Method Article

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

DOI:

10.3791/51116

⸱

April 21st, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiomiociti da cuori malati sono sottoposti a processi di rimodellamento complessi che coinvolgono cambiamenti nella struttura cellulare, accoppiamento eccitazione contrazione e correnti ioniche di membrana. Tali modifiche sono suscettibili di essere responsabile per l'aumento del rischio aritmogena e le alterazioni contrattili che portano alla disfunzione sistolica e diastolica nei pazienti cardiopatici. Tuttavia, la maggior informazioni sulle alterazioni della funzione miociti nelle malattie cardiache proviene da modelli animali.

Qui descriviamo e validare un protocollo per isolare miociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a interventi di chirurgia cardiaca. Il protocollo è descritto in dettaglio. Misure elettrofisiologiche e calcio intracellulare sono segnalati per dimostrare la fattibilità di un numero di misurazioni singola cellula in cardiomiociti ventricolari umane ottenute con questo metodo.

Il protocollo ha riferito chere possono essere utili per le future ricerche di base cellulare e molecolare delle alterazioni funzionali del cuore umano in presenza di differenti malattie cardiache. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare nuovi bersagli terapeutici a livello cellulare e per testare l'efficacia di nuovi composti in cardiomiociti umani, con valore traslazionale diretta.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dissezione delle proprietà elettrofisiologiche del miocardio è progredita notevolmente dopo lo sviluppo di tecniche per l'isolamento singolo dei miociti cardiaci. Recenti progressi nella comprensione dei cardiaco eccitazione contrazione Coupling (CE-Coupling), sono stati resi possibili dalla capacità di isolare vitali singoli cardiomiociti che conservano tutte le proprietà fisiologiche del tessuto intatto. Metodi di patch clamp sono abitualmente impiegati per studiare la funzione e la modulazione farmacologica di correnti ioniche sarcolemma cardiaco. Registrazioni di dinamica del calcio intracellulare con Ca 2 + coloranti sensibili sono regolarmente....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I protocolli sperimentali su tessuti umani sono stati approvati dal comitato etico di Careggi University-Hospital (2006/0024713; rinnoverà maggio 2009). Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto.

1. Soluzioni agricole per la preparazione

Le soluzioni sono descritte nella Tabella 1. Un diagramma di flusso semplificato della procedura di isolamento cellulare è situato nella Figura 1.

Soluzione CP DB KB TB PS EB1 EB2
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo sopra descritto è stato impiegato per caratterizzare le alterazioni funzionali di cardiomiociti isolati dal setto interventricolare di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica (HCM) che hanno subito un'operazione miectomia, rispetto ai pazienti non in mancanza non ipertrofiche chirurgici 21. I risultati contenuti in questa sezione provengono da quel lavoro 21 e sono mostrati qui come un esempio di come questa tecnica può essere utilizzata per caratterizzare le alterazioni della funzione de.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo descritto e validato un metodo per isolare miociti vitali da campioni chirurgici di miocardio ventricolare umano. Partendo da protocolli precedentemente descritti che erano stati utilizzati con successo per cellule isolate da campioni chirurgici atriali, la tecnica per consentire la separazione dei miociti vitali singoli da malato miocardio ventricolare è stato sviluppato e perfezionato. I primi rapporti hanno mostrato che l'isolamento dei singoli cardiomiociti da pezzi di atriale e ventricolare tessuto sele.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dall'UE (STREP Progetto 241.577 "GRANDE CUORE," 7 ° Programma quadro europeo, CP), Menarini internazionale Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) e Gilead Sciences (AM).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Solfato di magnesio eptaidrato(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it& region=IT">H3375
AdenosineSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurinaSigma-AldrichT0625
Idrossido di potassio (KOH)Sigma-AldrichP5958
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Cloruro di potassio (KCl)Sigma-AldrichP9333
Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Bicarbonato di potassio (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
Piruvato di sodioSigma-AldrichP2256
2,3-Butanedione monoximeSigma-AldrichB0753
Idrossido di sodio(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-Acido glutammico sale monopotassico monoidratoSigma-Aldrich49601
Acido piruvicoSigma-Aldrich107360
3-Acido idrossibutirricoSigma-Aldrich166898
Adenosina 5′-trifosfato sale dipotassico diidrato (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
CreatinaSigma-AldrichC0780
Acido SuccinicoSigma-AldrichS3674
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N&primo;-acido tetraacetico (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumina da siero bovinoSigma-AldrichA0281
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo VSigma-AldrichC9263
Proteinasi, Batterico, Tipo XXIVSigma-AldrichP8038
Soluzione di cloruro di calcio, ~1 M in H2OSigma-Aldrich21115
Soluzione di cloruro di calcio 0,1 MSigma-Aldrich53704
Metanosolfonato di potassioSigma-Aldrich83000
Reagente FluoForteEnzo Life SciencesENZ-52015
Concentrato Powerload, 100XLife TechnologiesP10020
Sistema a passo rapido di perfusioneWarner InstrumentsVC-77SP
Amfotericina B solubilizzataSigma-AldrichA9528
Multiclamp 700B amplificatore patch-clampMolecular Devices
Digidata 1440AMolecular Devices
pClamp10.0 Il
dispositivo è realizzato su misura nel nostro laboratorio utilizzando tubi di plastica, Sylgard fuso e un motore; è descritto in dettaglio nella Figura 1C-1D e nella Figura 7. Possiamo fornire ulteriori dettagli se richiesto.
Elastomero siliconico per spazzole del dispositivo di digestioneDow CorningSYLGARD® 184
Motore rotante a velocità variabile per dispositivo di digestioneCrouzetCrouzet 178-4765
Stampo per colata spazzoleN.A.N.A.Lo stampo è realizzato su misura con aste standard in PTFE da 2,5 cm di diametro.
HEPES Sigma-Aldrich<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Iso....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Ventricular CardiomyocytesCardiomyocyte IsolationVentricular MyocardiumEnzymatic DigestionPatch Clamp RecordingAction Potential MeasurementCalcium Transient AnalysisCardioplegic SolutionStromal Vascular FractionCell Suspension

Related Articles