Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione Chlamydia Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

Le malattie infettive causate da specie del batterio Chlamydia intracellulare suscitare un peso importante sulla salute globale, tra cui malattia sessualmente trasmessa, malattia infiammatoria pelvica, la cecità, la polmonite e, eventualmente, l'aterosclerosi ^1-4. La capacità di Chlamydia di interagire con la cellula ospite, all'interno di un vacuolo (chiamato l'inclusione), è un fattore determinante per il loro successo infezione delle cellule e l'host. L'inclusione è un compartimento patogeno romanzo che permette la crescita da Chlamydia e viene modificato dinamicamente durante l'intero ciclo di sviluppo di 2-3 giorni di Chlamydia ^5. La natura obbligato intracellulare di chlamydiae presenta numerose sfide per la comunità di ricerca, in particolare per lo studio della biologia direttamente unico dell'inclusione. Un importante ostacolo è stata l'impossibilità di visualizzare in modo efficiente o Chlamydia intracellulare o la loro inclusione con approccio fluorescentees nelle cellule viventi. Una recente scoperta ha finalmente rivelato i mezzi per generare GFP che esprimono C. trachomatis ^6; tuttavia, questo risultato non ha ancora portato a un'etichettatura specifica dell'inclusione. Alcune tecniche sono state descritte per l'etichettatura di batteri e inclusioni ^7,8, ma soffrono di carenze quali la non specificità, transitorietà e la suscettibilità alle photobleaching. Una scoperta fondamentale per il nostro gruppo ha stabilito una nuova strategia per illuminare l'inclusione mediante GFP che esprimono cellule ospiti ^9. Questa strategia sfrutta razionalmente l'impermeabilità intrinseca della membrana inclusione di molecole maggiore di 520 Da ^10. Quando le cellule sono progettati per esprimere stabilmente una particolare proteina fluorescente citosolica (ad esempio, GFP o mCherry), inclusioni Chlamydia sono visibili con notevole chiarezza la loro completa esclusione di fluorescenza. Questa strategia di imaging inversa permette la visualizzazione immediata di inclusioni per tutti Chlspecie amydia e può essere facilmente adattato per la maggior parte delle cellule ospiti d'interesse. A dimostrazione della sua utilità, questo metodo è stato utilizzato in precedenza per rivelare e definire le vie di uscita per Chlamydia spp cellulari ^9.

Qui, abbiamo ulteriormente dimostra come si esegue questo metodo, e può essere sfruttata per ricavare dati quantitativi chiave su dinamiche di crescita inclusione. Inoltre, si può effettivamente sostituire costosi metodi di enumerazione base di anticorpi e può essere utilizzato in tandem con altre etichette fluorescenti, come mKate2 esprimono Chlamydia ^11. Questa potente combinazione di strumenti consente l'esplorazione delle proprietà fisiche della membrana inclusione chlamydial all'interno delle cellule ospiti vivente.

