Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

Sommario

Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l'isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer.

Abstract

Dettagli Questo protocollo un metodo per analizzare la capacità di progenitori ematopoietici purificati per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) in cerotto intestinale del Peyer (PP). Progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP, lin ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ Flt3 ⁺⁾ sono state purificate dal midollo osseo di topi C57BL6 da FACS e trasferiti a topi riceventi che mancano di una popolazione significativa PDC in PP, in questo caso, IFNAR ^{- / -} topi sono stati usati come destinatari di trasferimento. In alcuni topi, l'iperespressione del fattore di crescita delle cellule dendritiche ligando di Flt3 (Flt3L) è stato applicato prima adottivi trasferimento di CDP, utilizzando idrodinamica trasferimento di geni (HGT), del Flt3L-plasmide codificante. Flt3L sovraespressione espande popolazioni DC provenienti dalla trasferiti (o endogeni) progenitori ematopoietici. A 7-10 giorni dopo il trasferimento progenitore, pDCs che nascono dai progenitori adoptively ceduti sono stati distinti da cellule riceventi sullabase di espressione marcatore CD45, con pDCs da CDP trasferiti essere CD45.1 ⁺ e destinatari di essere CD45.2 ^+. La capacità di CDP trasferiti a contribuire alla popolazione pDC in PP e di rispondere alle Flt3L è stata valutata mediante citometria a flusso di PP sospensioni di cellule singole da topi riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per verificare se altre popolazioni progenitrici sono in grado di generare PP pDCs. Inoltre, questo approccio potrebbe essere utilizzato per esaminare il ruolo dei fattori che si prevede di influenzare lo sviluppo PDC in PP, trasferendo sottoinsiemi progenitrici con un atterramento opportuno, knockout o sovraespressione del fattore putativo di sviluppo e / o manipolando citochine circolanti via HGT . Questo metodo può anche permettere un'analisi di come pDCs PP influenzano la frequenza o la funzione di altri sottoinsiemi immuni in PP. Una caratteristica unica di questo metodo è l'uso di IFNAR ^{- / -} mice, che mostrano gravemente impoverito PP pDCs relative al tipo di animali selvatici, così allowing ricostituzione di PP pDCs in assenza di effetti confondenti da irradiazione letale.

Introduzione

Qui, dimostriamo un protocollo per valutare se progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP) sono in grado di dare luogo alla cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC), la popolazione in patch di Peyer (PP). L'obiettivo generale di questo metodo è stato quello di valutare la regolamentazione dello sviluppo di pDCs in patch di Peyer (PP pDCs). Il motivo per questo è importante è che pDCs PP differiscono da pDCs trovati in altri tessuti, compreso il midollo osseo, sangue e milza, e pertanto non è chiaro se pDCs PP e altre popolazioni PDC sono evolutivamente e / o funzionalmente connesse. In particolare, pDCs sono ampiamente conosciuto per essere il principale tipo I (IFN) i produttori all'interno del sistema ematopoietico, rispondendo a Toll-like receptor 7 e 9 (TLR7 / 9) stimolazione da una rapida secrezione di IFN ^1-3. Tuttavia, pDCs PP sono carenti nella produzione di IFN di tipo I in risposta alla stimolazione TLR agonisti ^4,5. Inoltre, PP pDCs anche differire dal pDCs trovano nel midollo osseo e nella milza inrichiede segnali dal interferone di tipo I (IFN) recettore (IFNAR1) o la IFN segnalazione STAT1 molecola per il loro sviluppo e / o l'accumulo ^5. Questi dati hanno suggerito la possibilità che meccanismi regolatori distinti controllano pDCs PP rispetto pDCs in altri organi (pe midollo osseo, milza) ^5.

La logica che ha portato allo sviluppo di questo metodo è basata sui recenti progressi nella comprensione delle cellule dendritiche (DC) biologia. La maggior parte, se non tutti, i sottoinsiemi DC derivano da progenitori ematopoietici che esprimono il tipo fms recettore tirosina chinasi 3 (Flt3) ^6-10, tuttavia, lo sviluppo DC non è limitato al classico mieloidi e linfoidi percorsi. Ad esempio, Flt3 ⁺ progenitori mieloidi comuni (CMP, lin ^- IL-7R ^- Sca-1 ^- c-kit ⁺ CD34 ⁺ FcγR ^{lo / -)} dare adito a CDP (lin ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ Flt3 ^+); la cucih ulteriormente differenziarsi in pDCs e DC convenzionali (CDC) ^9,10. Al contrario, Flt3 ⁺ progenitori linfoidi comuni (CLPS, Lin ^- IL-7R ⁺ Sca-1 ^lo c-kit ^LO) si sviluppano principalmente in pDCs ^11. Pertanto, studi precedenti indicano pDCs derivano da almeno due distinte popolazioni progenitrici ematopoietiche ai sensi del regolamento di Flt3L, anche se l'analisi tipica è stato limitato al midollo osseo, milza e / o sottoinsiemi pDC sangue. Così, la popolazione progenitore (s) che genera PP pDCs necessaria indagine. Comprendere le origini del PP pDCs farà luce su se condividono percorsi di sviluppo comuni con altre popolazioni PDC o utilizzare meccanismi distinti durante la loro generazione in PP.

