La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.
Articolo metodologico
Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ortotopici xenotrapianti cancro della vescica sono il gold standard per lo studio manipolazioni cellulari molecolari e di nuovi agenti terapeutici in vivo. Le linee cellulari adeguate sono inoculate mediante instillazione intravescicale (modello di crescita invasiva non muscolari) o iniezione intramurale nella parete vescicale (modello di crescita invasiva). Entrambe le procedure sono complesse e molto tempo. Inoltre, il modello superficiale ha i suoi difetti dovuti alla mancanza di linee cellulari che sono oncogeno seguente instillazione. Iniezione intramurale, d'altra parte, è viziata da l'invasività della procedura e la morbilità associata per il mouse ospitante.
Con queste carenze in mente, abbiamo modificato i metodi precedenti per sviluppare un approccio mini-invasivo per la creazione di ortotopici xenotrapianti cancro della vescica. Utilizzando guida ecografica abbiamo svolto con successo l'inoculazione percutanea delle linee di cellule di cancro alla vescica UM-UC1, UM-UC3 e UM-UC13 in 50 nude atimico. Siamo stati in grado di dimostrare che questo approccio è tempo efficiente, preciso e sicuro. Con questa tecnica, inizialmente uno spazio viene realizzato sotto la mucosa vescicale con PBS, e le cellule tumorali sono poi iniettato in questo spazio in una seconda fase. La crescita del tumore è monitorata ad intervalli regolari con bioluminescenza e gli ultrasuoni. I volumi medi di tumore sono aumentati costantemente in in tutti, ma uno dei nostri 50 topi durante il periodo di studio.
Nel nostro istituto, questo nuovo approccio, che permette di xenotrapianto cancro alla vescica inoculazione in modo minimamente invasivo, rapido ed estremamente preciso, ha sostituito il modello tradizionale.
Introduzione
La ricerca sul cancro dipende da modelli animali di cancro umano utilizzando linee cellulari derivate da tumori di pazienti, al fine di approfondire la nostra comprensione della biologia del tumore. Per l'analisi in vivo crescita sotto strategie di trattamento diversi modelli murini ortotopici cancro della vescica rimane lo standard di riferimento 1,2. L'inoculazione delle cellule tumorali della vescica umane in topi immunocompromessi (modello di xenotrapianto) si basa sulla instillazione intravescicale ("modello intravesical") 3,4,5 o iniezione diretta nella parete vescicale ("modello intramoenia") 6,7. Entrambe le tecniche possono essere condotti in ratti 8,9.
Instillazione intravescicale induce la formazione di tumori sulla superficie uroteliale della vescica che poi sono suscettibili di successiva instillazione intravescicale di agenti terapeutici innovativi. Tuttavia, il numero di linee cellulari che sono attendibilmente oncogeno quando distribuito mediante questo metodo è limitato und una di queste linee cellulari, KU7, è stato recentemente dimostrato di essere HeLa 4,10. Instillazione intravescicale è anche molto tempo a causa di tempi di sosta necessarie, e induce frequentemente la crescita tumorale in elementi adiacenti del tratto urinario, incluse uretra, uretere e pelvi renale 11. Inoltre, l'instillazione intravescicale spesso porta alla crescita del tumore sul pavimento della vescica in cui gli ureteri entrano nella vescica, e questo può causare ostruzione del tratto superiore ed insufficienza renale concomitante.
Xenotrapianti primarie carcinoma vescicale invasivo che sono adatti per trattamenti sistemici sono creati mediante iniezione diretta di cellule tumorali nella parete della vescica 12. Sebbene numerose linee cellulari crescono adeguatamente in questo modello, la sua limitazione è l'invasività del modello relativo alla necessità di un'incisione addominale 13. Il modello è anche difficile da imparare a causa della difficoltà tecnica di iniezione di cellule precisamente nella parete muscolaredella vescica.
Un nuovo approccio per stabilire ortotopici xenotrapianti tumorali della vescica invasivo primarie nei topi è stato sviluppato nel nostro reparto, al fine di affrontare le carenze esistenti del "modello intramurale". Siamo stati in grado di ottimizzare l'iniezione percutanea eco-guidata delle cellule tumorali della vescica nella parete vescicale anteriore, con conseguente questa nuova tecnica per sostituire con successo il modello invasiva stabilita. Inoltre abbiamo potenzialmente migliorato l'accuratezza e la riproducibilità del "modello intramurale".
Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Animal Care della University of British Columbia (Numero di protocollo: A10-0192).
1. Preparazione delle linee cellulari
- Confermare l'identità delle rispettive linee di cellule di cancro della vescica umana di DNA fingerprinting 7.
- Per l'analisi della crescita di tumori trapiantati da bioluminescenza, linee cellulari transfettate con un costrutto lentivirale trasportano il gene della luciferasi di lucciola 3.
- Scongelare ed espandere le linee cellulari esistenti in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con 10% di siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera. Passage le cellule almeno 3 volte, ma evitare i tempi di coltura superiore a 3 mesi.
2. Preparazione della sospensione cellulare
- Scongelare Matrigel. Mantenere la temperatura al di sotto4 ° C per evitare un aumento della viscosità del gel.
- Trypsinize le cellule ad una confluenza del 70% e sospendere in terreni di crescita normale.
- Contare il numero di cellule con un emocitometro o contatore di cellule automatico.
- Centrifugare la sospensione di cellule per 5 minuti a 200 x g. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere il volume appropriato di DMEM (10% FBS) e Matrigel (rapporto 1:1) per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata che dipende dalla linea cellulare utilizzata e cinetica di crescita desiderati (8-15 x 10 6 / ml). Il volume iniettato di sospensione cellulare tumorale sarà di 40 microlitri.
- Mescolare bene pipettando su e giù (P1000), evitare di creare bolle d'aria nella sospensione.
3. Preparazione degli animali
Nota: A causa della potenziale necessità di cateterizzazione transuretrale nella fase 4.7, topi di sesso femminile sono il genere preferito in questo modello animale.
- Mice House secondo gu istituzionale e la cura degli animali nazionaleidelines. Ottenere l'approvazione del comitato etico per tutti gli esperimenti che coinvolgono topi.
- Anestetizzare i topi con 3% miscela di isoflurano / ossigeno. Verificare il corretto anestesia degli animali (ad esempio mancata risposta a pizzichi punta).
4. Setup sperimentale
- Tagliare la stabilizzazione vescica da qualsiasi tipo di materiale plastico rigido piatta [Figura 2 I]. Ispezionare con cura la cinghia e rimuovere eventuali spigoli vivi prima applicazione per i topi.
- Montare l'animale sul tavolo di imaging riscaldata [Figura 1 I] della piccola piattaforma di imaging animale con monitoraggio continuo dei parametri vitali. Fissare gli arti inferiori con un elastico [Figura 1 III].
- Disinfettare l'addome con 2% clorexidina gluconato e pulire la pelle con una punta di cotone sterile.
- Immobilizzare la vescica con la cinghia di stabilizzazione vescica [Figura 2 II]. Così, un evasionedella vescica durante l'iniezione intramurale nel passaggio 5.6 sarà evitata.
- Applicare il gel per ultrasuoni sterile al basso ventre.
- Lentamente avvicinare la sonda ad ultrasuoni (frequenza 40 MHz) [Figura 1 IV] per la pelle (longitudinale con un angolo di 45-70 ° cranica) e visualizzare la vescica sullo schermo ultrasuoni [Figura 3 I].
- Se la vescica è vuota, riempirla con 50 ml sterile, calda salina tampone fosfato (PBS) attraverso un G angiocatheter transuretrale 24.
5. Separazione degli strati della parete della vescica
- Attaccare una siringa da 1,0 ml riempito con PBS e collegato ad un 30 G, ¾ in ago (smussatura rivolta anteriormente) al morsetto della siringa.
- Posizionare l'ago verso la pelle appena sopra l'osso pubico in un angolo di 30-45 ° (80-90 ° rispetto all'asse longitudinale la sonda ad ultrasuoni [Figura 1]).
- Rileva l'agosullo schermo ultrasuoni.
- Lentamente perforare la pelle ed i muscoli della parete addominale [Figura 3 II].
- Girare la smussatura dell'ago 180 ° (ora diretto posteriormente).
- Inserire la punta dell'ago nella parete della vescica senza penetrare la mucosa [Figura 3 III]
- Iniettare lentamente 50 ml di PBS tra lo strato muscolare e la mucosa al fine di creare uno spazio artificiale [Figura 3 IV].
