmente sullo schermo e lo sfondo non è visibile.
- Allineare barre di rilevamento bordo a ciascuna estremità di miociti e regolare la soglia. Allineate rilevamento sarcomere su una porzione di cella con sarcomeri uniformi. Più a lungo si può fare questo bar, il più accurato il modello matematico di lunghezza sarcomero sarà, fintanto che non è su due popolazioni di sarcomeri.
- Cellule Pace a 2 Hz e 5-20 V per 10-15 secondi prima della registrazione.
- Record tracciato. La luce ambiente deve essere ridotta al minimo per la migliore registrazione di calcio transitori.
6 Analisi
- Analizzare le tracce utilizzando la fluorescenza raziometrico e software di acquisizione dati dimensionamento delle cellule.
- Questo protocollo fornisce le cellule in eccesso che possono essere utilizzati per una varietà di altri esperimenti, tra cui: fissazione e immunostaining, valutando gli effetti diretti della droga, la cultura a breve termine, e la microscopia a forza atomica.
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Risultati
Una volta che la contrattilità e tracciati transitori vengono raccolti (Figura 2), i dati possono essere facilmente analizzati con il software appropriato. L'intero tracciato, o parti di essi possono essere mediate (Figura 3). Contrattilità può essere analizzato in una varietà di modi. Per la funzione sistolica, si può valutare l'ampiezza della contrazione con accorciamento frazionale, o la velocità di contrazione con il tempo al picco accorciando, e la velocità di contrazione. ...
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Discussione
Isolamento di cardiomiociti di qualità richiede un certo livello di pratica e di ottimizzazione. Questo protocollo contiene passaggi chiave che possono influenzare notevolmente il risultato della digestione. Questi dovrebbero essere considerate attentamente quando si esegue la risoluzione dei problemi e il protocollo. Il tempo dalla rimozione del cuore di cannulazione e perfusione deve essere ridotto al minimo, idealmente meno di cinque minuti. Sciacquare immediatamente il cuore in tampone di perfusione ghiacciato dopo ...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Marc Wozniak per l'utilizzo del Dipartimento di Cell e Developmental Biology attrezzature videografia.
Vanderbilt University cellulare Imaging risorsa condivisa.
Questo lavoro è supportato da AHA concessione 12PRE10950005 di ERP, AHA concessione 11GRNT7690040 a DMB, NIH concedere R01 HL037675 a DMB. DMB è il presidente Gladys P. Stahlman di Ricerca Cardiovascolare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-glucosio | Sigma | G7528 | |
| 2,3-butandione-monoxima (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurina | Sigma | T-0625 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenasi B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenasi D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Proteasi XIV | Sigma | P-5147 | |
| Eparina | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO - anidro | Sigma 276855 | ||
| Sistema di stimolazione cellulare e analisi fluorescente IonOptix | IonOptix | ||
| 250 μ m filtro a rete in nylon | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Adattatore Luer-stub | Becton Dickinson | 1482619E | |
| Tubo PE-50 | Becton Dickinson | 427410 |
Riferimenti
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