Un vantaggio unico dell'approccio descritto è l'uso di topi che mostrano una carenza grave in PP pDCs come destinatari del trasferimento adottivo di progenitori emopoietici. I topi con il genedelezione tic nel gene che codifica IFNAR1 (IFNAR ^{- / -} mice) o STAT1 (Stat1 ^{- / -)} ha rivelato un impoverimento notevole in PP pDCs ^5. Pertanto, questi ceppi forniscono un ambiente in cui pDCs PP sono ridotte, consentendo studi trasferimento adottivo da eseguire in assenza di potenti regimi ablazione cellulare come irradiazione letale. Un ulteriore punto di forza del metodo qui presentato è l'uso di idrodinamica trasferimento genico (HGT) stimolare elevate quantità circolanti di Flt3L. Ciò fornisce un metodo conveniente per indurre Flt3L in vivo, rispetto iniezione di proteina ricombinante. Numerosi studi, compresi quelli nel nostro laboratorio, hanno impiegato HGT per indurre la quantità di citochine in una varietà di condizioni sperimentali ^5,12,13.

La divisione del lavoro e precise funzioni immunitarie per DC è di grande interesse nel campo dell'immunologia. In particolare, pDCs sono importanti mediatori della tolleranza orale e sistemica antiviralerisposte, ma sembrano anche contribuire allo sviluppo e la persistenza di autoimmunità e cancro ^14-17. Il protocollo qui descritto permetterà i meccanismi evolutivi che regolano PP pDCs ad essere più pienamente esplorate. Inoltre, questo approccio può consentire studi per valutare la funzione PP pDC, e può essere esteso a comprendere la regolamentazione e la funzione delle altre popolazioni immunitarie all'interno PP.

Protocollo

Approvazione istituzionale deve essere ottenuto in anticipo per tutte le manipolazioni sperimentali qui descritte coinvolgono topi. Questi includono l'uso di topi C57BL6 per l'isolamento di cellule progenitrici del midollo osseo, IFNAR ^{- / -} topo come destinatari per trasferimento adottivo di progenitori emopoietici e l'uso di HGT per citochine sovraespressione in vivo. Un alloggio adeguato e la cura degli animali devono essere forniti anche dallo sperimentatore o istituzione. Inoltre, l'approvazione istituzionale può essere richiesta per i plasmidi usati nel trasferimento genico idrodinamico (cioè approvazione DNA ricombinante). Gli studi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso UT MD Anderson Cancer Center.

1. Trasferimento Gene idrodinamico (HGT)

Questa operazione deve essere effettuata 2 giorni prima del trasferimento adottivo di CDP per indurre circolante Flt3L per espansione DC in vivo ^5. Prepare almeno 5 destinatario topi / gruppo.

1. Per conseguire efficiente HGT, i vasi sanguigni del destinatario IFNAR ^{- / -} mice (CD45.2 ⁺⁾ dovrebbero essere dilatate esponendo topi per una lampada riscaldante per 5-10 min.
2. Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e disinfettare la coda con il 70% di etanolo.
3. Iniettare 5 pg di plasmide codificante Flt3L in 2 ml di PBS sterile nella vena della coda usando un ago G 27. Per la coorte di controllo, iniettare 5 mg di vettore vuoto (Porf) attraverso la vena della coda come indicato.
4. Controllo topi per 15-30 min per garantire non ci sono effetti deleteri della iniezione coda vena. Topi Ritorno a struttura alloggiativa per 2 giorni.

2. Isolamento di emopoietiche progenitori dal midollo osseo di topo

Questa operazione deve essere eseguita due giorni dopo HGT. Utilizzare CD45.1 congenic ⁺ topi come la fonte dei progenitori del midollo osseo per il trasferimento adottivo in destinatario IFNAR ^{- /}- animali (CD45.2 ^+). In questo protocollo, ceppi congenici sono tenuti a distinguere donatore e ricevente DC derivate, così da evitare l'esaurimento immunomediata causa MHC mancata corrispondenza. Circa 10-20 topi saranno tenuti a fornire un numero sufficiente di cellule progenitrici ematopoietiche (10 ⁵ cellule / topo ricevente) per gli esperimenti di trasferimento.

