Raccolta e analisi dei Arabidopsis Floema Essudati Utilizzo del metodo EDTA-agevolata

Piante non possono muoversi per sfuggire condizioni avverse. Di conseguenza, hanno dovuto sviluppare meccanismi per rilevare stress ambientali, suscitare e trasmettere un segnale correlato in tutta la pianta, e di regolare di conseguenza lo sviluppo. Esistono due sistemi di trasporto per la distribuzione di acqua, i nutrienti e altri composti (segnalamento). Il primo è lo xilema; quali trasporta tipicamente acqua e sali minerali assorbiti dalle radici tutto l'impianto. Il secondo è il floema. La vista del floema è cambiata da un semplice sistema di trasporto assimilare ad un condotto per l'RNA, proteine, virus, lipidi e altre piccole molecole. Esso gioca un ruolo importante nel assimilare e trasporto di nutrienti, risposta allo stress biotico e abiotico, così come in crescita e sviluppo delle piante. Si è ora chiamato il "autostrade dell'informazione" della pianta ^18.

Floema è composto da diversi tipi di cellule: floema parenchima, nonché compagna specializzato ceLLS ed elementi di Sieve. L'elemento setaccio è il sito di movimento a lunga distanza. Per consentire il flusso longitudinale ostruito, elementi forati mancano maggior organelli nonché nuclei e si pensa di contenere al massimo un macchinario traduzionale limitata ^{21, 33.} Si ritiene che le cellule compagno sintetizzare le proteine ​​e altri composti, che viaggiano nel flusso floema. Questi composti vengono poi trasportati nell'elemento setaccio attraverso plasmodesmata e può funzionare come segnali lunga distanza ^4,16.

Diversi gruppi di composti possono essere trovati in floema essudati:

• Zuccheri sono spesso i prodotti di fotosintesi e vengono trasportati come "energetici che trasportano" molecole ad altre parti della pianta di stoccaggio o come blocchi di costruzione. Tuttavia, possono anche funzionare come antigelo o come composti di segnalazione.
• Le proteine ​​possono anche essere trovati in floema essudati. Essi includono gli enzimi metabolici, ma anche hanno funzione di segnalazione. Uno example di una proteina che serve come segnale di sviluppo è la fioritura locus T proteina, che segnala l'induzione della fioritura nonché abscission foglia stagionali nelle piante. ⁶
• Gli acidi nucleici sono presenti in essudati floema in forma di mRNA, piccole e micro RNA e RNA virali. Essi sembrano essere in gran parte coinvolti nella segnalazione ^{27, 28, 39.} Allo stesso tempo, rRNA e tRNA per quasi tutti gli amminoacidi sono stati osservati nel floema delle cucurbitacee ^42. Essi appaiono da trasferire selettivamente nel sistema tubo setaccio. I tRNA mostrano modifiche necessarie per la capacità di trasferire gli amminoacidi all'apparato traduzionale. Eppure, invece di partecipare alle traduzioni, sembrano inibire questo processo. In alternativa, potrebbero servire come fonte di citochinine o segnalare lo stato metabolico della pianta ^42.
• Acidi grassi, oxylipins e altri lipidi sono stati trovati anche nel floema essudati ^{3, 13, 14, 23.} Jasmoacido nic, un oxylipin muove attraverso il floema come parte della risposta alle infezioni patogeno ^{22, 29, 31, 32.} Mentre il ruolo della maggior parte dei lipidi floema è ancora chiaro, alcuni di loro probabilmente hanno la funzione ⁴ segnalazione.

La sfida nel lavorare con floema impianto risiede nella sua capacità di sigillare su di sé ferimento. Ci sono quattro metodi principali utilizzati per raccogliere floema essudati, eppure essi funzionano solo in alcune specie:

1) In cucurbitacee è possibile ottenere quantità ragionevole di floema essudato attraverso tagli del picciolo. Una volta che la goccia iniziale con contaminazione delle cellule danneggiate viene rimosso, è possibile avere ragionevolmente grandi quantità di pura floema ^{1, 15.} Tuttavia, con l'aumento del tempo di raccolta, questo essudato addensa, rendendo sempre più inadatto per approcci di cromatografia liquida (non pubblicato). Pubblicazioni recenti suggeriscono, che a seconda della specie, tale floema è derivato da either il fascicolare (FP) o il extrafascicular floema (EP) e che, mentre lo fa contenere "mobile" floema linfa dagli elementi Sieve (FP), è anche incline alla contaminazione da altri tipi di cellule, tra cui lo xilema ^{40, 41} .