Nota: Se la mucosa viene accidentalmente forata durante la fase 5.6, lentamente tirare indietro l'ago e iniettare 50 ml di PBS dopo strato mucoso ha capovolto di nuovo sulla punta dell'ago. - Ritirare l'ago.
6. Intramurale inoculazione delle cellule del cancro della vescica
- Attaccare una seconda siringa 1,0 ml (riempito con cellule tumorali sospese in Matrigel) con 30 G, ¾ in dell'ago al morsetto della siringa.
- Guida la punta dell'ago alla stessaSpazio PBS-riempita che è stato creato nel passo 5.7.
- Iniettare 40 ml di sospensione cellulare in questo spazio [figure 3 V e VI].
- Ritirare l'ago.
7. Post-interventistica terapia di supporto
- Smontare il mouse dalla piattaforma di imaging.
- Tenere l'animale in un ambiente caldo e confortevole sotto sorveglianza continua, mentre il recupero dall'anestesia.
- Dopo aver ripreso coscienza e riprendere la deambulazione normale, posizionare l'animale torna nella sua gabbia casa.
Risultati
Iniezione intramurale di tre diverse linee cellulari tumorali (UM-UC1 luc, UM-UC3 luc e UM-UC13 luc) è stata eseguita in 50 animali sotto ultrasuono-guida per tre giorni consecutivi. L'inoculazione è stata eseguita in modo efficiente (tempo medio di 5.7 min / animale) e non era associata a complicazioni intra o post-interventistiche.
Monitoraggio della crescita tumorale è stata eseguita ecografia e bioluminescenza. Il giorno # 3 un tumore potrebbe essere rilevato con l'ecografia nella vescica anteriore di tutti i 50 animali [Figura 4 I]. 98% di topi hanno mostrato crescita tumorale costante durante il periodo di follow-up [Figure 4 e 5]. A seguito della inoculazione di UM-UC3 luc, un mouse sviluppato intraperitoneale diffusione del tumore e il tumore involuta dopo giorno # 7 in un secondo animale [Tabella 1]. Questo è stato il primo gruppo di topi inoculati con questa nuova tecnica.
nt "> I topi sono stati sacrificati il giorno # 24, # 28 e # 37 dopo l'inoculazione di UM-UC3 luc, UM-UC1 luc e UM-UC13 luc, rispettivamente. tumori xenotrapianto sono state raccolte ed esaminate in ematossilina ed eosina (H & E sezioni). Tutti i tumori erano muscolo invasiva e alcuni infiltrati nel grasso perivescicale, ma nessuna invasione in organi adiacenti è stato osservato [Figura 6 I]. il 60% dei topi portatori di tumori luc UM-UC13 e il 20% dei topi portatori di UM-UC3 luc I tumori retroperitoneali sviluppato metastasi linfonodali che sono state confermate dalla colorazione H & E [Figura 6 II].
Figura 1. Immagine e illustrazione schematica del setup sperimentale. Il mouse è montato sul tavolo operatorio riscaldato (I) e tenuto sotto anestesia ( II) con 3% miscela isoflurano / ossigeno. Gli arti inferiori sono fissate con un nastro di gomma (III). Dopo aver raggiunto la sonda ad ultrasuoni (IV) alla pelle (allineamento longitudinale con un angolo di 45-70 ° cranica) vescica (V) viene visualizzato sullo schermo ultrasuoni. Una siringa con un ago 30 G (VI) è guidato alla pelle con un angolo di 30-45 ° (80-90 ° rispetto all'asse longitudinale la sonda ad ultrasuoni).
Figura 2. Immobilizzazione della vescica. Dimensioni e illustrazione per costruire la cinghia di stabilizzazione vescica (I) la cinghia viene fissata al basso addome e immobilizza la vescica (II). Così un evasione del vescica durante l'iniezione intramurale è evitata.
Figura 3. Intramurale inoculazione delle cellule tumorali. Visualizzazione della vescica sullo schermo ultrasuoni (I). Perforazione della pelle e dei muscoli della parete addominale (II). Inserimento dell'ago nella parete della vescica senza penetrazione della mucosa (III). PBS (50 microlitri) tra lo strato muscolare e la mucosa dopo l'iniezione lenta (IV). Le cellule tumorali sospese in Matrigel in intramurale spazio creato artificialmente (V, VI).