1. Generazione di linee cellulari Host fluorescente

1. Giorno 1. Cellule piastra 293T (o altra linea di confezionamento retrovirali) su 6 pozzetti a 2 x ¹⁰ 6 cellule / Beh, per essere ~ 75% confluenti il giorno successivo. Se lo si desidera, da utilizzare piastre pozzetti in duplicato per ciascuna retrovirus.
2. Giorno 2. Le cellule Aspirare e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutammina). Trasfettare le cellule con 5-8 mcg ciascuna di vettore retrovirale (contenente GFP) e la confezione vettore (ad es., PVSVg) utilizzando Lipofectamine 2000 o reagente simile e seguendo le istruzioni del produttore.
3. Incubare le cellule con il DNA per 4-6 ore in una C CO _{2 incubatore} 37 °, e successivamente sostituire medio con 1 ml di terreno di coltura.
4. Incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C CO _{2 incubatore.}
5. 3. Piatto cellule Day bersaglio (ad es., HeLa) su 6 pozzetti a una densità approssimativa di 10 ⁵ cellule / pozzetto, per essere ~ 50% confluenti ilIl giorno dopo. Verificare trasfezione in cellule 293T positivo monitorando fluorescenza GFP su un microscopio invertito.
6. Giorno 4. Raccogliere-retrovirus contenente supernatanti le cellule 293T con una pipetta e filtrare il surnatante attraverso un filtro siringa da acetato di 0,45 micron di cellulosa.
7. Rimuovere medio da cellule HeLa e aggiungere 0,5 ml di mezzo di crescita, contenente 16 mg / ml polibrene. Aggiungi ~ 0,5 ml di retrovirus filtrato alle cellule goccia a goccia e incubare le cellule in una C CO _{2 incubatore} 37 ° per 24 ore. Conservare eventuali retrovirus rimanenti (cioè dal duplicare pozzo) a 4 ° C.
8. Giorno 5. Se sono stati fatti pozzetti in duplicato per generare retrovirus in più, ripetere il punto 1.7 di infettare in serie con le restanti particelle retrovirali.
9. Giorno 6. Passaggio transfettate cellule HeLa 1: 1 in 10 cm piatto contenente selezione antibiotica (ad esempio 500 mg / ml di neomicina).
10. Attendere un tempo sufficiente per cellule trasdotte a ricrescere in presenza di selezione antibiotic, dopo di che le cellule possono essere propagate per tecniche standard con una minore concentrazione di selezione antibiotica (es., 200 ug / ml di neomicina).
    Nota: Le cellule possono anche essere selezionati per clonale luminosità ideale in questo momento, se necessario.

2. Generazione di GFP che esprimono Chlamydia trachomatis

1. Preparare 2x CaCl ₂ tampone (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl ₂₎ e tampone 4SP (0,4 M di saccarosio, 16 mM Na ₂ HPO _4).
2. Giorno 1. Scongelare congelato C. trachomatis magazzino dal ghiaccio e portare subito 10 microlitri di batteri in 50 microlitri 2x CaCl buffer di _2. Aggiungere 3 mg plasmide DNA (ad es., Pask-GFP-mKate2-L2), mescolare bene e incubare per 30 minuti a 25 ° C.
3. Durante questa fase, preparare cellule ospiti da trypsinizing un pallone T-75 di cellule McCoy in una provetta da centrifuga. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Resuspend pellet cellulare in volume appropriato di 1x tampone CaCl ₂ per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 ⁷ cellule / ml.
4. Dopo 30 min di incubazione (dal punto 2.2), aggiungere 100 ml preparati cellule McCoy per tubo miscela trasformazione (volume totale 200 ml) ed incubare un ulteriore 20 min a 25 ° C. Aggiungere 100 ml di questa miscela cellula trasformata per un singolo bene da un 6-pozzetti e overlay con mezzo di 2 ml di crescita. Incubare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ per 2 giorni.
5. Giorno 3. Le cellule Lyse McCoy infettate con C. trachomatis sostituendo medio con 1 ml di dH _{2 O e} raschiare le cellule con un piegato punta pipetta 1000 ml. Aggiungere 1 ml di tampone 4SP e passare sospensione attraverso un ago 27,5 G ~ 5 volte per lisi cellulare efficiente e il rilascio di C. trachomatis.
6. Trasferimento 2 ml di lisato cellulare contenente C. trachomatis in un pallone T-75 contenente un monostrato confluente di fresco placcato McCcellule Oy; aggiungere 8 ml DMEM (senza FBS) e incubare per 2 ore a 25 ° C per consentire C. trachomatis di aderire alle cellule.
7. Aspirare le cellule e aggiungere terreno di coltura fresco supplementato con 10 U / ml di penicillina G e 1 mg / ml cicloeximide. Incubare per 48 h beuta in un incubatore a 37 ° C CO _2.
8. Giorno 4. Verificare al microscopio ottico che le cellule sono infettate e inclusioni contengono Chlamydia aberrante. Identificare inclusioni come vacuoli luminosi su un microscopio a luce normale, e corpi clamidia aberranti come oggetti anulari all'interno di inclusioni che sono maggiori di 2 micron di diametro.
9. Giorno 5. Lyse cultura sostituendo medie, con 2 ml di _dH 2 O e raschiare le cellule in una sospensione. Aggiungere 2 ml di tampone 4SP e passare sospensione attraverso un ago 27,5 G ~ 5 volte.
10. Utilizzare 2 ml di lisato cellulare per infettare un nuovo monostrato di cellule McCoy in un singolo pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Incubare le cellule con lisato per 2 ore a 25 ° C, aspirare e aggiungere la crescita frescoterreno contenente penicillina G e cicloesimide.
11. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C CO ₂ per 3-5 giorni, a seconda di salute generale delle cellule.
12. Ripetere i punti 2.9-2.10 una o più volte, se necessario, le culture passaging nei pozzetti fresche in un 6-bene fino a quando le normali inclusioni ricerca (privi di organi aberranti) sono emerse. In questo momento utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per controllare che C. trachomatis esprimere mKate2 (rosso).
13. Scalare colture infette per la produzione delle scorte di clamidia ad alto titolo, ad esempio raccogliendo trasformanti Chlamydia da cellule infettate McCoy o HeLa cresciute in T-150 palloni.

