Nanofibre ECM proteine ​​e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

Summary

Un metodo per ottenere nanofibre e nanostrutture complesse da proteine ​​singole o multiple della matrice extracellulare è descritto. Questo metodo utilizza interazioni proteina-superficie per creare materiali a base di proteine-free-standing con la composizione sintonizzabile e l'architettura per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) nei tessuti è sintetizzato e assemblato da cellule formano un fibrillare 3D, rete proteina strettamente regolata con diametro delle fibre, composizione e organizzazione. Oltre a fornire supporto strutturale, le proprietà fisiche e chimiche del ECM svolgono un ruolo importante in diversi processi cellulari tra cui l'adesione, la differenziazione e apoptosi. In vivo, l'ECM è assemblato esponendo criptico autoassemblaggio (fibrillogenesi) siti all'interno di proteine . Questo processo varia per diverse proteine, ma fibronectina (FN) fibrillogenesi è ben caratterizzato e serve come sistema modello per il montaggio ECM cellulo-mediata. In particolare, le cellule utilizzano i recettori delle integrine sulla membrana cellulare per legare dimeri FN e le forze contrattili actomyosin generati a spiegare ed esporre siti di legame per il montaggio in fibre insolubili. Questo processo mediata dal recettore permette alle cellule di assemblare e organizzare la ECM dal cellulare alla SCA Tissueles. Qui, vi presentiamo un metodo denominato assembly superficie avviato (SIA), che riassume l'assemblaggio matrice cellulo-mediata tramite interazioni proteina-superficie a svolgersi proteine ​​ECM e li assemblano in fibre insolubili. In primo luogo, le proteine ​​ECM sono adsorbiti su un polidimetilsilossano idrofobo (PDMS), superficie dove si parte snaturano (spieghi) ed espongono domini di legame criptici. Le proteine ​​ripiegate vengono poi trasferiti in ben definite micro-e nanostrutture attraverso la stampa microcontact su un poli termoreattiva (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) di superficie. Dissoluzione termicamente attivato il PIPAAm conduce al montaggio finale e il rilascio di nanofibre proteiche insolubili ECM e nanostrutture con geometrie ben definite. Architetture complesse sono possibili ingegneria definiti modelli sulle PDMS timbri utilizzati per la stampa microcontact. Oltre a FN, il processo SIA può essere utilizzato con laminina, fibrinogeno e collagene di tipo I e IV creare multicomponente ECM nanostrucTures. Così, SIA può essere utilizzato per progettare ECM materiali a base di proteine ​​con un preciso controllo della composizione proteica, geometria fibre e architettura scaffold per ricapitolare la struttura e la composizione della ECM in vivo.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) nei tessuti è composto di proteine ​​multifunzionali coinvolte nella regolazione chimici e fisici di processi cellulari multiple comprendenti adesione, proliferazione, differenziazione e apoptosi ^1-3. L'ECM è sintetizzato, assemblato, e organizzato dalle cellule e le fibrille proteiche costituenti hanno composizioni uniche, dimensioni delle fibre, geometrie e architetture interconnesse che variano con il tipo di tessuto e stadio di sviluppo. Studi recenti hanno dimostrato che l'ECM può fornire indicazioni istruttive per guidare le cellule a formare tessuti ingegnerizzati ^4, suggerendo che ricapitolando l'ECM in termini di composizione e struttura potrebbe consentire lo sviluppo di materiali biomimetici per applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.

Un certo numero di metodi di fabbricazione sono stati sviluppati per ingegnerizzare supporti polimerici che possono mimare aspetti della ECM nei tessuti. Ad esempio, elettrospinning e fase SEPARzione hanno entrambi dimostrato la capacità di formare matrici porose di fibre con diametri da decine di micrometri fino a decine di nanometri ^5-7. Entrambe le tecniche hanno anche dimostrato che matrici altamente porosi di nanofibre possono supportare l'adesione cellulare e l'infiltrazione nel impalcatura ^8. Tuttavia, questi approcci sono limitati nelle possibili geometrie fibre, orientamenti e 3D architetture che possono essere creati. Electrospinning produce tipicamente ponteggi con fibre orientate sia casuale o altamente allineati, mentre la separazione di fase produce ponteggi a fibre orientate in modo casuale. Vi sono inoltre limitazioni sui materiali, con i ricercatori in genere utilizzando polimeri sintetici, come poli (ε-caprolattone) ⁸ e acido poli (lattico-co-glicolico) ^9, che vengono successivamente rivestite con proteine ​​ECM per promuovere l'adesione cellulare. Biopolimeri naturali sono anche utilizzati, tra cui collagene di tipo I ^10, gelatina ^11, fibrinogeno ^12,chitosano ^{13, 14} e seta, ma rappresentano solo un piccolo sottoinsieme di proteine ​​trovate in tessuto nativo. La maggior parte dei tessuti contengono un grande ambiente di proteine ​​ECM e polisaccaridi inclusi fibronectina (FN), laminina (LN), collagene di tipo IV e acido ialuronico che sono difficili o impossibili da realizzare nanofibre con metodi esistenti.

