Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante C. elegans Embriogenesi

Sommario

Questo protocollo descrive come immagine divisione delle cellule all'interno di un tessuto in Caenorhabditis elegans embrioni. Mentre diversi protocolli descrivono come la divisione cellulare l'immagine in embrione precoce, questo protocollo viene descritto come immagine divisione cellulare all'interno di un tessuto in via di sviluppo durante la metà tarda embriogenesi.

Abstract

Questo protocollo descrive l'uso di microscopia a fluorescenza a immagine divisione delle cellule all'interno di sviluppare Caenorhabditis elegans embrioni. In particolare, questo protocollo si concentra su come un'immagine dividendo neuroblasti, che si trovano sotto le cellule epidermiche e possono essere importanti per epidermico morfogenesi. Formazione di tessuto è cruciale per lo sviluppo metazoi e si basa su stimoli esterni da tessuti vicini. C. elegans è un ottimo organismo modello per studiare morfogenesi dei tessuti in vivo a causa della sua trasparenza e semplice organizzazione, rendendo i tessuti facile da studiare tramite microscopia. Contenitore ventrale è il processo in cui la superficie ventrale dell'embrione è coperto da un singolo strato di cellule epiteliali. Questo evento è pensato per essere facilitato dai neuroblasti sottostanti, che forniscono spunti di orientamento chimica di mediare la migrazione delle cellule epiteliali sovrastanti. Tuttavia, i neuroblasti sono altamente proliferative, oppure possono agirecome substrato meccanico per le cellule epidermiche ventrali. Gli studi che utilizzano questo protocollo sperimentale potrebbe scoprire l'importanza della comunicazione intercellulare durante la formazione del tessuto, e potrebbero essere utilizzati per rivelare i ruoli dei geni coinvolti nella divisione cellulare nei tessuti in via di sviluppo.

Introduzione

Mentre ci sono protocolli che descrivono come la divisione cellulare immagine nei primi C. elegans embrione, questo protocollo viene descritto come la divisione cellulare l'immagine all'interno di un tessuto durante la metà embriogenesi. Una delle principali sfide nel campo dell'imaging organismi in fase di sviluppo è stata la loro sensibilità alla fototossicità. Tuttavia, una maggiore accessibilità alle filatura microscopio confocale disco o microscopi campo spazzato ha permesso applicazioni di imaging più diffuse. Entrambi i sistemi utilizzano laser a stato solido e luce diffusa, limitando i livelli di UV che gli organismi sono esposti. Tuttavia, stand widefield possono ancora essere utilizzati per l'imaging in vivo, soprattutto se è provvisto di telecamere ad alta sensibilità (ad esempio EMCCD), controllo di apertura e di controllo della luce (ad esempio LED o lampade al mercurio regolabili). Questo protocollo descrive come utilizzare sia un sistema confocale o basato su un sistema widefield di divisione cellulare immagine all'interno di sviluppo C. elegans </ Em> embrioni. A titolo di esempio, descriviamo come immagine divisione cellulare neuroblasti. Neuroblasti possono facilitare epidermica morfogenesi fornendo segnali chimici o meccanici per le cellule epidermiche sovrastanti, e fornire un eccellente esempio dell'importanza della comunicazione intercellulare nella formazione dei tessuti.

Caenorhabditis elegans è un organismo modello ideale per studi basati microscopia essendo trasparente e semplice organizzazione tessuto ^1. Inoltre, C. elegans è suscettibile di metodi genetici e RNAi, e dal momento che molti dei suoi geni hanno omologhi umani, può essere utilizzato per identificare i meccanismi conservati per formazione di tessuto ^2-5. In C. elegans, la formazione dell'epidermide avviene in media embriogenesi, quando l'embrione ha> 300 cellule. Epidermal morfogenesi consiste di diverse fasi principali, durante il quale l'embrione è racchiuso in uno strato di cellule epidermiche che restringono e si estendono per trasformare il embryo da una forma ovoidale nella forma allungata di una vite senza fine ^6. Contenitore ventrale descrive uno di questi eventi morfogenetici, quando le cellule epidermiche ventrali migrano verso la linea mediana ventrale per coprire la superficie ventrale dell'embrione (Figura 1). In primo luogo, due coppie di anteriori situato cellule Leading Edge migrano verso la linea mediana ventrale, dove aderiscono e si fondono con i loro vicini controlaterale ^6. Questa è seguita da migrazione delle cellule posteriori situato tasca, che formano cuneo come forme creando una tasca ventrale ^6-7. Il meccanismo che chiude la tasca non è ben compreso. Una possibilità è che una struttura di actina miosina contrattile sovracellulari lega le cellule tasca insieme in una stringa di borsa come la moda, simile alla guarigione delle ferite ^8. È interessante notare che la migrazione di alcune delle cellule tasca è mediata da specifici sottoinsiemi di neuroblasti sottostanti ⁹ (precursori neuronali che si trovano sotto il epidermis; Figura 1B).

