Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo per isolare gli esosomi dall'urina umana utilizzando una tecnica di precipitazione modificata.

Abstract

L'identificazione di biomarcatori che consentono la diagnosi precoce delle malattie renali nelle urine e nel plasma è stata un'area di interesse attivo per diversi anni. Le vescicole esosomiche urinarie, di dimensioni comprese tra 40 e 100 nm, vengono rilasciate nelle urine in condizioni normali dalle cellule di tutti i segmenti nefroni e possono contenere proteine, mRNA e microRNA rappresentativi del loro tipo di cellula di origine. In condizioni di disfunzione renale o lesione, gli esosomi possono contenere proporzioni alterate di questi componenti, che possono fungere da biomarcatori per la malattia. Attualmente sono disponibili diversi metodi per l'isolamento degli esosomi urinari e in precedenza abbiamo condotto un confronto sperimentale di ciascuno di questi approcci, tra cui tre basati sull'ultracentrifugazione, uno utilizzando un concentratore di ultrafiltrazione a nanomembrana, uno utilizzando un reagente di precipitazione commerciale e uno utilizzando una modifica della tecnica di precipitazione utilizzando il reagente ExoQuick che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio. Abbiamo scoperto che il metodo di precipitazione modificato ha prodotto la più alta resa di particelle di esosomi, miRNA e mRNA, rendendo questo approccio adatto per l'isolamento di esosomi per la successiva profilazione dell'RNA. Concludiamo che il metodo di precipitazione degli esosomi modificato offre un'alternativa rapida, scalabile ed efficace per l'isolamento degli esosomi dalle urine. In questo rapporto, descriviamo la nostra tecnica di precipitazione modificata utilizzando il reagente ExoQuick per isolare gli esosomi dall'urina umana.

Introduction

Esosomi urinari sono piccole vescicole interne di 100 nm di corpi multivescicolari (MVB) derivate da tutti i tipi di cellule in condizioni normali e patologiche nello spazio urinario compresi podocytes glomerulare, cellule tubulari renali e cellule che rivestono le sistemi di drenaggio urinario che sembrano essere arricchito per miRNA ^{1 -2.} Molti ricercatori hanno rilevato proteine ​​distinte in esosomi isolate da urine di soggetti sani e quelli con renale e / o malattie sistematiche ^3-5. Esosomi possono essere isolati con metodi diversi, come due fasi ultracentrifugazione differenziale con o senza saccarosio ^6-7, combinando filtro nanomembrana con ultracentrifugazione ^{8-9, 10-11} o precipitazione. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice, veloce, scalabile ed efficace per isolare esosomi urinari e rilevare miRNA e biomarcatori proteici ^11. Sebbene biomarker possono essere rilevati in una varietà di diversi fluidi biologici, urine è la scelta più conveniente per i pazienti con malattie del rene e del tratto urinario perché può essere ottenuta in grandi quantità in modo relativamente non invasivo.

Anche se ci sono diversi metodi per isolare esosomi urinarie ^6-11, la procedura più comunemente usato dipende ultracentrifugazione differenziale con un cuscino di saccarosio 30%. Mentre questo metodo è efficiente e la qualità dei exosomes risultanti isolati con questa procedura è alta, la tecnica si richiede personale specializzato ed è, richiede diversi passaggi ultracentrifugazione richiede tempo. Altri metodi, come la filtrazione e precipitazioni, sono stati sviluppati per l'isolamento di esosomi, tra cui uno che utilizza un reagente di precipitazione proprietario (cioè, ExoQuick-TC: Biosciences System; Mountain View, CA). Anche se le precipitazioni usando questo reagente è veloce e relativamente facile, la purezza dei esosomi isolate è basso rispetto alla meth ultracentrifugazioneod. Recentemente abbiamo confrontato sei metodi per l'isolamento di esosomi urinari, tra cui una modifica del metodo di precipitazione mediante ExoQuick-TC, che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio ^11. Abbiamo scoperto che questo metodo di precipitazione modificato prodotto maggiori quantità di proteine, miRNA e mRNA e la procedura in sé era più veloce e più facile da implementare che ultracentrifugazione. Qui, descriviamo il protocollo sperimentale del nostro metodo di precipitazione modificato in modo graduale, e comprendono una discussione sui vantaggi e gli svantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di isolamento exosome. Il metodo di precipitazione modificato prevede una precipitazione iniziale di particelle exosome, seguita dalla rimozione di proteina di Tamm-Horsfall, che è correlato con le proteine ​​exosomal, e noto per ridurre exosome resa dalle urine. Abbiamo trovato che tali modifiche aumentato la resa e la purezza della preparazione exosomal dall'urina.