Per affrontare questa sfida, abbiamo concentrato i nostri sforzi di ricerca sul imitando il modo in cui le cellule sintetizzano, assemblare e organizzare le fibrille della proteina ECM nel loro ambiente. Mentre il processo fibrillogenesi specifico varia per differenti proteine ​​ECM, tipicamente un cambiamento conformazionale nella molecola proteica ECM è attivata da un enzimatica o interazione recettore-mediata, che espone siti autoassemblaggio criptici. Qui usiamo FN come sistema modello per comprendere meglio il processo di fibrillogenesi. Brevemente, omodimeri FN legano ai recettori di integrina sulla superficie cellulare tramite la sequenza amminoacidica RGD nel 10 tipo IIRipeto unità. Una volta legato, le integrine si allontanano via actomyosin contrazione e si sviluppano i dimeri FN per esporre siti di self-assembly criptici. L'esposizione di questi siti di legame FN-FN permette ai dimeri FN per assemblare in un fibrille insolubili proprio sulla superficie cellulare ^15. Lavori in sistemi cell-free ha dimostrato che criptici siti di legame FN-FN possono essere rivelati tramite dispiegarsi con denaturanti ¹⁶ o tensione superficiale a un-liquido-solido aria interfaccia ^17-19. Tuttavia, le fibre FN creata di queste tecniche sono limitate a dimensioni e geometrie fibre specifiche e sono tipicamente legati ad una superficie.

Qui si descrive un chiamato assieme superficie avviato approccio (SIA) ²⁰ che supera queste limitazioni utilizzando interazioni proteina-superficie per creare posa libera nanofibre insolubili, nanofabrics (fogli 2D) e altre nanostrutture composte da proteine ​​ECM singoli o multipli (Figura 1 ). In questo process, proteine ​​ECM vengono assorbiti da un compatto, conformazione globulare in soluzione e parzialmente denaturato (piegato) su una fantasia, polidimetilsilossano idrofobo (PDMS) timbro. Le proteine ​​ECM vengono poi trasferiti in questo stato su un poli termoreattiva (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) superficie attraverso microcontact stampa ^22. Quando idratato con acqua 40 ° C la PIPAAm rimane un solido, ma quando raffreddato a 32 ° C che passa attraverso una temperatura di soluzione critica inferiore (LCST) dove diventa idrofila, si gonfia con acqua e poi si dissolve, rilasciando le nanostrutture ECM assemblati off di la superficie. Il metodo SIA consente di controllare le dimensioni con precisione su scala nanometrica. Controllando parametri chiave quali la composizione, geometria fibra, e l'architettura, è possibile ricapitolare molte proprietà della ECM trovati in vivo e di sviluppare scaffold avanzate per applicazioni di ingegneria tissutale e biotecnologia.