Studi precedenti hanno mostrato che i neuroblasti regolano ventrale migrazione delle cellule epidermiche e contenitore ventrale. VAB-1 (recettore Ephrin) e VAB-2 (Ephrin ligando) sono altamente espresso nei neuroblasti e facilitare lo smistamento delle anteriori e posteriori neuroblasti uno dall'altro, e mutazioni nel VAB-1 o VAB-2 causa custodia ventrale fenotipi ^10-13. Tuttavia, gli esperimenti di soccorso Promotore mostrato che è richiesta anche VAB-1 nelle sovrastanti cellule epidermiche ventrali e recettori per altri segnali di orientamento secreti dai neuroblasti sono espressi nelle cellule epidermiche ventrali ^9. Anche se le mutazioni in nessuno di questi recettori causano fenotipi recinzione ventrale, non è chiaro se i difetti sorgono a causa di problemi nel posizionamento neuroblast o dovuti a mancanza delle cellule epidermiche ventrale per rispondere alle linee guida spunti ^14. Alterare la divisione dei neuroblasti wiThout alterano la capacità di secernere spunti di orientamento potrebbe far luce sul ruolo dei neuroblasti e la loro capacità di fornire un contributo meccanica durante la morfogenesi epidermica. Recentemente, è stato scoperto che un gene divisione cellulare, ani-1 (anillin) è altamente espresso in neuroblasti (Figura 2A) e il suo esaurimento causa difetti divisione neuroblasti. È interessante notare che questi embrioni mostrano ventrali fenotipi di recinzione (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate).

Anillin è necessaria per la divisione cellulare, e in particolare per citochinesi, che descrive il processo in cui una cellula madre si divide fisicamente in due cellule figlie. Citochinesi è guidato dalla formazione di un anello contrattile actomyosin, che deve essere strettamente controllato nello spazio e nel tempo per assicurare che esso sia correttamente accoppiato con cromatidi fratelli segregazione. Il principale regolatore della citochinesi metazoi è RhoA (RHO-1 in C. elegans), una piccola GTPasi che è unctive nella sua forma GTP-bound. Il GEF Ect2/ECT-2 attiva RhoA, dopo di che RhoA-GTP interagisce con effettori a valle che formano l'anello contrattile e mediano suo ingresso di ^15. Anillin è una proteina che si lega a più dominio di RhoA tramite il suo C-terminale e di actina e miosina attraverso il suo N-terminale. Anillin è necessario per stabilizzare la posizione dell'anello contrattile in cellule di mammifero o Drosophila S2 ^16. Anillin esaurimento provoca anelli contrattili a subire oscillazioni laterali, e cytokinesis alla fine non riesce formando cellule multinucleate ^17-19. Curiosamente, sebbene C. elegans ani-1 Coordinate actomyosin contrattilità in embrione precoce, ma non è essenziale per la citochinesi. Tuttavia, come sopra descritto, è necessario ani-1 per neuroblast citochinesi durante la metà embriogenesi (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate). Fallimento Citocinesi altererebbe il numero e la posizione dei neuroblasti e potrebbe influenzare il loczione dei segnali di orientamento chimici, o potrebbe alterare le proprietà meccaniche del tessuto. Entrambi i modelli evidenziano il ruolo non autonomo di neuroblasti per custodia ventrale, e l'importanza della comunicazione tessuto dei tessuti durante lo sviluppo embrionale.

Questo protocollo sperimentale descritto come la divisione cellulare immagini durante la C. elegans metà embriogenesi usando la microscopia a fluorescenza. La maggior parte degli esperimenti che studiano i meccanismi di divisione cellulare sono stati eseguiti in singole cellule all'interno piastre di coltura (per es. HeLa o cellule S2) o in embrioni precoci con un numero limitato di cellule (ad esempio C. elegans embrione unicellulare, Xenopus, o echinoderm embrioni). Tuttavia, è importante studiare la divisione cellulare nei tessuti, in quanto vi sono segnali esterni che possono influenzare la sincronizzazione e il posizionamento del piano di divisione. Inoltre, le cellule possono fornire segnali chimici o meccanici di influenzare lo sviluppo del tessuto limitrofos, ed è importante capire come la comunicazione intercellulare aiuta a formare tessuti durante lo sviluppo.