3. infettare le cellule con Chlamydia

1. Piastra cellule GFP-HeLa sulla nave cultura desiderato, ad esempio piatti di vetro inferiore o diapositive da camera per imaging ad alta risoluzione, o piastre da 24 pozzetti per la determinazione IFU e lo screening pozzetti.
2. Scongelare frotubo zen contenente C. trachomatis, C. muridarum, o C. pneumoniae su ghiaccio e diluire in HBSS alla molteplicità desiderata di infezione (MOI), per esempio MOI = 1.
3. Eseguire infezioni statiche o centrifugazione-aided base al particolare ceppo Chlamydia che verrà utilizzato.
   1. Per le infezioni da C. trachomatis LGV sierotipo L2 o C. muridarum, lavare le cellule GFP-HeLa con HBSS e incubare con i batteri diluito per 2 ore a 25 ° C. Aspirare e lavare le cellule con HBSS, e incubare cellule in terreno di coltura a 37 ° C CO _{2 incubatore.}
   2. Per le infezioni da C. trachomatis sierotipo D o C. pneumoniae, lavare le cellule GFP-HeLa con HBSS e aggiungere batteri diluiti alle cellule. Mettere piatto pozzetti o un piatto fondo di vetro (fissato con nastro in un coperchio piatto pozzetti) in un supporto di pozzetti piatto di un rotore attacco oscillante secchio in una centrifuga da banco.
   3. Centrifugare le cellule a 900 xg a 25 ° C per 1 ora. Rimuovere recipienti di coltura da centrifuga e posto in un incubatore a 37 ° C di CO ₂ per 1 ora.
   4. Aspirare le cellule in un armadio biosicurezza, lavare le cellule due volte con HBSS, e aggiungere mezzo di crescita fresco. Cellule posto in un _incubatore CO 2 C 37 °.

4. Visualizzazione cellulare dal vivo di Chlamydia Inclusioni

1. Rimuovere Chlamydia infettate cellule GFP-HeLa di CO _{2 incubatore} e sostituirlo media con RPMI senza rosso fenolo + 5% FBS.
2. Montare le cellule su un microscopio a fluorescenza invertito (Nikon Eclipse Ti-E o simile) con un obiettivo 20X o superiore olio.
3. Utilizzando il software di imaging (Volocity 6 o simile), si concentrerà su e identificare Chlamydia infettato cellule GFP-HeLa: cellule verdi contenenti grandi buchi neri (inclusioni Chlamydia).
4. Segnare le posizioni xyz delle regioni contenenti Chlamydia cellule -infected di interesse utilizzando software di imaging (Volocity 6 o simile). Eseguire questo manualmente 'Aggiunta di punti ", mentre nella modalità di visualizzazione XY Stage. In questo modo, le coordinate xyz vengono salvate per ogni punto contrassegnato.
5. Nella finestra di dialogo Installazione di acquisizione, configurare il software per l'acquisizione verde (GFP, HeLa citoplasma) e rosso (mKate2, C. trachomatis) canali, e ad un tasso di nuovi fotogrammi al canale ogni 5 min.
6. Acquisire la sequenza di immagini tramite l'acquisizione protocollo è entrato sopra cliccando sul pulsante "Capture / Record".