2) Un secondo approccio è quello di ottenere floema linfa attraverso tagli poco profondi o forature a gambo o picciolo. Questo metodo è stato utilizzato con successo in lupino ^{17, 25, 36} cucurbitacee, e Brassica napus ^12. Qui la contaminazione da cellule danneggiate è minimo e il essudati molto puro. Tuttavia, le piante hanno bisogno per essere sani e ben irrigata dal momento che è molto difficile da perforare selettivamente solo gli elementi setaccio. Se vasi dello xilema sono intaccate tutti essudato viene disegnato nel flusso xilema. Ciò rende il metodo adatto per impianti con piccioli o gambi molto fragili o fortemente lignificato.

3) Afide stylectomy afidi permette di inserire il loro stiletto negli elementi setaccio l'n rimuovendo l'afide con un laser. Floema è trasudava attraverso il rimanente mandrino ^{2, 9, 10, 35, 38.} In teoria, ogni pianta che può essere infettata da afidi può essere utilizzato per questo approccio. Tuttavia, la maggior serra o gestori di camera di crescita non supportano l'uso di un agente patogeno. Inoltre, afidi introducono diverse proteine ​​nel floema con la loro saliva ^{19, 33.} Questo porta ad una limitata trascrizionale riprogrammazione ³⁰ e ha il potenziale per cambiare la composizione floema ^26.

4) Il metodo descritto qui è l'essudazione EDTA-agevolata del floema. Questo metodo impiega EDTA per impedire tenuta del floema ^20. EDTA chela Ca ^{2 +} ioni che altrimenti partecipare ai processi che sigillano il floema. Mentre EDTA può portare a danni delle cellule ^30, diversi gruppi hanno usato questo metodo e osservato alcun effetto negativo delle concentrazioni di EDTA da 10 mm a 20 mm sul ultrastruttura cellulare o su phloem di carico e di trasporto ^{5, 24.} Per ridurre qualsiasi effetto dannoso come pure le interferenze di EDTA con cromatografia e elettroforesi su gel, piante vengono spostati in acqua dopo 1 ora e solo la parte successiva del essudato viene utilizzato ^14. Così, invece di essudazione in EDTA, floema viene essudata in acqua (essudazione EDTA-agevolata). E 'un metodo straight-forward, a basso costo, e low-tech per la raccolta di floema essudati. Floema così ottenuto può essere utilizzato per analizzare le proteine, piccole molecole, lipidi, e RNA ed è stato usato con successo in molte piante. Mentre una quantità limitata di esperimenti è stata eseguita in monocotiledoni ^11, il metodo sembra essere più adatto per dicotiledoni (perilla ^{17, 20,} Arabidopsis ^{8, 13, 14,} pioppo ^7). Raccolta di essudati deve avvenire in un ambiente umido per evitare la perdita di essudati attraverso la traspirazione. Seconda della pianta, incubazione in EDTA per una o due ore èsufficiente a prevenire sigillatura degli elementi floema / setaccio. La raccolta può quindi verificarsi in acqua. Questo ha il vantaggio di evitare l'effetto negativo EDTA ha sulla struttura cellulare e stabilità. Inoltre elimina l'interferenza di EDTA con metodi quali HPLC o SDS-PAGE. È mostrato come si applica a Arabidopsis. Per impianti più grandi, l'incubazione in collezioni EDTA e essudato deve essere scalati e viene eseguita in bicchieri piuttosto che in 1,7 ml provette di reazione.

1. Preparazione delle piante

1. Semi di Arabidopsis possono essere germinati direttamente sul suolo o su piastre di MS. Far crescere le piante per quattro-sei settimane in camere di crescita con un fotoperiodo di 12 ore (22 ° C il giorno, 15 ° C notte ^14). Impianti di acqua una o due volte a settimana. Utilizzare il vassoio inferiore per annaffiare; Non piante di acqua dalla parte superiore, permettono ai cassetti di asciugare prima di ri-irrigazione. Assicurarsi che le piante sono ben idratato al momento della raccolta.