Protocollo

1. Preparazione di piatti per il mantenimento Ceppi Worm and Performing RNAi

1. Piatti nematode crescita media
   1. Piatti
      1. Preparare piatti Nematode crescita media (NGM) per mantenere i ceppi di vermi e di eseguire incroci genetici. Combinare 3 g NaCl, 17 g Agar e 2,5 g BactoPeptone con 1 L di acqua distillata in un pallone da 2 L e aggiungere un agitatore metallo.
      2. Autoclavare il pallone per sciogliere l'agar e per sterilizzare media. Quindi mettere il pallone su un piatto mescolare e lasciare che i supporti raffreddare mescolando.
      3. Una volta che il supporto è raffreddato ed è ancora piuttosto caldo al tatto (45-50 ° C), aggiungere 1 ml di 1 M CaCl _2, 1 ml di 1 M _MgSO4, soluzione 1 ml di colesterolo 5 mg / ml e 25 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (PPB; ricetta nella tabella dei reagenti / materiali; filtro sterilizzare soluzioni madre) e versare immediatamente i mezzi di comunicazione in piccole piastre di Petri (60 mm x 15 mm, riempite i piatti ~ 3/4 verso l'alto o 13 ml / piastra USIng un distributore automatico). Nota: Per la manutenzione a lungo termine di alcuni ceppi tetraciclina può essere aggiunto alle piastre (12,5 mcg / ml) per consentire TN10 trasposone inattivazione del gene batterico RNAsi III.
      4. Lasciate che i media solidificano notte a temperatura ambiente. Nota: Le piastre devono essere conservati in una cappa biologica o in un'area di laboratorio che è meno soggetto a contaminazione. Inoltre, rimuovere l'eventuale condensa che ha costruito sui coperchi (ad es pulite con la carta velina) per limitare la contaminazione fungina. Se Tetracycline è aggiunto anche alle piastre, poi coprire con un foglio di alluminio come questo antibiotico è sensibile alla luce.
      5. Il giorno successivo, seminare le piastre NGM secco con una sospensione di E. coli (ceppo OP50, vedi punto 1.1.2) che è stato gentilmente in agitazione. Per rendere piastre per accoppiamento, aggiungere ~ 50 ml di OP50 al centro di ciascuna piastra (per formare un piccolo cerchio). Per fare le piastre per il mantenimento ceppi di vermi, seminare ogni piatto NGM con ~ 100-200 ml di OP50 (agarantire che copre una grande area della piastra).
      6. Lasciare le piastre seminate O secco / N a temperatura ambiente.
      7. Il giorno successivo, girare le piastre NGM secchi a testa in giù e impilarli in contenitori di plastica a 4 ° C. Nota: Le piastre sono utilizzabili fino a circa 3-4 settimane. Piastre contenenti tetraciclina devono essere tenuti all'oscuro.
   2. Cibo
      1. Utilizzare E. coli OP50 [dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] come fonte di cibo per C. . elegans Nota: OP50 può essere memorizzato come gli stock di glicerolo a -80 ° C (rapporto 1:1 nel 50% v / v glicerolo).
      2. Per rendere OP50 per le piastre NGM, fare un piatto realizzato con una piccola aliquota di stock di glicerolo (<10 ml, usare un puntale sterile). Stendere i batteri su una piastra di agar LB (ricetta nella tabella dei reagenti / materiali) e lasciare a 37 ° C per ~ 16 ore. Nota: Se ci sono problemi di contaminazione, streptomicina OP50 resistente può essere utilizzato, unnd streptomicina può essere aggiunto alle piastre di LB agar (50 mcg / ml).
      3. Il giorno seguente, scegliere la singola colonia e inoculare 100 ml di media LB liquido (ricetta nella tabella di reagenti / materiali) in un pallone da 500 ml.
      4. Lasciate che la cultura crescere O / N a 37 ° C con agitazione.
      5. Il giorno successivo, utilizzare la sospensione batterica per la semina piastre NGM. Nota: OP50 può essere aliquotati in 50 ml provette coniche e conservato a 4 ° C per ~ 4-6 settimane.
2. RNAi
   L'alimentazione è uno dei principali modi per eseguire RNA interferenza mediata (RNAi, per atterramento di un prodotto specifico gene) in C. elegans. C. ermafroditi elegans possono essere alimentati E. coli ceppo HT115 trasformato con un vettore che esprime alimentazione dsRNA dopo induzione. Questo dsRNA (o suoi frammenti) vengono trasmessi alla gonade, solitamente con conseguente sostanziale knockdown del gene bersaglio specifico.
   1. Piatti RNAi
      1. Preparare piastre NGM come descritto sopra (si veda la Sezione 1.1.1), ma anche aggiungere 1 ml di 1 M IPTG (isopropiltio-beta-D-galattoside, per indurre l'espressione di dsRNA) e 500 ml di 50 mg / ml ampicillina (amp; vettori che esprimono dsRNA sono Amp resistente) ai media caldo (45-50 ° C).
      2. Dopo che le piastre si sono asciugati, li seminare con ~ 50-100 ml di E. coli HT115 (cfr. sezione 1.2.2). Nota: le piastre testa di serie possono essere conservati a 4 ° C per ~ 4-5 settimane.
      3. Lasciate le piastre seminate asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
      4. Il giorno successivo, girare i piatti RNAi secchi a testa in giù e conservarli in un contenitore di plastica a 15-20 ° C. Nota: le piastre Prioritari conservano l'efficienza RNAi per un massimo di ~ 2-3 settimane.
   2. RNAi alimentare
      1. Utilizzare E. coli HT115 (dal CGC, vedi punto 1.1.2) trasformato con il vettore L4440 alimentazione, o L4440 contenente cDNA di un gene di interesse. Nota: Alimentazione librerie che colpiscono la maggioranza delle cornici di lettura aperte nel genomasono già stati fatti e sono disponibili (cloni L4440 trasformati in HT115, contenenti ad esempio un frammento di Y49E10.19 per ani -1 ^20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / pagine / rnai.html). Nota: HT115 può essere conservato come stock di glicerolo a -80 ° C (rapporto 1:1 nel 50% v / v glicerolo).
      2. Per generare un nuovo costrutto mira un gene di interesse, vedere la mappa vettoriale L4440 e clone di cDNA tra i promotori T7 di accompagnamento, che sono inducibile da IPTG.
      3. Trasforma HT115 con il costrutto L4440 utilizzando un protocollo standard per la trasformazione (ad esempio, rendere i batteri chimicamente competenti ed eseguire calore scossa di trasformazione).
      4. Come descritto per OP50 (vedi Sezione 1.1.2), i batteri striscia dal magazzino glicerolo su una piastra di agar LB, ma il piatto dovrebbe contenere anche 50 ug / ml di ampicillina. Nota: Se si utilizza un pre costrutto L4440 esistente, saltare sezioni 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Scegli una singola colonia e inoculare 5 mldi LB supporti contenenti 5 ml di ampicillina da un / magazzino ml 50 mg (LB Amp), e posizionarlo a 37 ° C con agitazione.
      6. Dopo circa 16 ore, inoculare 5 ml di LB fresco supporti Amp con 50 microlitri della coltura O / N e crescere la coltura per 7-8 ore con agitazione a 37 ° C.
      7. Centrifugare i batteri per 1 min a 4.000-8.000 xg, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di fresca mezzi LB Amp.
      8. Utilizzare questa soluzione batterica per seminare le piastre RNAi come descritto in precedenza (vedi punto 1.2.1). Nota: HT115 deve essere utilizzato immediatamente e non deve essere conservato.