Protocol

NOTA:. I passi necessari per l'isolamento dei esosomi urinari con il metodo di precipitazione modificato sono illustrati nella Figura 1 Le fasi iniziali prevedono la rimozione di grandi cellule morte e detriti cellulari mediante centrifugazione. Il pellet finale ottenuto dal supernatante raccolto da ciascun passo successivo corrisponde al exosome, che viene sciolto in soluzione di isolamento per l'ulteriore estrazione di proteine, RNA e DNA.

1. Raccolta delle urine

1. Prima della raccolta delle urine, preparare con inibitori della proteasi cocktail secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 3,125 ml di questo cocktail per una presa sterile vuota. La provetta contenente il cocktail di inibitori delle proteasi può quindi essere distribuito ai volontari per la raccolta delle urine.
   NOTA: La ragione per l'aggiunta di inibitore della proteasi è quello di minimizzare la degradazione della proteina nel campione di urina. Anche se abbiamo usato un particolare cocktail inibitore della proteasi daSigma, altri inibitori della proteasi disponibili in commercio possono essere sostituiti.
2. Raccogliere circa 10 ml di urina prima nullo. Processo urine subito dopo la raccolta, senza la conservazione o refrigerazione. Isolare le exosomes urinarie in duplicato utilizzando il metodo di precipitazione modificato; uno dei duplicati è per DNA, RNA totale e l'estrazione delle proteine, mentre l'altra è per la quantificazione delle particelle exosome urinarie.
   NOTA: Un campione di urine delle 24 ore può essere raccolto per l'isolamento exosome memorizzando a 4 ° C.

2. Rimozione dei detriti cellulari e Tamm-Horsfall Protein (THP)

1. Trasferire i campioni di urina a 15 ml provette. Centrifugare 10 ml di urina a 17.000 xg per 10 min a 37 ° C per eliminare cellule e detriti cellulari (Figura 1).
2. Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante in una nuova provetta per ulteriori elaborazioni. Risospendere il pellet in 500 ml di soluzione di isolamento 250 mM di saccarosio, mette alla prova (10 mManolamine, pH 7,6), seguito da 10 minuti di incubazione con DL-ditiotreitolo (DTT: concentrazione finale 200 mg / ml) a 37 ° C.
   NOTA: DTT si aggiunge a degradare THP, che intrappola esosomi, con conseguente riduzione della resa. Fare attenzione a lasciare il pellet indisturbata durante il trasferimento del surnatante, e confermare che il surnatante è chiaro di pellet.
3. Campioni di sedimenti di Vortex ogni 2 minuti fino a quando il pellet è completamente sciolto. Poi aggiungere 500 ml di soluzione di isolamento al pellet disciolto.
4. Immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione di isolamento al pellet, centrifugare a 17.000 xg per 10 min a 37 ° C. Pipettare il supernatante e si combinano con il supernatante raccolto precedente.
5. Risospendere il pellet in 50 ml di soluzione di isolamento per l'analisi SDS-PAGE.
   NOTA: PBS o TBS possono essere utilizzati al posto di soluzione di isolamento per risospendere il pellet.

3. Isolamento di Exosome Pellet

1. Per 11 ml di supern raccoltaatant, aggiungere 3,3 ml di reagente ExoQuick-TC e incubare a 4 ° C per almeno 12 ore.
   NOTA: Il rapporto tra volume di supernatante di reagente ExoQuick-TC può essere regolata per aumentare o diminuire la resa exosomal. Abbiamo osservato che minori volumi di reagente aggiunto producono rendimenti più piccole di esosomi.
2. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela campione / ExoQuick-TC a 10.000 xg per 30 min a 25 ° C.
3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per l'analisi SDS-PAGE.
4. Il pellet exosome può essere conservato a -80 ° C per il DNA, RNA e proteine ​​estrazione e la quantificazione delle particelle exosome utilizzando CD9 ELISA ^11.
   NOTA: Il pellet exosome può essere conservato a -80 ° C per 1 anno con congelamento e scongelamento limitata.