2. Preparazione di soluzioni e piatti

1. K-EDTA soluzione _2: Fare un mM K _2-EDTA soluzione madre 100 soluzione, che può essere conservato in frigorifero. Il giorno della raccolta, diluire la soluzione 1-5 (una soluzione di EDTA parte, quattro parti di acqua) per ottenere una soluzione di 20 mM K _2-EDTA.
2. Riempire un bicchiere o un piatto di Petri (diametro 7-15 cm) a metà strada con il 20 mm K soluzione _2-EDTA. Se la raccolta di campioni provenienti da diversi trattamenti (per esun controllo ed impianti di sale-stressate o diversi genotipi), preparano piatti separati per ogni trattamento.
3. Riempire il numero desiderato di 1,7 ml provette con 1,4 ml di 20 mM K soluzione _2-EDTA. Riempire un pari numero di provette di reazione con 1,4 ml di acqua deionizzata o sterilizzati in autoclave Millipore.
4. Mettere gli asciugamani di carta in panchina per impostare piante su; ottenere una nuova lama di rasoio e indossare i guanti.

3. Raccolta di Floema essudati (raffigurato nel diagramma di flusso in Figura 1)

1. Rosetta lascia raccolto da quattro a sei settimane di età piante vengono tagliate con la lama di rasoio alla base del picciolo vicino al centro della rosetta.
2. Porre immediatamente le foglie nei piatti contenenti 20 mM K _2-EDTA. Assicurarsi che l'estremità del taglio del picciolo è immerso nella soluzione (Figura 2).
3. Una volta 15 foglie sono stati raccolti (ca. 3-4 piante), impilare delicatamente foglie sopra l'altro tale tcappello piccioli il taglio siano allineati tra loro. Tagliare nuovamente la base dei piccioli (ca. 1 mm) e trasferire immediatamente le foglie in una delle provette di reazione con la soluzione di 20 mM K _2-EDTA. Le foglie in forma più semplice se sono leggermente arrotolate. Evitare di schiacciare le foglie in quanto ciò potrebbe provocare lesioni delle cellule e, quindi, porta alla raccolta del contenuto delle cellule foglia.
4. Se serve più materiale, coprire delicatamente i campioni con un tovagliolo di carta bagnato. Utilizzare un nuovo set di piatti, se per la raccolta di campioni da trattamenti o genotipi diversi.
5. Una volta che tutti i campioni sono posizionati in provette di reazione, raccogliere i essudati o al buio o alla luce.
6. Per la raccolta nel buio, linea il piano di un grande piatto fondo con tovaglioli di carta bagnati. Inserire la griglia con le provette di reazione foglia riempiti nel piatto e le copertine con i tovaglioli di carta bagnati o messi in un posteriore in plastica nera con feritoie per l'aerazione. Posizionare l'intera impostazione in un armadio o una stanza buia.
7. Per la raccolta nella luce, foderare il fondo di un contenitore in plexiglass trasparente con tovaglioli di carta bagnati. Inserire la griglia con le provette di reazione foglia riempiti nel contenitore e chiuderlo.
8. Dopo 1 ora, togliere le foglie delicatamente dal recipiente e le provette di reazione e lavare accuratamente con acqua distillata, deionizzata o Millipore per rimuovere tutti EDTA. Questo passaggio serve tre scopi: (1) rimuove l'EDTA al danno minimizzato alle cellule, (2) elimina l'interferenza di EDTA con SDS-PAGE e la cromatografia, e (3) rimuove eventuali residui che si sono accumulati da taglio / danneggiato cellule. Trasferire immediatamente nei tubi di reazione preparati contenenti acqua autoclavato e tornare ai contenitori per la raccolta umidificati per la raccolta di essudati. A questo punto, aggiungere RNasi inibitore se l'essudato deve essere utilizzato per l'estrazione di RNA. Optional: inibitore della proteinasi può essere aggiunto se si desidera l'analisi delle proteine.
9. Dopo il tempo di raccolta previsto, tirare fuori e DISCArd le foglie e congelare gli essudati floema a liquido N ₂ per un ulteriore uso. Se è necessario lo stoccaggio prolungato, liofilizzare i campioni e conservare a -80 ° C.
10. Nel caso di Arabidopsis, metaboliti possono già essere rilevati dopo la raccolta di essudati per 1 ora. Tuttavia, la raccolta per 5-8 ore è consigliabile se è prevista l'analisi di componenti meno abbondanti. Per le piante più grandi come Perilla, sono consigliati tempi di incasso più lunghi (8 ore).
    Essudato raccolto da 15 fogli è in genere sufficiente per una corsia su un gel SDS-PAGE (proteine), per l'estrazione di mRNA, GC-MS (zuccheri e metaboliti). Per l'analisi dei lipidi la messa in comune di 2-3 campioni (essudato 30-45 foglie) è raccomandato e porta a risultati più chiari.