2. Coltivare ceppi Worm

Mantenere C. ceppi elegans ordinati dal CGC su piastre NGM secondo protocollo standard ^1. I ceppi utilizzati per questo protocollo sono: C. elegans var Bristol, wild-type (ID ceppo a CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [ham-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + unc-119 (+)] (ID deformazione alla CGC OP102); unc-119 (ED3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (ID deformazione alla CGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (ID deformazione alla CGC SU159); unc-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (ID deformazione alla CGC FT250).

1. Scegli ~ 3 giovani ermafroditi adulti che mostrano il fenotipo corretto per un piatto NGM fresca. Nota: N2 (var. Bristol; wild-type) può essere mantenuta tra 15-25 ° C, ma raggiungono densità più velocemente a temperature più elevate. Nuove scorte devono essere effettuate quando la densità worm è alto.
2. Conservare tutti i ceppi fluorescenti (es. GFP e / o worm mCherry esprimono) a 20-25 ° C per l'espressione ottimale di proteine ​​fluorescenti. Nuove scorte devono essere effettuate quando la densità worm è alta e il cibo è bassa.
3. Per scegliere i vermi, utilizzare unaccompagnamento fatto da una pipetta di vetro tirato con un filo di platino fuso alla fine tirato (~ 3-5 cm di lunghezza). Appiattire il filo con un bordo liscio. Utilizzare il pick per 'paletta' fino ermafroditi e trasferirli su nuovi piatti. Fiamma il filo tra l'uso per evitare la contaminazione incrociata dei ceppi.

