La microscopia intravitale può essere utilizzata negli animali per visualizzare e misurare i diametri vascolari della retina, la velocità del flusso sanguigno e il flusso sanguigno retinico totale.
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Articolo metodologico
Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le alterazioni del flusso sanguigno retinico possono contribuire a, o essere una conseguenza di, malattie oculari e disfunzioni visive. Pertanto, la quantificazione della perfusione alterata può aiutare la ricerca sui meccanismi delle patologie retiniche. La microscopia video intravitale di traccianti fluorescenti può essere utilizzata per misurare i diametri vascolari e le velocità del flusso sanguigno del sistema vascolare retinico, in particolare le arteriole che si diramano dall'arteria centrale della retina e delle venule che portano alla vena centrale della retina. Le velocità del flusso sanguigno possono essere calcolate dai diametri e dalle velocità, con la somma del flusso arteriolare e del flusso venulare separato, fornendo i valori del flusso sanguigno retinico totale. Questo articolo e il video associato descrivono i metodi per applicare questa tecnica ai topi, che include 1) la preparazione dell'occhio per la microscopia intravitale dell'animale anestetizzato, 2) l'infusione endovenosa di microsfere fluorescenti per misurare la velocità del flusso sanguigno, 3) l'infusione endovenosa di un destrano fluorescente ad alto peso molecolare, per aiutare la visualizzazione microscopica della microvascolarizzazione retinica, 4) l'uso di una fotocamera digitale per microscopio per ottenere video della retina perfusa, e 5) l'uso di software di elaborazione delle immagini per analizzare il video. Le stesse tecniche possono essere utilizzate per misurare la velocità del flusso sanguigno retinico nei ratti.
Introduzione
La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi del corpo, e di conseguenza richiede un generoso apporto di sangue. Due circolazioni separate soddisfano questa richiesta: la circolazione coroideale per la porzione esterna della retina e la circolazione retinica per la porzione interna della retina. Le indagini sulla perfusione retinica sono indispensabili per comprendere i meccanismi patologici e le conseguenze della retinopatia diabetica, della retinopatia indotta da ossigeno, dell'occlusione dell'arteria o della vena retinica e dell'ictus. Sono stati impiegati diversi metodi per quantificare il flusso sanguigno retinico, ognuno dei quali presenta vantaggi, sv....
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Protocollo
Le procedure che coinvolgono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali di LSUHSC-S ed eseguite secondo i criteri delineati dal National Institutes of Health.
1. Preparazione delle Soluzioni di Perfusione
- Sonicare una soluzione madre all'1% (in peso) di microsfere di diametro 1,9 μm.
- Prelevare ~25-30 x 106 microsfere fluorescenti verdi (cioè ~10 μl della soluzione madre) in una siringa da 300 μl. Diluire le microsfere prelevando altri 240 μl di soluzione fisiologica nella siringa.
- Preparare una soluzione da 50 μl di destrano fluore....
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Risultati
Figura 1 mostra singoli fotogrammi di un video proveniente da un esperimento, con i pannelli da A a D e da F a I che mostrano tracce di microsfere fluorescenti acquisite con un obiettivo 4X e un tempo di esposizione di 8 msec (e binnaggio 2 x 2 pixel per ridurre le dimensioni del file video). Figura 1E mostra l'orientamento dei vasi retinici negli altri pannelli della figura. Non ogni fotogramma del video presenterà una traccia fluorescente a fuoco; tuttavia, alcuni fotogrammi .......
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Discussione
Questa tecnica di microscopia video intravitale può essere applicata non solo ai topi, ma anche ai ratti. Questo protocollo si basa solo su alcune ipotesi, ma è limitato all'uso in anestesia e con dilatazione della pupilla come lo abbiamo descritto. Le altre ipotesi e limitazioni sono le seguenti:
1. Assunzione di un errore minimo di ingrandimento ottico derivante dalla natura rifrattiva dell'occhio. Come descritto da altri18-20, il metodo di riempire lo spazio tra l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Finanziato da NIH EY017599 (NRH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microsfere fluorescenti Bangs | Laboratories | FS04F/10584 (verde) | |
| Sonde molecolari | fluorescenti destrano ad alto peso molecolare | D-7137 (verde); D-7139 (rosso) | |
| Sistema di microscopio | Nikon | Eclipse E600FN + accessori | |
| Obiettivo 4X | Nikon | Plan Fluor 4X | apertura numerica 0,13; distanza di lavoro 17,2 mm |
| Obiettivo 10X | Nikon | Plan 10X | apertura numerica 0,25; distanza di lavoro 10,5 mm |
| Soluzione oftalmica Tropicamide | Bausch Lomb | 1% Tropicamide | |
| Soluzione oftalmica ipromellosa | HUB Pharmaceuticals | 2,5% Goniovisc | |
| Software di elaborazione delle immagini | Università della California San Francisco Vale Lab | Micro-Manager | |
| Videocamera digitale per microscopia | Fotometria | CoolSnap ES | Risoluzione 1392 x 1040 pixel; dimensione dei pixel 6,45 x 6,45 μ m |
Riferimenti
- Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization. Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).
- Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A.
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Ristampe e permessi