4. Analisi successive (per video We Only Mostra 4,4)

1. Per l'analisi delle proteine, campione risospendere in 15 microlitri di acqua e 30 microlitri tampone Lämmli, riscaldare a 95 ° C per 5 min, girare rapidamente ogni precipitates e caricare tutto il campione su un gel SDS-PAGE (45 tasche carico microlitri). I campioni devono essere colorati con Coomassie colloidale o altre macchie sensibili in quanto l'abbondanza di proteine ​​è molto basso.
2. Per lo zucchero e piccola analisi metabolita, aggiungere agenti derivatizzazione al campione essiccato come descritto in letteratura ^14.
3. mRNA può essere analizzata mediante RT-PCR, microarray o l'analisi di RNA-Seq.
4. Per l'analisi dei lipidi immediatamente piscina 2-3 campioni e divisorie contro cloroformio: metanolo (1:1) nella cappa come segue: aggiungere una pari quantità di cloroformio: metanolo per ogni campione, vortex per qualche secondo, e centrifugare per 4 min a 400 x g. Raccogliere la (bio) di fase inferiore in un tubo di vetro con tappo in teflon e la partizione di ripetere con la fase superiore tre volte. Asciugare le fasi organiche riunite sotto un flusso di N _{2, presentando,} ad ulteriore analisi (cromatografia su strato sottile: TLC ^{14, 37;} cromatografia-spettrometria di massa liquida: LC-MS ^14).

E 'diventato chiaro negli ultimi anni che la complessità del floema linfa può essere la risposta alla domanda di come le piante inviano diversi segnali di sviluppo e di stress per una risposta ottimale. Utilizzando EDTA-agevolata floema essudazione può fornire l'opportunità di analizzare essudati floema da piante che non sono adatti per altri approcci, ma possono essere di interesse economico o fisiologico.

Questo metodo consente la raccolta del floema essudati abbastanza per identificare le proteine ​​floema-localizzate e rilevare cambiamenti nel loro livello in risposta a sviluppo o di stress (Figura 3). Come mostra la figura, le proteine ​​sono in abbondanza molto basso, tuttavia, il loro livello è abbastanza alto per i successivi esperimenti di proteomica mediante LC-MS/MS o per l'analisi Western Blot. Conclusioni di cucurbitacee suggeriscono che il taglio dello stelo porta ad una rottura dell'equilibrio potenziale dell'acqua e un successivo afflusso di acqua epossibili contaminanti dalla apoplasto 41. Ancora raccolta per tempi che vanno da uno a otto ore non influenza il profilo floema proteina / composizione in Arabidopsis (. Solo la quantità assoluta varia Guelette et al), la quantità di proteina raccolta e il pattern di proteine ​​trovate varia tra specie (Arabidopsis: A; Perilla, corsia I e NI) e trattamenti (Perilla coltivato a diverse lunghezze giorno, corsia I e NI). In qualità di segnali proteici risultato possono essere visualizzati, identificati e seguiti.

mRNA e micro RNA possono anche essere identificati in floema essudati da questo metodo. Tuttavia, il trattamento con inibitore di RNAsi è necessario per evitare la degradazione del mRNA durante il tempo prolungato essudazione. Poiché gli elementi setaccio non contengono cloroplasti funzionali, Rubisco piccolo o grande subunità (RBC o rbcL, rispettivamente) mRNA possono essere utilizzati come controlli negativi, mentre noto floema-MRNA localizzata enzima ubiquitina-conjugating può essere usato come controllo positivo (Figura 4).