3. RNAi

1. Esecuzione di RNAi
   1. In primo luogo, posto ~ 8 ermafroditi L4 su un piatto NGM testa di serie per ~ 30-60 min per rimuovere i batteri OP50 dai vermi.
   2. Poi posto le 8 ermafroditi su una piastra NGM Amp IPTG seminato con HT115 che porta il plasmide L4440 esprimere dsRNA ad un gene di interesse (ad esempio, ani-1;. Vedi 1.2) per ~ 24 ore. Nota: A seconda del gene di interesse, o dei fenotipi desiderati (che può dipendere dalla forza del knockdown), worm possono essere lasciati sui piatti RNAi per periodi di tempo più o meno lunghi (dopo 24 ore, posizionare gli ermafroditi su RNAi fresco piastre).
   3. Per un negcontrollo ative, posto vermi su un piatto di RNAi seminati con HT115 che trasporta la L4440 vettore vuoto. Nota: Questi embrioni dovrebbero avere fenotipi.
   4. Per un controllo positivo, collocare vermi su una piastra RNAi esprimendo dsRNA che mira ad un gene con fenotipi ben caratterizzati. Nota: Per rho-1 (Y51H4A.3), gli embrioni sono al 100% letali dopo 24 ore e ermafroditi sono sterili dopo 48 ore.
2. RNAi Efficacia
   I livelli di knockdown di RNAi devono essere testati, soprattutto perché alcuni tessuti possono essere più resistenti di altre. Durante la prima metà di embriogenesi, la maggior parte dei tessuti sono RNAi-sensibili, ma nel tardo embrione o larva, i neuroni sono RNAi-resistenti. Ceppi diversi possono essere usati per migliorare la sensibilità RNAi (es RRF-3), o per generare tessuto-specifico RNAi (es sid-1 in combinazione con un transgene espresso dal promotore neurale unc-119).
   1. Western blotting
      Immunoblotting utilizzando C. elegans proteine ​​possono essereeseguiti secondo il protocollo standard ^22.
      1. Dopo aver eseguito RNAi, raccogliere ~ 10 gravido (riempito di embrioni) ermafroditi in una provetta, aggiungere 20-30 microlitri 1x tampone campione SDS-PAGE e lyse facendo bollire per ~ 2 min. Allo stesso modo, raccogliere i vermi N2 in un tubo separato per il campione di controllo. Nota: Il numero di ermafroditi può variare a seconda della sensibilità degli anticorpi primari.
      2. Creare diluizioni del campione di controllo (ad esempio 3-100%) in tampone campione. Caricare il controllo e campioni RNAi e gestito da SDS-PAGE secondo la procedura standard (il gel% varierà a seconda delle dimensioni della proteina di interesse).
      3. Trasferire il gel ad una membrana ed eseguire immunoblotting secondo la procedura standard. Nota: Utilizzare diverse diluizioni di anticorpi primari e secondari come raccomandato per ogni anticorpo.
      4. Sviluppare (ad esempio, se si utilizza la chemiluminescenza) o la scansione (ad esempio, se si utilizza fluorescenza) il immunoblot e confrontare °e densità delle bande nelle corsie N2 vs corsia RNAi, e determinare il livello di knockdown (ad esempio la densità della corsia RNAi corrisponde alla corsia di controllo 12%, questo suggerisce che la proteina è ridotta del 88%). Nota: Per vedere l'efficienza del ANI-1 knockdown, vedere Maddox et al ^23.
   2. Immunostaining
      Immunostaining in C. elegans possono essere eseguiti secondo il protocollo standard di ^22.
      1. Dopo aver eseguito RNAi, raccogliere ermafroditi gravide ed embrioni raccolti utilizzando uno dei due metodi. Per uno dei metodi, posto ermafroditi in tampone M9 (ricetta nella tabella dei reagenti / materiali) in 1,5 ml siliconato provette da microcentrifuga e pellet tramite centrifugazione (1,000-4,000 xg). Nota: Analogamente raccogliere N2 ermafroditi gravide.
      2. Rimuovere la soluzione M9.
      3. Espellere embrioni aggiungendo 1 ml di soluzione di sbianca (1 M NaOH, 5% candeggina) alla provetta per 3 min. Allo stesso modo, candeggina N2 harmaphrodites per fare vetrini di controllo.
      4. Vortex delicatamente, quindi pellet subito gli embrioni tramite centrifugazione (4.000-8.000 xg) e rimuovere la soluzione sbiancante. Nota: Il tempo totale che i vermi sono incubati con candeggina non deve superare i 5 minuti.
      5. Lavare gli embrioni 3x con Tris Buffered Saline (TBS, 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) ed embrioni trasferire con una pipetta Pasteur di vetro su un poli-L-lisina rivestite vetrino da microscopio. Nota: Per ricoprire un vetrino da microscopio in vetro con poli-L-lisina, in primo luogo pulire la diapositiva, quindi aggiungere una goccia (~ 20-30 ml) di poli-L-lisina e distribuirlo in modo uniforme su tutta la superficie e lasciare asciugare. Per risultati ottimali, cappotto diapositive altre due volte. Un metodo alternativo per raccogliere embrioni (Sezioni 3.2.2.1-3.2.2.5) è quello di mettere una goccia di M9 su una poli-L-lisina rivestite vetrino da microscopio e prendere ~ 10 ermafroditi gravide nella goccia.
      6. Aggiungere un coprioggetto sopra l'vetrino da microscopio (per l'area che contiene la maggior parte degli embrioni) e postole diapositive in azoto liquido. Nota: Per ermafroditi collocati direttamente nella goccia, mettere pressione sul vetrino per rompere gli ermafroditi ed espellere gli embrioni.
      7. Freeze-rompere gli embrioni muovendo fuori i coprioggetti subito dopo congelamento in azoto liquido.
      8. Porre i vetrini in ghiaccio metanolo freddo per 20 minuti per fissare gli embrioni. Nota: Per alcuni antigeni, un fissativo reticolazione come paraformaldeide può essere preferibile. Vedere il protocollo da Duerr ^22.
      9. Reidratare e permeabilize gli embrioni lavando i vetrini 4x con Tris Buffered Saline contenente Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) per 10 minuti ciascuno.
      10. Asciugare ogni diapositiva intorno all'area che contiene la maggior parte degli embrioni e disegnare un cerchio intorno gli embrioni utilizzando una penna di blocco liquido (ad esempio pen PAP).
      11. Aggiungere ~ 100 ml di TBST con 5% di siero normale asino (NDS, blocco) per ogni diapositiva (area cerchiata) e incubare per20 min a RT. Nota: Porre i vetrini in una 'camera di bagnato' (ad esempio un piatto con un coperchio contenente asciugamani di carta bagnati).
      12. Rimuovere il blocco, aggiungere ~ 50-100 ml di anticorpi primari (diluito in TBST) per ogni diapositiva (area cerchiata) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Nota: A seconda della anticorpo, il tempo di diluizione e di incubazione può variare. Per rilevare GFP, usiamo un anticorpo primario anti-GFP anti-topo in una diluizione 1/200. Per rilevare ANI-1, usiamo un anti-ANI-1 anticorpo primario anti-coniglio in una diluizione 1/1600 (gentilmente offerto da Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Per tempi di incubazione più lungo, mettere i vetrini a 4 ° C.
      13. Rimuovere anticorpi primari (se possibile, conservare per uso futuro) e lavare i vetrini 3x con TBS per 5 minuti ciascuna.
      14. Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere ~ 50-100 ml di anticorpi secondari (diluito in TBST) per ogni diapositiva (area cerchiata) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Nota: a seconda dell'anticorpo, diluizione può variare. Per rilevare GFP, usiamo un unnti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo secondario in una diluizione 1/250. Per rilevare ANI-1, usiamo un anti-coniglio Alexa Fluor 568 anticorpo secondario in una diluizione 1/250.
      15. Rimuovere anticorpi secondari e lavare i vetrini 3x con TBS per 5 minuti ciascuno. Nota: Per colorare DNA, aggiungere ~ 50-100 ml di DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole; 1 mg / ml) a 1/500 di diluizione in TBST per 5 min.
      16. Rimuovere DAPI e lavare i vetrini 2x con TBS per 5 minuti ciascuna. Nota: Se DAPI colorazione non viene eseguita, ignorare questa fase di lavaggio in più.
      17. Eseguire un lavaggio rapido con 0.1M Tris (pH 9), togliere e aggiungere ~ 15 ml di mezzo di montaggio preriscaldata a 37 ° C (4% n-propile 3.4.5-trihydroxybenzoate (gallato di propile), Tris 50 mM, pH 9 50% glicerolo) a ciascun vetrino (area cerchiata).
      18. Aggiungere un vetrino di ogni diapositiva (sulla parte superiore del supporto di montaggio nella zona cerchiata), evacuare il liquido in eccesso e sigillare i vetrini con smalto. Nota: Le diapositive possono essere conservati a -20 ° C.
      19. Osservare gli embrioni sule diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza widefield o scansione laser confocale. Importante, regolare le impostazioni di raccogliere immagini di intensità ottimale dei pixel utilizzando il controllo (N2 o non RNAi) embrioni. Poi, raccogliere immagini da embrioni RNAi utilizzando le stesse impostazioni. Esempi di immagini raccolte per il controllo del rispetto ani-1 embrioni RNAi sono mostrati nella Figura 2B.

