Qui si descrivono due saggi per misurare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.
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Articolo metodologico
Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) possono portare ad attivazione del complemento con un conseguente approvazione accelerata attraverso recettori del complemento nel fegato (emolisi extravascolare) o portano alla lisi intravascolare dei globuli rossi. Alloanticorpi (ad esempio ABO) o gli anticorpi degli antigeni RBC (come si è visto in anemia emolitica autoimmune, MEA) che portano alla attivazione del complemento sono potenzialmente dannose e possono essere - soprattutto quando conduce alla lisi intravascolare - fatale 1. Attualmente, l'attivazione del complemento a causa di (auto-anticorpi) in globuli rossi viene valutata in vitro utilizzando il test di Coombs riflettendo complemento deposizione su RBC o da un saggio emolitico nonquantitative riflettendo RBC lisi 1-4. Tuttavia, per valutare l'efficacia di inibitori del complemento, è obbligatorio avere tecniche quantitative. Qui descriviamo due tali tecniche. In primo luogo, un test di rilevare C3 e C4 deposizione su globuli rossi che è indotto da anticorpi nel siero del paziente è prepresentate. Per questo, analisi FACS è usato con anticorpi anti-C3 o anti-C4 fluorescente. Accanto, un saggio emolitico quantitativo è descritto. Emolisi In questo saggio, complemento-mediata indotta dal siero del paziente viene misurata facendo uso di rilevazione spettrofotometrica della emoglobina rilasciata. Entrambi questi saggi sono molto riproducibile e quantitativa, facilitando studi di attivazione del complemento anticorpo-indotta.
Introduzione
Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) può essere indotta da trasfusione di globuli rossi che esprimono un antigene che non è presente in globuli rossi del destinatario. Questi anticorpi ALLO possono causare gravi reazioni trasfusionali emolitiche acute dovute a completare l'attivazione sul seguente trasfusione 5. In auto-immune anemia emolitica (MEA), i pazienti hanno auto-anticorpi contro i propri globuli rossi. Questo porta alla clearance accelerata delle cellule attraverso l'interazione di IgG legati a globuli rossi con Fcy-recettori sulla fagociti nella milza e / o in caso di auto-anticorpi capaci di attivare il complemento attraverso rece....
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Protocollo
1. Preparazione di bromelina trattati globuli rossi
- Globuli rossi Lavare 0 tipizzate 3x con 1x PBS (centrifugazione a 664 xg per 2-5 min).
- Incubare 1 volume di eritrociti concentrati con due volumi di una soluzione bromelina 0,5% per 10 min a 37 ° C.
- Lavare le cellule 3x 1x PBS.
- Le cellule possono essere memorizzati come una soluzione al 3% a 4 ° C in PBS 1x per almeno una settimana.
2. C3 e C4 Deposizione Analisi su globuli rossi di FACS
- Calore inattivare la quantità necessaria di siero del paziente (o altra sorgente anticorpo anti-RBC) mediante riscaldamento del campione per 30 m....
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Risultati
Figura 2A mostra un grafico rappresentante dispersione di globuli rossi. Gating Adatto per singoli globuli rossi può essere visto in de FSC-W - FSC-A plot (P1). Solitamente circa il 95% dei globuli rossi rientrano in questa porta P1 (singole cellule), ma quando viene usata una percentuale di siero del paziente, questo può cadere al 70-80%, specialmente quando anti-RBC IgM è presente nel siero del paziente.
Risultati rappresentativi per l'effetto del siero del paziente ME.......
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Discussione
I dosaggi di cui sopra sono riproducibili e robusto. Essi sono di facile esecuzione ed è possibile effettuare loro con molti campioni Allo stesso tempo (in una piastra a 96 pozzetti). Pertanto, questo approccio sarebbe idoneo per un sistema completamente automatico, ad esempio un sistema robot ELISA. Contrariamente alle tecniche attualmente utilizzate, questi test sono quantitative e questo permette, ad esempio nello studio degli effetti di inibitori del complemento. Inoltre, l'interpretazione è ob.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
SZ e DW ricevono una sovvenzione illimitata di Viropharma.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | Questa sostanza chimica è soggetta a regolamentazione dei farmaci. |
| Barbital di sodio | Fagron | 0263 | Questa sostanza chimica è soggetta a regolamentazione dei farmaci. |
| Gelatina | Merck | 1.0470.0500 | |
| Cloruro di sodio | Merck | 1.06404.1000 | |
| Cloruro di magnesio | Merck | 1.05833.0250 | |
| Cloruro di calcio | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 colorante reattivo all'ammina | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 colorante reattivo all'ammina | Pierce | 62265 | |
| &alfa; C5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Può essere utilizzato qualsiasi FACS che abbia i laser appropriati. | |
| Spettrofotometro (ad es. spettro Multiskan) | Thermo Labsystems | 1500-193 | È possibile utilizzare qualsiasi spettrofotometro con la giusta gamma di lunghezze d'onda |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | È possibile utilizzare qualsiasi software di analisi FACS compatibile |
| Bromelina | Sanquin | K1121 |
Riferimenti
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....
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Ristampe e permessi