Protocol

1. Fabbricazione del Maestro Mold Uso Fotolito

1. Le nanofibre proteiche ECM, nanofabrics e nanostrutture per essere fabbricati vengono prima progettati utilizzando Computer Aided Design (CAD). Questo file CAD viene trasferito in una fotomaschera. Il tipo di fotomaschera dipenderà dalla risoluzione delle caratteristiche; con una fotomaschera a base di trasparenza, adeguata per dimensioni caratteristiche fino a ~ 10 micron. Piccole caratteristiche <10 micron richiederà un cromata su fotomaschera vetro. Tutte le nanofibre e nanostrutture qui presentati sono stati fabbricati utilizzando un fotomaschera base di trasparenza, e quindi erano su scala nanometrica in spessore, ma le dimensioni non laterali.
   Nota: È importante distinguere quali regioni del fotomaschera sarà buio (impedire alla luce UV per passare attraverso) e che sarà trasparente (permettono alla luce di passare attraverso UV) come questo, insieme con il tipo di photoresist (positivo o negativo) , detterà la topografia finale dello stampo master.
2. Per iniziare la fabbricazione dello stampo maestro, disidratare un wafer 4 "silicio ponendolo su piastra riscaldante impostato a 150 ° C per 15 min.
3. Centrare il wafer sul mandrino vuoto di uno spin-verniciatura. Versare SU8-2015 fotoresist negativo sul centro del wafer e continuare versando in cerchi concentrici fino a circa due terzi del wafer è coperto.
   Nota: conservare la bottiglia di SU8 vicino al wafer quando si versa per ridurre al minimo la formazione di bolle.
4. Programmare il spincoater come segue:
   • Ciclo di diffusione: 500 rpm con una accelerazione di 100 giri / sec per 10 sec.
   • Centrifuga: 4.000 rpm con una accelerazione di 100 giri / sec per 30 sec.
   Nota: Questa ricetta spincoating formerà uno strato di fotoresist che è ~ 10 pm di spessore. Modificando la velocità di centrifuga o la formulazione SU8, lo spessore può essere regolata.
5. Morbido cuocere il wafer ponendolo su piastra riscaldante impostato a 95 ° C per 3 min.
6. Esporre il wafer con luce UV attraversola fotomaschera per un dosaggio totale di 140 mJ / cm ^2.
   Nota: SU8 è un photoresist negativo dunque regioni in cui la luce UV è in grado di passare attraverso il photomask rimarranno dopo lo sviluppo e diventare funzioni poste sullo stampo master.
7. Posta esposizione cuocere il wafer ponendolo su piastra riscaldante impostato a 95 ° C per 4 min.
8. Sviluppare il wafer ponendolo in autore SU8 per 3 min. Dopo 3 minuti, risciacquare il wafer con alcol isopropilico. Se un film bianco viene prodotto durante il risciacquo, la cialda non è completamente sviluppato e dovrebbe essere riposto nello sviluppatore per altri 30 sec. Risciacquare con alcol isopropilico. Ripetere questo processo fino a quando un film bianco non si forma durante il risciacquo alcool isopropilico.
9. Essiccare il wafer in un flusso di azoto e posto in una capsula di Petri da 150 mm a proteggere dalla polvere.

2. Rendere i PDMS Stamps

1. Preparare il prepolimero PDMS combinando la base elastomero e induritore in un10:01 w rapporto / w. Tipicamente 80 g di base e 8 g di induritore vengono utilizzati per garantire il PDMS sufficienti a coprire lo stampo master in uno strato di 1 cm di spessore.
2. Mescolare e degassarla PDMS utilizzando un mixer centripeta impostare la seguente:
   • Mix: 2,000 rpm per 2 minuti
   • Degas: 2,000 rpm per 2 min.
3. Se un mixer non è disponibile mescolare i PDMS a mano per 10 minuti utilizzando un 10 ml pipetta sierologica. Degassarla miscela ponendolo in un essiccatore sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle.
4. Versare abbastanza prepolimero PDMS sullo stampo master (modellato wafer di silicio) per formare uno strato di 1 cm di spessore. Curare le PDMS dalla cottura a 65 ° C per 4 ore oa temperatura ambiente per 48 ore.
5. Una volta indurito, Le regioni contenenti i modelli possono essere tagliate per formare le PDMS francobolli. Per distinguere il lato funzione dal retro del timbro PDMS, tagliare una tacca su uno degli angoli sul retro del timbro.