4. Preparazione di vetrini per Imaging Live e raccolta embrioni

1. Preparazione di pastiglie di agarosio per l'imaging dal vivo
   1. Posizionare un pulito, pre vetrino da microscopio riscaldato tra due vetrini, ciascuno con 1-2 strisce di nastro adesivo su di loro.
   2. Usando una pipetta Pasteur di vetro, aggiungere una goccia di 2% w / v agarosio (disciolto in acqua distillata riscaldata) alla slitta.
   3. Inserire rapidamente una seconda, pulito vetrino da microscopio in cima alla prima slitta in maniera perpendicolare ad appiattire la goccia di agarosio. Nota: Il nastro sulla vicina scivolòes fornisce lo spessore del pad.
   4. Lasciate che il pad agarosio secco per un 1-2 minuti prima di togliere la slitta superiore. Sfilare la slitta superiore con attenzione per evitare di rompere il pad agarosio sotto. Nota: A volte il pad viene trasferito alla slitta superiore ed è ancora utilizzabile, fintanto che rimane intatto.
   5. Trasferire gli embrioni sul pad agarosio entro pochi minuti dopo la sua preparazione come descritto di seguito (vedi punto 4.2). Nota: Il pad dovrebbe avere un aspetto opaco, una volta che è chiaro, è troppo secca per l'uso.
2. Embrioni di raccolta
   1. Utilizzare il seguente protocollo per raccogliere embrioni per l'imaging in tempo reale, che è derivata da Sulston et al. ²⁴
   2. Scegli circa 4-6 adulti gravide (non fame) da piastre NGM o RNAi e metterli in 20-30 ml di tampone M9 in un pozzo in una diapositiva depressione.
   3. Utilizzare un bisturi sterilizzato per tagliare i vermi su entrambi i lati del spermatheca (o in alternativa vicino alla vulva) perrilasciare embrioni nella soluzione.
   4. Utilizzare un tubo di gomma con un boccaglio collegato ad un capillare di vetro / pipetta tirato avere un piccolo foro e aspirare gli embrioni da pipette a bocca. In alternativa, raccogliere embrioni con un tubo di vetro capillare che è collegato a una pipetta Pasteur bulbo di gomma.
   5. Trasferire gli embrioni aspirati ad un secondo pozzo anche contenente tampone M9, per aiutarli a separare dai detriti worm.
   6. Poi, l'aspirazione degli embrioni su un blocchetto di agarosio preparato al momento (vedi punto 4.1).
   7. Embrioni ammassarsi usando un ciglio (incollato ad uno stuzzicadenti) per aumentare il numero di embrioni che possono essere filmate in una x, y aereo. Nota: Per evitare la privazione di ossigeno, non aggregano più di 10 embrioni insieme.
   8. Successivamente, coprire il vetrino con coprioggetto e parzialmente sigillarla con del liquido pre VALAP riscaldato (vaselina, lanolina e paraffina, fuso e combinato 01:01:01) per prevenire la disidratazione degli embrioni durante l'imaging. Nota: Ulteriori M9 tampone can essere aggiunto al pad per garantire che gli embrioni hanno liquido sufficiente per l'imaging. Al posto di VALAP, vaselina può essere utilizzato per sigillare parzialmente coprioggetti, ma è meno rigido causando i coprioggetti a slittare e potrebbero ottenere sui obiettivi del microscopio.