1123fig4.jpg "/>
Figura 4. . Follow-up con l'ecografia di follow-up continuo con l'ecografia ha mostrato significativo aumento del volume del tumore (I: giorno # 3, II: giorno # 7, III: giorno # 13).
Figura 5. Follow-up da bioluminescenza. Follow-up continuo per bioluminescenza ha mostrato costante incremento luminescenza durante il periodo di studio.
Figura 6. Istologia del tumore xenotrapianto e di metastasi linfonodali. In toto H & E della sezione di un xenotrapianto rappresentante tu mor dimostrando crescita invasiva nel muscolo senza invasione in organi adiacenti (I). Il 60% dei topi portatori di tumori luc UM-UC13 e il 20% dei topi portatori di UM-UC3 luc tumori metastasi linfonodali retroperitoneali presentati (II).
| Linea cellulare inoculato | UM-UC1 luc | UM-UC3 luc | Luc UM-UC13 | |
| Numero di topi | 20 | 15 | 15 | |
| Volume iniettato, microlitri | 40 | 50 | 50 | |
| Il conteggio delle cellule, assoluta | 3,6 x 10 5 | 6 x 10 5 | 5,5 x 10 5 | |
| Tempo per animali, min | 3.4 (± 1.6) | 7.7 (± 3.7) | 6.8 (± 2.9) | |
| Incidenza di tumori | 49 (98%) | |||
| 20 (100%) | 14 (93%) | 15 (100%) | ||
| Metastasi linfonodali | 0 | 3 (20%) | 9 (60%) | |
| Follow up (giorni) | 28 | 22 [prima del trattamento] | 28 [prima del trattamento] | |
| Volume del tumore (microlitri) | giorno 4 | 11.6 (± 1.3) | 12,5 (± 1,7) | 14.4 (± 1.3) |
| fine | 394,6 (± 72,4) | 288,7 (± 66.1) | 78,3 (± 13,4) | |
| follow-up | ||||
| Tumore luminescenza (fotoni / sec) | giorno 4 | 4,6 x 10 8 | 2,0 x 10 8 | 5,8 x 10 8 |
| (± 9.4 x 10 7) | (± 3,7 x 10 7) | (± 1,3 x 10 8) | ||
| fine | 1,9 x 10 10 | 1,4 x 10 10 | 1,5 x 10 10 | |
| follow-up | (± 4,0 x 10 9) | (± 2,3 x 10 9) | (± 1,9 x 10 9) | |
Tabella 1. Iniezione di cellule tumorali eco-guidata - procedura e risultati.
Discussione
Quasi tutti i grandi progressi nella terapia del cancro richiedono test su modelli animali prima di iniziare le sperimentazioni cliniche. Modelli animali di cancro sono strumenti essenziali che permettono ai ricercatori di studiare la biologia del tumore in vivo. Modelli di xenotrapianto ortotopico rimangono l'oro standard di 1,2 e continuano ad offrire la massima flessibilità (in termini di selezione delle linee di cellule) e hanno l'utility più pratico.
La procedura illustrata è una modifica minimamente invasiva del modello ortotopico precedentemente descritto da Dinney et al. 12 Abbiamo stabilito tumori xenotrapianto da ecoguidato iniezione percutanea di tre linee cellulari differenti con un tasso di successo tecnico del 100%. Durante continuo follow-up, il 98% dei topi ha dimostrato costante aumento del volume del tumore.
Eseguendo una tecnica minimamente invasiva siamo stati in grado di affrontare i limiti attuali del modello intramurale. Oltre respeamen benessere degli animali, l'invasività ridotta di questo procedimento contribuisce anche alla riproducibilità di esperimenti in vivo diminuendo il numero di complicazioni chirurgiche. E 'molto tempo efficace per evitare una laparotomia addominale e conseguente necessità per la chiusura della ferita. Siamo riusciti a ridurre significativamente il tempo di procedura per animale a 3,4 min (± 1.6). Tuttavia, il vantaggio principale del nostro nuovo approccio è la sua precisione. Ad alta risoluzione ultrasuoni ci permette di visualizzare lo spazio creato da iniezione salina sotto la mucosa della parete della vescica. Questa prima iniezione passo facilita l'iniezione delle cellule tumorali in una seconda fase e minimizza il rischio di fuoriuscita delle cellule tumorali. Ciò contrasta con la tecnica di iniezione intramurale dopo laparotomia, dove è impossibile visualizzare posizionamento dell'ago e c'è sempre un elemento di incertezza circa l'esatta profondità di iniezione. Inoltre, come stiamo inoculando cellule tumorali rigorosamente nella parete vescicale anteriore, growt tumoreh sulla parete posteriore della vescica è evitata. Successivamente il tasso di complicanze ostruttive causa della crescita del tumore in prossimità degli orifizi ureterali è estremamente raro. Questo effetto di accompagnamento consente periodi di crescita e di trattamento più lunghi.