4. Biomarker rilevazione e l'analisi di Exosome Pellet

1. Per le analisi a valle, estrarre il DNA, RNA e proteine ​​dal pellet exosome utilizzando il DNA / RNA / Kit di isolamento delle proteine ​​e un ki isolamento RNAt secondo le istruzioni del produttore. Determinare le concentrazioni utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop misurando l'assorbanza a 260 e 280 nm con 2 ml di campione.
2. Eseguire quantitativa real time RT-PCR (qPCR) usando saggi microRNA TaqMan (nel nostro caso, abbiamo utilizzato umani miR-192- e miR-1207-5p-specifici test) o primer miRNA specifici.
3. Per l'analisi SDS-PAGE, utilizzare 4-12% Bis-Tris gel e campioni di proteine ​​separati da unidimensionale elettroforesi. Visualizza gel usando il kit di colorazione argento secondo le istruzioni del produttore.
4. Eseguire l'analisi Western Blot utilizzando membrane PVDF secondo le istruzioni fornite dal produttore. Utilizzare anticorpo policlonale di coniglio all'apoptosi-linked gene-2 ​​interagendo proteina X o ALIX e anticorpo monoclonale mouse per tumore gene di suscettibilità 101 proteine ​​o TSG101 nella rilevazione Western Blot. Quantificare la densità delle bande da open access software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programma simile.
5. Quantificare il numero di particelle exosome urinari ottenuti con un kit ELISA CD9 secondo le istruzioni del produttore.

Results

Esosomi urinarie trasportano proteine, miRNA e mRNA biomarcatori secreti dalle cellule epiteliali renali. L'isolamento e la rilevazione di questi esosomi possono fornire un utile strumento diagnostico per la diagnosi precoce delle malattie renali come la nefropatia diabetica. Ci sono diversi metodi per l'isolamento di esosomi da campioni di urina raccolti da soggetti umani. Abbiamo precedentemente confrontato sei metodi di isolamento urine exosome e studiato conseguente proteine, i livelli di mRNA e miRNA ^11....

Discussion

La maggior parte dei metodi che comportano la precipitazione di esosomi da urine non affrontano la rimozione della rete polimerica formata da proteina di Tamm-Horsfall (THP). Questa proteina è presente in grandi quantità nelle urine, dove intrappola putativamente esosomi durante iniziale centrifugazione a bassa velocità. Nel nostro metodo modificato abbiamo ridotto THP con DTT prima precipitazione exosome. Come mostrato in figura 2, una maggiore quantità di THP è stata osservata nelle urine non trasform...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Centrifuga	Tubo Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Proteasi Inibitore Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuga	Sorvall
DL-ditiotreitolo	Sigma Aldrich	D9779	utilizzato alla concentrazione finale di 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE sistema (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 pozzetti	Invitrogen	NP0321BOX	Per l'analisi SDS-PAGE
Kit ECL Advance Western blotting Detection	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Per il rilevamento di biomarcatori con western blot Sistema di
reagenti Exoquick-TC	Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Per l'isolamento degli esosomi
Sistema completo ELISA per esosomi CD9	Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Per la quantificazione degli esosomi
Mini kit AllPrep DNA/RNA/Proteine	Qiagen	80004	Per l'isolamento di DNA, RNA, proteine
Kit di pulizia Rneasy MinElute	Qiagen	74204
Spettrofotometro UV-Vis NanoDrop 2000	Thermo Scientific		Per la quantificazione delle proteine
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Per la colorazione dei
gel SDS-PAGESistema di elettroforesi Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies		Per l'esecuzione dei gel SDS-PAGE
Saggi TaqMan microRNA	Tecnologie		Per i saggi RT-PCR
Software qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		Per l'analisi dei dati dei saggi RT-PCR
Anticorpo policlonale di coniglio contro ALIX	Millipore		Per il rilevamento di biomarcatori
con western blotAnticorpo monoclonale di topo contro TSG101	Abcam		Per il rilevamento di biomarcatori con western blot