La neurotossina botulinica BoTest Matrix (BoNT) test di rilevazione rapida purificano e quantificare BoNT da una gamma di matrici. Qui vi presentiamo un protocollo per l'individuazione e la quantificazione delle BoNT da matrici sia solide e liquide e dimostriamo il test con BOTOX, i pomodori e il latte.
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Articolo metodologico
Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi
In questo articolo
Sommario
Abstract
È richiesto il rilevamento preciso e la quantificazione di neurotossina botulinica (BoNT) in matrici complesse per il settore farmaceutico, ambientale e test campione alimentare. È necessario un rapido BoNT sperimentazione di prodotti alimentari durante forense epidemia, la diagnosi del paziente, e la prova di sicurezza alimentare, mentre è richiesto il test di potenza accurate per la fabbricazione di prodotti a base di droga-BoNT e la sicurezza del paziente. Il biotest sui topi ampiamente usato per il test BoNT è altamente sensibile, ma manca la precisione e la velocità necessarie per un rapido e di routine test BoNT. Inoltre, l'uso del saggio biologico degli animali ha portato a inviti da parte delle autorità di regolamentazione dei prodotti di droga e sostenitori dei diritti degli animali negli Stati Uniti e all'estero per sostituire il biotest sui topi per il test BoNT. Diversi pezzi in vitro sono stati sviluppati che funzionano bene con purificata BoNT nel buffer semplici, ma la maggior parte non hanno dimostrato di essere applicabile a test in matrici molto complesse. Qui, un protocollo per la rilevazione diBoNT in matrici complesse utilizzando le BoTest Matrix test è presentato. Il saggio consiste di tre parti: la prima parte prevede la preparazione dei campioni per le prove, la seconda parte è un passo immunoprecipitazione con anticorpi anti-BoNT paramagnetici branelli rivestiti con anticorpo per purificare BoNT dalla matrice, e la terza parte quantifica proteolitica isolato di BoNT all'attività utilizzando un giornalista fluorogenica. Il protocollo è scritto per prove ad alta velocità in piastre a 96 pozzetti utilizzando matrici sia liquidi che solidi e richiede circa 2 ore di preparazione manuale con tempi totali dosaggio di 4-26 ore a seconda del tipo di campione, carico tossina, e la sensibilità desiderata. I dati sono presentati per BoNT / A test con soluzione salina tamponata con fosfato, un farmaco, supernatante di coltura, 2% latte e pomodori freschi e comprende discussione dei parametri critici di successo dosaggio.
Introduzione
Neurotossine botuliniche (BoNT) sono le sostanze più letali noti, con via endovenosa dosi letali umane stimate a 1-3 ng / kg 1,2. Sette sierotipi strutturalmente simili di BoNT, etichettati A a G, esistere, ciascuno costituito da un dominio catena pesante responsabile cella vincolante, assorbimento e traslocazione nel citosol e una catena leggera che codifica una endopeptidasi zinco 3-5. La tossicità squisita BoNT deriva da, in parte, la sua voce specifica di legame e in motoneuroni a livello della giunzione neuromuscolare 6. Una volta all'interno del neurone, la endopeptidasi catena leggera specificamente fende uno o più dei solu....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti del dosaggio
- Thaw ditiotreitolo 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguito buffer), 10x tampone di neutralizzazione (solo per prodotti alimentari e pH campioni squilibrate) e 10x BoTest tampone di reazione (10X Reaction Buffer di seguito) a temperatura ambiente (RT) per 15 min o fino a completo scioglimento. Vedi Tabella 1 per un elenco dei tamponi e reagenti utilizzati in questo protocollo. Vedere la Tabella 2 per un elenco dei materiali e delle attrezzature necessarie per questo protocollo.
- Agitare i buffer scongelati per 5 secondi per mescolare. 10x neutralizzazione....
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Risultati
Un diagramma che riassume i passaggi del protocollo descritto è illustrato nella Figura 2. Il test richiede tra 4-26 ore per completare a seconda del tipo di campione e dalla sensibilità del test desiderato, ma solo ~ 2 ore di hands-on tempo. Il test viene eseguito in piastre da 96 pozzetti e, a seconda del tipo di test in corso, permette test triplicato di fino a 20 campioni anche standard per piastra.
La figura 3 mostra i risultati del test rappresentativi.......
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Discussione
Questo protocollo descrive le procedure per la quantificazione BoNT / A complesso, holotoxin, o Clostridium cultura surnatante in matrici complesse. Il protocollo è lo stesso, però, quando prova diversi sierotipi di BoNT (ad es BoNT / B, E e F) con i rispettivi saggi Matrix 56,60, anche se la sensibilità del test varia di tutti i sierotipi e saggi. Questo protocollo non tiene conto di ogni tipo di campione possibile e alcune modifiche può essere richiesto a seconda della composizione del cam.......
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Dichiarazioni
FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin e WC Tucker sono dipendenti o proprietari di BioSentinel Inc. BioSentinel attualmente produce e ha commercializzato alcuni dei reagenti presentati in questo rapporto.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare H. Olivares e D. Ruge per le discussioni importanti e consigli. Questa ricerca è stata sostenuta in parte da un premio NSF SBIR (IIP-1.127.245 a BioSentinel Inc.) e del Dipartimento della Difesa contratto (W81XWH-07-2-0045 a BioSentinel Inc.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di rilevamento della neurotossina botulinica BoTest Matrix A | disponibili anche i kit di rilevamento BioSentinel A1015 per BoNT/B e F. | ||
| Lettore di micropiastre a fluorescenza Varioskan Flash | Thermo Fisher Scientific | 5250040 | È possibile utilizzare la maggior parte delle unità basate su monocromatore o filtro con eccitazione di 434 nm e capacità di emissione di 470 nm e 526 nm. |
| Piastra di separazione a microsfere magnetiche a 96 pozzetti | V& P Scientific | VP771H | Possono essere utilizzate altre piastre magnetiche, ma la piastra deve essere progettata in modo da separare le perle dal lato del pozzetto. |
| Lavapiastre compatibile con perline magnetiche | BioTek | ELx405 VSRM | Opzionale, necessaria solo per il lavaggio automatico delle lastre. Possono essere utilizzate anche altre rondelle per piastre compatibili con le perline magnetiche, ma devono essere testate prima dell'uso. |
| Microcentrifuga | Opzionale, necessaria solo per i campioni che necessitano di centrifugazione. | ||
| Miscelatore a piastre MixMate | Eppendorf | 22674200 | |
| Agitatore | Utilizzato a temperatura ambiente o a 25 ° C Se è disponibile il controllo della temperatura | ||
| , le compresse per inibitori della proteasi senza EDTA | Roche | 4693132001 | necessarie solo per i test alimentari o ambientali. Gli inibitori della proteasi devono essere privi di EDTA. |
| BoNT/A | Metabiologics | Opzionale, richiesto solo per scopi di standardizzazione e quantificazione | |
| Piastre nere, a fondo piatto a 96 pozzetti Le | NUNC | 237105 | non devono essere trattate |
| Nastro sigillante per piastre a 96 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 15036 |
Riferimenti
- Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
- Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
- Montal,....
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Ristampe e permessi