5. La quantificazione dei parametri di crescita di inclusione in cellule vive

1. A volte desiderato dopo l'infezione (ad es., 24, 48 HPI) rimuovere Chlamydia infettato cellule GFP-HeLa da incubatore e montare su un microscopio a fluorescenza invertito. Nota: Un obiettivo 20X o 40X aria con un alto NA è più adatto per piastre da 24 pozzetti, e un obiettivo di olio 40X è raccomandato per le diapositive da camera. Crescere le cellule su entrambi substrato per questo culoay.
2. Focus su midplane di cellule, in cui inclusioni sono al loro diametro massimo e produrre bordi nitidi.
3. Acquisire le immagini per molti campi a ciascun pozzetto (almeno il 10 per bene); pozzi in genere rappresentano repliche o variabili sperimentali.
4. Enumerare il numero di inclusioni manualmente, a occhio (inclusioni sono compartimenti neri nelle cellule GFP-HeLa) o utilizzare algoritmi software di imaging per identificare e contare automaticamente inclusioni.
   1. Trova le cellule GFP-HeLa di intensità di fluorescenza ('Trova oggetti' di comando) e regolare l'intensità soglia di fluorescenza in base a intensità relative delle cellule.
   2. Filtrare gli oggetti selezionati con le linee guida di dimensioni di mantenere solo quelli maggiori di 5 micron ^2. Si tratta di 'popolazione 1'.
   3. Applica 'riempire i fori in Objects comando utilizzando' popolazione 1 'come ingresso. Questo passaggio genera 'popolazione 2'.
   4. Sottrarre 'popolazione 1' da 'pOPOLAZIONE 2 'a cedere positivamente segnato inclusioni Chlamydia, designati come' popolazione 3 '.
   5. Applicare il filtro dimensione di 'popolazione 3' (comando 'Filter Popolazione'), ad esempio, mantenere gli oggetti superiore a 25 micron ^{2 per} inclusioni in cellule infettate per 24 ore o più a lungo. Per i tempi di infezione precoce, come ad esempio prima di 18 ore, filtrare dimensioni impostate per tenere gli oggetti maggiori di 4 ^micron 2, come queste inclusioni sono molto più piccoli. Risultati Dimensione filtro in una popolazione di oggetti designati come "inclusioni".
   6. Calcolare i dati quantitativi dalle immagini, ad esempio, il numero di inclusione, la dimensione di inclusione, e la circonferenza inclusione, utilizzando software di imaging.

Le cellule di mammiferi che esprimono proteine ​​fluorescenti citosoliche (ad esempio, GFP) possono essere progettati per consentire l'illuminazione di inclusioni Chlamydia nelle colture cellulari, vivi infetti. Al momento l'infezione da Chlamydia, inclusioni sono facilmente visibili come macchie nere nelle cellule ospiti (Figura 1). La chiarezza di inclusioni-fluorescenza carente può essere sfruttata per l'identificazione automatizzata di inclusioni in numerosi campi di vista e / o trattamenti (Figura 1). Una volta che sono state generate cellule ospiti fluorescenti, un nuovo e potente flusso di lavoro è attivato per una rapida, analisi quantitativa dei livelli di infezione da Chlamydia nei campioni sperimentali. Un'applicazione importante è la determinazione della Chlamydia inclusione unità formanti (IFU) in cellule vivi infetti (Figura 2). Questa strategia sperimentale evita la necessità di procedure di immunofluorescenza che vengono abitualmente utilizzati nel settore, che sono sia in termini di tempo ecostosa.