5. Immagini dal vivo

1. Per visualizzare neuroblasti, ottenere un ceppo di worm che esprime una proteina specifica-neuroblast attaccato ad una proteina fluorescente (ad es HAM-1: GFP, ID deformazione alla CGC OP102). Per rilevare le membrane cellulari, utilizzare un ceppo verme che esprime anche un dominio proteina che riconosce i lipidi collegati a una proteina fluorescente diversa (ad esempio mCherry:. PH, ID deformazione alla CGC OD70).
2. Embrioni raccolto da ermafroditi fluorescenti tenuti al controllo o ani-1 piastre di RNAi (vedi protocolli 3 e 4), e preparare le diapositive come descritto in precedenza (vedi protocollo 4).
3. Embrioni di immagine in 4D (x, y, z e time-lapse) mediante microscopia in epifluorescenza. Utilizzare una connessione wisistema defield [microscopio a fluorescenza automatizzata con filtri per la GFP e TexasRed, obiettivi fino a 60X o 100X, un CCD ad alta risoluzione (Charge Coupled Device) della fotocamera, altamente motorizzato fase (ad es. Piezo Z) e il software di acquisizione specializzati] o un livescan spazzato campo microscopio confocale [automatizzati microscopio a scansione a fluorescenza con 488 nm e 561 nm laser, obiettivi fino a 100X, un EMCCD (elettrone CCD moltiplicazione) della fotocamera, altamente motorizzato fase (ad es Piezo Z) e il software di acquisizione specializzati]. Nota: Per il sistema widefield, tramite LED e una fotocamera EMCCD limiterà fototossicità. Inoltre, un microscopio confocale disco rotante può essere utilizzato al posto del sistema di campo spazzato.
4. Per la divisione cellulare immagine neuroblast su entrambi i sistemi, trovare x, y cornici di embrioni utilizzando gli obiettivi 10X o 20X, e scegliere un ottimale x, y fotogramma in cui gli embrioni sono in fase di intercalazione dorsale (passo prima di custodia ventrale; Figura 1A) o sono nelle fasi inizialidel contenitore ventrale (~ 350 min dopo la prima divisione cellulare; Figura 1A).
5. Al microscopio a campo spazzato, utilizzare il 488 nm e 561 nm laser 100 MW alla potenza del 40%, con una fessura di 50. Sul sistema widefield, utilizzare i filtri GFP e TexasRed con intensità di luce medio-basso (se controllabile). Nota: Per il sistema widefield, i LED hanno una bassa fototossicità e sono preferibili.
6. In entrambi i sistemi, utilizzare gli obiettivi ad immersione olio 60X o 100X e raccogliere 20 Z-stack di 0,2 micron ogni 2 minuti per un totale di 10 min. Nota: Anche se la HAM-1: GFP e mCherry: le sonde PH esprimono a livelli relativamente elevati, i tempi di esposizione per ogni sonda dovranno essere ottimizzati per i diversi microscopi. Nota: Per il sistema widefield, un minor numero Z-stack si raccomanda di limitare fototossicità e per l'imaging su periodi di tempo più lunghi, usa meno punti temporali.
7. Per minimizzare fototossicità causato dalla esposizione di embrioni di luce UV sul sistema widefield (se si utilizza un mercenarioury lampadina), chiudere il diaframma al 30% e diminuire l'intensità della luce (utilizzando un sistema di illuminazione regolabile). Nota: Anche se il guadagno non è necessario utilizzare uno dei due sistemi, altri microscopi possono avere fonti di luce con intensità inferiori o obiettivi con diverse aperture numeriche, che potrebbero richiedere l'utilizzo di guadagno per ottenere immagini di intensità ottimale dei pixel. Verificare le condizioni usando un embrione di controllo per garantire che eventuali fenotipi osservati non sono dovuti a fototossicità artefatta.

6. Analisi di microscopia dati

1. Per analizzare le immagini, file di esportazione come TIFF e aprire i TIFF come uno stack utilizzando software specializzati come ad esempio un programma di elaborazione di immagini basato su Java (ad esempio ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nota: A seconda del software di acquisizione utilizzato per raccogliere le immagini, i file possono essere conservati nella loro forma originale e aperti in ImageJ. Questo è preferibile in quanto i metadati è mantenuto con i file.
2. Separare lo stackin "immagini" e punti di selezionare temporali e Z aerei come desiderato. Nota: Anche se una pila di 20 Z-piani è preso, molti dei neuroblasti sono <1 micron di spessore in media tarda embriogenesi e sono necessari solo pochi Z-aerei.
3. Impilare i piani Z selezionati per ogni punto di tempo e fare proiezioni Z-stack separati. Poi, impilare le proiezioni per ogni volta sottolineano insieme per fare una sequenza temporale.
4. Apportare modifiche alla luminosità e / o contrasto per ciascun canale.
5. Quindi, selezionare una regione di interesse, colture (e ruotare se necessario) la regione.
6. Creare immagini unite utilizzando la funzione "canali fuse e scegliere un colore diverso per ogni canale. Converti immagini unite a RGB.
7. Invertire le immagini in scala di grigio per ogni canale da passi 6.3 o 6.4 (Utilizzare la funzione 'invertito' sotto 'Modifica') di visualizzare più chiaramente le immagini.
8. Salvare tutte le immagini finali come TIFF a 8 bit per fare figure in vettoriale basato softwsono programmi o come file Quicktime per fare i film.
9. Se sono necessarie misurazioni di dimensione dei pixel (ad esempio includere una barra di scala con le immagini), utilizzare ImageJ, o altri software di elaborazione delle immagini per misurare la dimensione dell'embrione. Nota: Le immagini raccolte con obiettivi diversi avranno diverse dimensioni in pixel.

Risultati

Questo protocollo sperimentale descritto come immagine divisione cellulare in C. elegans embrioni in media embriogenesi. In particolare, si descrive come neuroblasti immagine, che può facilitare epidermica morfogenesi. Epidermal morfogenesi verifica a causa di una combinazione di cambiamenti di forma delle cellule epidermiche, la migrazione e l'adesione, ma anche si basa su segnali chimici o meccanici dai neuroblasti sottostanti (Figura 1B). I neuroblasti secernono spunti di orientamento che ve...

Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di vari tipi di microscopia a divisioni cellulari immagine in media embriogenesi. In particolare, questo protocollo evidenzia come immagine la divisione dei neuroblasti, cellule che possono facilitare epidermica morfogenesi. Comunicazione cellula-cellula è importante per la formazione di tessuto durante lo sviluppo metazoi e C. elegans è un modello eccellente per studiare la formazione di tessuto in vivo. Un evento che ritrae bene l'interazione dei tessuti è epi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	BioShop Canada Inc.	#AGR001.1	Per la produzione di piastre C. elegans NGM e RNAi
Agar	Bio Basic Inc.	#9002-18-0	Per la produzione di piastre di agar LB batteriche
Agarose	BioShop Canada Inc.	#AGA001.500
Anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11029
Anti-topo anti-anti-GFP anticorpo	Roche Applied Science	#11814460001
Anti-coniglio Alexa Fluor 568 anticorpo	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11011
Ampicillin	BioShop Canada Inc.	#AMP201.5	Conservare la polvere a 4 gradi; C e ampicillina disciolta a -20 ° C
Bactopetone  (peptone-A)	Bio Base Inc.
CaCl2 (cloruro di calcio)	BioShop Canada Inc.	#C302.1
Colesterolo	BioShop Canada Inc.	#CHL380.25	Sciogliere in etanolo
DAPI	Sigma-Aldrich	#D9542	Utilizzare per colorare gli acidi nucleici (DNA)
Glicerolo	BioShop Canada Inc.	#GLY001.1
IPTG (isopropiltio-beta;-galattoside)	Bio Basic Inc.	#367-93-1	Conservare la polvere e l'IPTG disciolto a -20 gradi C
KH2PO4 (fosfato di potassio, monobasico)	BioShop Canada Inc.	#PPM666.1
K2HPO4 (fosfato di potassio, dibasico)	BioShop Canada Inc.	#PPD303.1
L4440  (vettore di alimentazione)	Addgene	#1654	Mantenere come stock di glicerolo a -80 ° C
MgSO4    (solfato di magnesio)	BioShop Canada Inc.	#MAG511.500
NaCl (cloruro di sodio)	Bio Basic Inc.	#7647-14-5
Na2HPO4 (fosfato di sodio, bibasico)	Bio Basic Inc.	#7558-79-4
Siero d'asino normale (NDS)	Wisent Bioproducts	#035-110
n-propil-3,4,5-triidrossibenzoato (gallato di propile)	Alfa Aesar	#A10877
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	#P8920	Per risultati ottimali rivestire i vetrini del microscopio tre volte
Streptomicina	BioShop Canada Inc.	#STP101.50	Conservare la polvere a 4 gradi; C e streptomicina disciolta a -20 ° C
Tetraciclina	BioShop Canada Inc.	#TET701.10	Conservare la polvere a 4 gradi; C e tetraciclina disciolta a -20 ° C
Tween-20	Bio Base Inc.	CAS#9005-64-5
Tryptone	BioShop Canada Inc.	#TRP402.500
Estratto di lievito	Bio Basic Inc.	#8013-01-2