3. Microcontatto Printing Patterns ECM

1. Pulire coprioggetto 25 millimetri di vetro del diametro di sonicazione in etanolo al 95% per 1 ora e poi asciugare in forno a 65 ° C.
2. Preparare la soluzione sciogliendo PIPAAm PIPAAm in 1-butanolo ad una concentrazione del 10% (w / v, tipicamente 1 g in 10 ml).
3. Centrare vetrino coprioggetti sulla morsa a vuoto dei spincoater e pipetta 200 microlitri della soluzione PIPAAm modo che l'intera superficie del vetro è coperta.
4. Spincoat il vetrino a 6.000 rpm per 1 min.
5. Pulire i PDMS Stamp mediante sonicazione in etanolo al 50% per 30 min e quindi asciugare sotto flusso di azoto.
   Nota: Asciugatura e passi successivi devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per mantenere la sterilità per le applicazioni in cui saranno utilizzati i nanostrutture ECM con le cellule.
6. Ricoprire la superficie modellata di ogni timbro PDMS con 200 ml di soluzione proteica, tipicamente 50 mg / ml in acqua distillata sterile per FN. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   Nota: Thè rivestimento volume è un timbro PDMS 1,5 centimetri ² e dovrà essere regolato a seconda delle dimensioni del timbro PDMS, la proteina ECM utilizzato e la concentrazione della proteina ECM in soluzione.
7. Lavare i PDMS francobolli in acqua distillata per rimuovere l'eccesso di proteine ​​e asciugare accuratamente sotto un flusso di azoto.
   Nota: L'acqua a sinistra sul timbro attiverà lo scioglimento prematuro del rivestimento PIPAAm sul vetrino ed impedire il corretto trasferimento delle proteine.
8. Per la fabbricazione sterile, posizionare i coprioggetti PIPAAm rivestite all'interno di una scatola di Petri chiusa e sterilizzare con l'esposizione ai raggi UV, 45 minuti sotto la luce UV in un armadio biosicurezza è sufficiente. Se non è richiesta la sterilità questo passaggio può essere omesso.
9. Eseguire la stampa microcontact posizionando il lato caratteristica del timbro PDMS in contatto con il coprioggetto PIPAAm rivestite. Se necessario, utilizzare pinze per toccare leggermente sul retro dei francobolli per rimuovere eventuali bolle d'aria e assicurare il contatto uniforme.
10. Dopo 5 kmn, staccare il timbro PDMS dal vetrino.
11. In questa fase, proteine ​​ECM aggiuntivi possono essere configurate in modo da creare strutture più complesse e multicomponenti. Fino a 3 stampe sono state verificate per lavorare con questo processo, e più può essere fattibile.

4. Rilascio di ECM nanofibre e Nanostrutture

1. Posizionare il vetrino rivestito PIPAAm modellato in una capsula di Petri 35 millimetri e controllare la fedeltà del modello usando la microscopia a contrasto di fase. A seconda del modello, una camera CCD può essere necessario risolvere le caratteristiche del modello. Microscopia a fluorescenza può anche essere utilizzato per controllare il pattern ottenute le proteine ​​ECM sono fluorescente.
2. Aggiungere 3 ml di acqua distillata a 40 ° C per capsula di Petri e consentire all'acqua di raffreddare gradualmente.
3. La dissoluzione dello strato PIPAAm e il rilascio dei modelli proteici ECM possono essere monitorati con microscopio a contrasto di fase. Se l'applicazione non consente l'utilizzo di tec otticahniques, il rilascio può essere monitorato misurando la temperatura della soluzione. Tipicamente, l'acqua viene raffreddata a temperatura ambiente, ben al di sotto di LCST PIPAAm (32 ° C), per garantire le nanostrutture proteiche ECM sono stati rilasciati.
4. Dopo il rilascio, le nanofibre, nanofabrics e altre nanostrutture sono galleggianti in acqua. Per usarli per ulteriori applicazioni hanno bisogno di essere manipolato. L'approccio esatto dipenderà dell'obiettivo sperimentale e può includere passaggi come immobilizzare su un'altra superficie, muovendosi con un sistema micromanipolatore o incorporare in un idrogel.

Results

SIA è in grado di ingegneria ECM nanofibre proteiche con un controllo preciso sopra le dimensioni di fibre. Per dimostrare questo, matrici di nanofibre FN con dimensioni planari di 50 x 20 micron sono stati modellati su un vetrino PIPAAm rivestita (Figura 2A). Al rilascio, le fibre contratte perché erano sotto un pre-sollecitazione inerente quando modellata sulla superficie PIPAAm (Figura 2B). Analisi delle nanofibre FN ha rivelato che erano monodispersa pre-release, con una lunghezza m...

Discussion

Il metodo SIA presentato qui imita assemblaggio matrice cellulo-mediata e consente la progettazione di ECM nanofibre proteiche e nanostrutture con dimensioni sintonizzabile, l'organizzazione e la composizione. Anche se non identica alla ECM cellule generate, SIA crea ECM composto da nanoscala fibrille della proteina ²⁰ che subiscono piegatura reversibili / spiegamento durante sollecitazioni meccaniche ²¹ e possono legarsi cellule ^20. Ciò fornisce una capacità unica di costruire ECM m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poli(N-isopropilacrilammide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40.000 Mw
Sylgard 184 Kit di silicone (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 parti di base con 1 parte di agente indurente.
Butanolo
Fibronectina	BD biosciences	354008	Umano, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrapuro, topo,
1mg Negativo Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Sviluppatore	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Miscelatore	Thinky Corporation
Spincoater	Sistemi di rivestimento speciali	G3P-8
Coperchio in vetro diametro 25 mm, n. 1,5	Fisher Scientific	12-545-86