La limitazione principale del tumore inoculazione ecografico è la necessità di misure tecniche adeguate. Pertanto le prestazioni di questa procedura sarà probabilmente limitata ai centri che sono specializzati in modelli animali di cancro umano. Ciò dovrebbe incoraggiare le collaborazioni tra gruppi di ricerca al di fuori di queste istituzioni e dei gruppi con competenze in tale modellizzazione animali romanzo.
Anche se dipende dalla familiarità con ecografia e una certa destrezza manuale, questo modello è facile da imparare sotto istruzione competente. Il passaggio chiave nella procedura è la creazione di un sottomucosa spazio artificiale nella parete della vescica con soluzione fisiologica. Una volta che questo spazio è creato senza perforazione of strato mucoso, rimane stabile per diversi minuti. La guida del secondo ago in questo spazio per inoculare le cellule tumorali è relativamente semplice. La complicazione principale durante la creazione dello spazio sottomucosa è perforazione dell'ago nel lume della vescica. La creazione di uno spazio sottomucosa, tuttavia, rimane fattibile. L'ago deve essere ritirato lentamente nella parete della vescica e la soluzione salina iniettata solo quando lo strato mucoso ribalta la punta dell'ago. Dopo questa manovra spazio sottomucosa è meno stabile (soluzione fisiologica fluisca al lume vescicale entro 30-60 sec) e l'iniezione delle cellule tumorali deve essere eseguita rapidamente. Fuoriuscita di cellule tumorali nel lume della vescica può verificarsi in questi casi con perforazione della mucosa. Anche se la perdita di cellule tumorali dallo spazio intramurale potrebbe portare a un volume del tumore è diminuito durante il follow-up, non abbiamo mai osservato alcun assorbimento del tumore intravesical.
Un altro potenziale complication è la fuoriuscita di cellule tumorali nella cavità peritoneale attraverso il canale di iniezione. Abbiamo osservato una sola intraperitoneale disseminazione tumorale delle cellule in 50 animali, e questo si è verificato in uno dei nostri primi tentativi. Noi attribuiamo questo l'iniezione di un volume eccessivo sospensione di cellule tumorali. Ciò è stato confermato dal fatto che la riduzione del volume di 50-40 ml non ha comportato ulteriori spargimenti intraperitoneale.
Questo inoculazione minimamente invasiva murino ortotopico xenotrapianto cancro della vescica rappresenta una modifica innovativa del "modello intramurale" esistenti, beneficiando sia l'investigatore e gli animali allo stesso modo. I vantaggi di questo modello incoraggiare il suo adattamento ad altri organi come il rene, prostata e fegato per stabilire tumori xenotrapianto ortotopiche in modo minimamente invasivo.
Dichiarazioni
Accesso aperto per questo video-articolo è sponsorizzato da FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Eliana Beraldi per l'esecuzione di trasduzione virale di linee cellulari tumorali e Ben Deeley per la sua istruzione sull'uso della piccola piattaforma ecografica animale.
Questo progetto è stato sostenuto dalla Fondazione Sistema tedesco (DFG, JA 2117/1-1: 1), il Research Institute Canadian Cancer Society e Mentored medico Scientist Award da Vancouver Coastal Health Research Institute. La piattaforma di imaging ad ultrasuoni è stato finanziato dalla Fondazione canadese per l'innovazione.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Clorexidina gluconato (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Tripsina (0,25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Siringa (1 ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Ago ipodermico (30 G; ¾ in) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24 G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 piattaforma di imaging per piccoli animali | VisualSonics | ||
| RMV 706 testina di scansione a ultrasuoni | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
Riferimenti
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
Ristampe e permessi
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso