Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi

Summary

Qui si descrivono due saggi per misurare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.

Abstract

Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) possono portare ad attivazione del complemento con un conseguente approvazione accelerata attraverso recettori del complemento nel fegato (emolisi extravascolare) o portano alla lisi intravascolare dei globuli rossi. Alloanticorpi (ad esempio ABO) o gli anticorpi degli antigeni RBC (come si è visto in anemia emolitica autoimmune, MEA) che portano alla attivazione del complemento sono potenzialmente dannose e possono essere - soprattutto quando conduce alla lisi intravascolare - fatale ^1. Attualmente, l'attivazione del complemento a causa di (auto-anticorpi) in globuli rossi viene valutata in vitro utilizzando il test di Coombs riflettendo complemento deposizione su RBC o da un saggio emolitico nonquantitative riflettendo RBC lisi ^1-4. Tuttavia, per valutare l'efficacia di inibitori del complemento, è obbligatorio avere tecniche quantitative. Qui descriviamo due tali tecniche. In primo luogo, un test di rilevare C3 e C4 deposizione su globuli rossi che è indotto da anticorpi nel siero del paziente è prepresentate. Per questo, analisi FACS è usato con anticorpi anti-C3 o anti-C4 fluorescente. Accanto, un saggio emolitico quantitativo è descritto. Emolisi In questo saggio, complemento-mediata indotta dal siero del paziente viene misurata facendo uso di rilevazione spettrofotometrica della emoglobina rilasciata. Entrambi questi saggi sono molto riproducibile e quantitativa, facilitando studi di attivazione del complemento anticorpo-indotta.

Introduction

Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) può essere indotta da trasfusione di globuli rossi che esprimono un antigene che non è presente in globuli rossi del destinatario. Questi anticorpi ALLO possono causare gravi reazioni trasfusionali emolitiche acute dovute a completare l'attivazione sul seguente trasfusione ^5. In auto-immune anemia emolitica (MEA), i pazienti hanno auto-anticorpi contro i propri globuli rossi. Questo porta alla clearance accelerata delle cellule attraverso l'interazione di IgG legati a globuli rossi con Fcy-recettori sulla fagociti nella milza e / o in caso di auto-anticorpi capaci di attivare il complemento attraverso rece....

Protocol

1. Preparazione di bromelina trattati globuli rossi

1. Globuli rossi Lavare 0 tipizzate 3x con 1x PBS (centrifugazione a 664 xg per 2-5 min).
2. Incubare 1 volume di eritrociti concentrati con due volumi di una soluzione bromelina 0,5% per 10 min a 37 ° C.
3. Lavare le cellule 3x 1x PBS.
4. Le cellule possono essere memorizzati come una soluzione al 3% a 4 ° C in PBS 1x per almeno una settimana.

2. C3 e C4 Deposizione Analisi su globuli rossi di FACS

1. Calore inattivare la quantità necessaria di siero del paziente (o altra sorgente anticorpo anti-RBC) mediante riscaldamento del campione per 30 m....

Results

Figura 2A mostra un grafico rappresentante dispersione di globuli rossi. Gating Adatto per singoli globuli rossi può essere visto in de FSC-W - FSC-A plot (P1). Solitamente circa il 95% dei globuli rossi rientrano in questa porta P1 (singole cellule), ma quando viene usata una percentuale di siero del paziente, questo può cadere al 70-80%, specialmente quando anti-RBC IgM è presente nel siero del paziente.

Risultati rappresentativi per l'effetto del siero del paziente MEA su.......

Discussion

I dosaggi di cui sopra sono riproducibili e robusto. Essi sono di facile esecuzione ed è possibile effettuare loro con molti campioni Allo stesso tempo (in una piastra a 96 pozzetti). Pertanto, questo approccio sarebbe idoneo per un sistema completamente automatico, ad esempio un sistema robot ELISA. Contrariamente alle tecniche attualmente utilizzate, questi test sono quantitative e questo permette, ad esempio nello studio degli effetti di inibitori del complemento. Inoltre, l'interpretazione è ob.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Fresenius Kabi
BSA	Sigma	B-4287
Barbital	Fagron	0261	Questa sostanza chimica è soggetta a regolamentazione dei farmaci.
Barbital di sodio	Fagron	0263	Questa sostanza chimica è soggetta a regolamentazione dei farmaci.
Gelatina	Merck	1.0470.0500
Cloruro di sodio	Merck	1.06404.1000
Cloruro di magnesio	Merck	1.05833.0250
Cloruro di calcio	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 colorante reattivo all'ammina	Pierce	46402
Dylight 650 colorante reattivo all'ammina	Pierce	62265
&alfa; C5 (Eculizumab)	Alexion Pharmaceuticals
FACS (Canto)	BD		Può essere utilizzato qualsiasi FACS che abbia i laser appropriati.
Spettrofotometro (ad es. spettro Multiskan)	Thermo Labsystems	1500-193	È possibile utilizzare qualsiasi spettrofotometro con la giusta gamma di lunghezze d'onda
BD FACSDiva software v 6.1.2	BD	643629	È possibile utilizzare qualsiasi software di analisi FACS compatibile
Bromelina	Sanquin	K1121