Un'altra caratteristica fondamentale dell'approccio di imaging descritto è che può essere facilmente applicato a qualsiasi specie Chlamydia o ceppo, e, inoltre, può essere sfruttato per la derivazione di importanti caratteristiche biologiche di inclusioni clamidia. Come esempio, un tempo di analisi corso di cellule GFP-HeLa infettate con C. trachomatis LGV sierotipo L2, C. trachomatis sierotipo D, C. muridarum, e C. pneumoniae è stata eseguita a 16, 24, e 48 HPI (Figura 3). Per ciascuna di queste specie e ceppi Chlamydia, inclusioni sono stati segnalati e analizzati per calcolare la loro posizione media, il perimetro di lunghezza, e per cellula, a volte indicato (Figura 4). Questi attributi forniscono importanti informazioni sulla biologia delle inclusioni clamidiali e informare come interagiscono con la cellula ospite. Il metodo descritto fornisce un approccio facile per questo tipo di informazione in modo che su rpasses ciò che può essere realizzato con altre tecniche sperimentali. Un programma di utilità finale della strategia di etichettatura inversa è in tempo reale di immagini di inclusioni Chlamydia nelle cellule viventi. Un esempio di questo è mostrato in Film 1.

Figura 1. automatizzata rilevamento di C. inclusioni trachomatis. cellule (A) GFP-HeLa sono state infettate con (B) mKate2 esprimono C. trachomatis L2 e ripreso dal vivo in 24 HPI. Un algoritmo basato su software di imaging è stato usato per identificare automaticamente le inclusioni clamidia da (C) selezionando buchi neri in cellule GFP-HeLa, segnate in arancione. È anche mostrato (D) una immagine composita di cellule infette da pannelli A e B. Barra della scala = 20 micron. .jove.com / files / ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. La determinazione quantitativa di Chlamydia unità di inclusione formatura (IFU) in GFP-HeLa cellule. Le cellule GFP-HeLa sono state infettate con C. trachomatis L2 a due diverse molteplicità di infezione e ripreso a 24 HPI. Inclusioni per 10 campi per l'infezione sono stati rilevati e enumerati utilizzando software automatici ed i risultati sono riportati (n = 3). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Naturalmente il tempo di C. trachomatis sierotipo L2, C. trachomatis sierotipo D, C. muridarum, e C. pneumoniae infezione in cellule GFP-HeLa. cellule GFP-HeLa sono state infettate con C. trachomatis LGV sierotipo L2 e ripreso al microscopio a fluorescenza dal vivo al (A) 16 HPI, (B) 24 HPI, e (C) 48 HPI. Cellule GFP-HeLa infettate con C. trachomatis sierotipo D sono state ripreso a (D) 16 HPI, (E) 24 HPI, e (F) 48 HPI. Cellule GFP-HeLa infettate con C. muridarum sono state ripreso a (G) 16 HPI, (H) 24 HPI, e (I) 48 HPI. Cellule GFP-HeLa infettate con C. pneumoniaesono stati ripreso a (J) 16 HPI, (K) 24 HPI, e (L) 48 HPI. Immagini rappresentative sono indicati per tutte le infezioni e tempi. Barre di scala = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. dati quantitativi rappresentativi derivati ​​dagli esperimenti del corso di tempo. Inclusioni dalle cellule GFP-HeLa infettati con (A) C. trachomatis LGV sierotipo L2, (B) C. trachomatis sierotipo D, (C) C. muridarum, e (D) C. pneumoniae sono stati rilevati e enumerato a 16, 24, e 48 HPI (5 campi per intervallo di tempo, n = 3). Caratteristiche fisiche del chlaminclusioni ydial stati quantificati per l'area superficiale inclusione, inclusione perimetro lunghezza e numero di inclusioni per cella. Barre di errore rappresentano il SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Cliccate qui per vedere il video. Filmato 1. Tempo lapse video di cellule HeLa mCherry-infettati con GFP C. trachomatis L2, scattata al 48 HPI. Il video è stato compilato da una serie di time-lapse immagini scattate a intervalli di 5 min per 125 min. Alterna il video in loop attraverso cellule mCherry-HeLa (rosso), C. trachomatis L2 (verde) e una fusione di entrambi i campi.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.