Analogamente, zuccheri o piccoli metaboliti possono essere analizzati utilizzando GC-MS o LC-MS. Qui va detto che le essudati floema contengono un gran numero di enzimi funzionali, comprese quasi tutta via glicolitica 12. Quindi, utilizzando diversi punti di tempo può rivelare processi metabolici durante la raccolta essudato. Un esempio è mostrato in Figura 5: In tutti essudati, saccarosio è il metabolita più, questo è più evidente dopo una raccolta per 1 ora. Tuttavia, dopo cinque ore il saccarosio al rapporto fruttosio è leggermente ridotta. Se lo stesso essudato viene raccolto per un'ora e lasciato in panchina per le quattro ore successive, il saccarosio in fruttosio rapporto viene ridotto in misura molto più grande, suggerendo che gli enzimi attivi nel floema essudati portano ad un degrado di saccarosio a temtemperatura (per ulteriori interpretazioni di picco vedere 14). Ciò è coerente con i risultati che floema carico ed il trasporto di molecole da cellule compagne negli elementi setaccio possono continuare durante essudazione fino a quando il sistema perde la sua vitalità 34.

Lipidi nel essudati floema e, per estensione, la segnalazione di lipidi a lunga distanza sono una abbastanza recente campo di interesse in scienza delle piante. Grazie alla loro natura idrofobica dei lipidi sono presenti solo in basse concentrazioni e può essere collegato con altri molecole per solubilizzazione. Tuttavia, l'essudazione EDTA-facilitato consente la raccolta di materiale sufficiente per visualizzarne (TLC; Figura 6) e identificare (LC-MS; Figura 7) floema lipidi da diverse specie vegetali. Come mostra la figura, è possibile identificare e separare diverse specie lipidiche. LC-MS permette di identificare diverse specie di lipidi e per monitorare i cambiamenti nei profili lipidici di different genotipi o trattamenti. Questo permette lo studio del ruolo dei lipidi durante lo sviluppo della pianta e risposta allo stress.

Figura 1. Diagramma di flusso della collezione di floema essudati di Arabidopsis o Perilla. Diversi percorsi portano a prodotti finali diversi, che sono indicati in blu. Per la preparazione di RNA, RNase Inhibitor (100 U / ml, Roche) viene aggiunto l'acqua in cui si raccoglie l'essudato floema.
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Figura 2. Installazione di materiali per floema essudato raccogliereione. La configurazione visualizza tutti i materiali necessari per il protocollo passaggi 3,1-3,4.
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. Figura 3 proteine ​​trovate in floema essudati di due specie diverse di piante, di Arabidopsis (A) e Perilla (I e NI; lunghezze differenti al giorno); MW: marcatore di peso molecolare (corsia 2). Proteine ​​sono state separate usando un gradiente 10-20% SDS-PAGE.
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Figura 4. Analisidella presenza di mRNA per Rubisco piccola e grande subunità (RBC e rbcL, rispettivamente) e l'enzima ubiquitina-conjugating (UBC). mRNA è stato raccolto da foglie di Arabidopsis (L), piccioli (P), e floema essudati (Ph), invertire trascrizioni trascritte e specifici visualizzate mediante PCR. Il dato è stato modificato dalla Guelette et al. 14.
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Figura 5. Profilo GC-MS di floema essudati raccolte per diverse quantità di volte. Notare come la quantità relativa di saccarosio cambia da 1 ora di raccolta (A) per 5 ore di tempo di raccolta (B). Essudato profilo dopo la raccolta per 1 ora seguito da "incubazione" in camera temperatura (RT) per quattro ore (C). Foglia profilo dei metaboliti (D).
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Figura 6. Strato sottile cromatogramma confrontando i lipidi da Perilla (a sinistra) e di Arabidopsis (a destra), foglie ed essudati floema. Gli asterischi indicano i lipidi specifici per floema essudati. DGDG: digalattosildiacilglicerolo; PG: fosfatidilglicerolo; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; La parte della figura visualizzazione lipidi Arabidopsis è stato modificato da Guelette et al 14..
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