1. Euthanize 10 congenic CD45.1 ⁺ topi da CO ₂ asfissia e dislocazione cervicale.
2. Mettere ogni carcassa su un vassoio dissezione e sterilizzare l'addome e le gambe con il 70% di etanolo.
3. Fare un'incisione a metà addome e tagliare attraverso la pelle dall'addome alle gambe, tagliando la pelle per tutta la lunghezza della gamba.
4. Rimuovere delicatamente la pelle da ogni gamba, e tagliare e rimuovere le gambe dalla carcassa all'altezza dell'articolazione dell'anca usando forbici affilate.
5. Rimuovere con attenzione i muscoli dal femore e tibia di ogni gamba con una lama affilata.
6. Rimuovereentrambe le estremità del femore e tibia con un bisturi affilato e pongono ossa in un piatto di coltura contenente RPMI completo (RMPI con 10% di siero fetale inattivato al calore bovino, 1% di penicillina / streptomicina, 1 mM piruvato di sodio e 50 mM β-mercaptoetanolo) .
7. Preparare una siringa contenente 1 ml di RPMI completo, collegato a un ago G 27.
8. Inserire l'ago 27 G in una delle estremità del femore o tibia. Lavare il midollo osseo dal femore o tibia iniettando delicatamente il completo RPMI nell'osso. Assicurarsi che le cellule del midollo osseo vengono rimossi dalle ossa, che può essere realizzato individuando visivamente mezzi espulso che appare torbida.
9. Ripetere il lavaggio ciascun femore e tibia 3x per rimuovere completamente le cellule del midollo osseo.
10. Preparate una sospensione singola cella pipettando delicatamente le cellule avanti e indietro 3-5x nella capsula di Petri.
11. Rimuovere i detriti passando le cellule del midollo osseo attraverso un colino 40 micron cellulare, ponendo le cellule essudati in una nuova culture piatto. Disrupt eventuali grumi di cellule che compaiono sul filtro con una leggera pressione con la fine di un stantuffo della siringa sterile.
12. Lisare i globuli rossi (RBC) presenti nella sospensione totale di cellule del midollo osseo con imprese tampone di lisi RBC secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 2 ml di lisi buffer/4-6 x 10 ⁷ cellule (generalmente celle di un topo) e un tempo di incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente.
13. Lavare le cellule del midollo osseo da cellule in pellet mediante centrifugazione per 4 min a 500 xg, aspirando delicatamente il terreno di coltura, risospendere in 10 ml di tampone FACS (PBS 1x + 2 mM EDTA + 1% FBS), cellule di rivestimento per centrifugazione e delicatamente aspirazione lavaggio buffer.
14. Ripetere il lavaggio, come descritto al punto 2.13, per un totale di 2 lavaggi.

3. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) per isolare CDPs

Questo passaggio richiede l'accesso a un separatore cellulare MidiMACS e colonne MACS LD per una procedura di selezione negativa iniziale,così come una macchina FACS con almeno 3 laser per purificare il progenitore sottoinsieme multicolore dopo colorazione con anticorpi coniugati modo fluorescente.

1. Dopo il secondo lavaggio nel passaggio 2.14, contare le cellule del midollo osseo. Agglomerare le cellule per centrifugazione come descritto al punto 2.13 e risospendere in tampone FACS per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 ⁷ cellule per 30 ml di tampone FACS.
2. Per preparare le cellule per FACS, cellule della linea-negativi vengono prima arricchiscono di una tecnica di selezione negativa che rimuove cellule della linea-positive dalla miscela di midollo osseo mediante tecnica cromatografica perlina magnetica. Per la procedura di selezione negativa, aggiungere 1 mg di ciascuno dei seguenti anticorpi anti-topo ratto commerciale (ABS) che riconoscono i marcatori lignaggio ematopoietiche: CD3, CD19, CD11c, CD11b, e Ter-119 Abs. Le Abs dovrebbe essere aggiunto in un volume di 2 ml / Ab alla sospensione cellulare 30 microlitri di tampone FACS.
3. Incubare la sospensione cellulare a 4 ° C per 30min. Seguendo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 10 ml di tampone FACS come descritto al punto 2.13.
4. Risospendere le cellule per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 ⁷ cells/40 microlitri di tampone FACS. Aggiungere 20 ml di capra anti-topo IgG microsfere magnetiche per ogni 40 ml di sospensione cellulare. Miscelare delicatamente e incubare a 4 ° C per 30 min. Lavare le cellule con 10 ml di tampone FACS come descritto al punto 2.13.
5. Risospendere fino a 10 cellule del midollo osseo ⁸ in 500 ml di buffer di FACS.
6. Caricare una colonna MACS LD su un separatore cellulare MidiMACS secondo le istruzioni del produttore e Prerisciacquare la colonna con buffer di 2 ml FACS.
7. Applicare la sospensione di cellule di midollo osseo per la colonna, caricando fino a 5 x 10 ⁸ cellule in 2,5 ml di tampone FACS. Garantire un tubo di raccolta (tubo da 15 ml) è posto sotto la colonna. Lavare la colonna 3x con 2 ml di tampone FACS / lavaggio, e raccogliere le cellule che passano attraverso la colonna, che sarà arricchito percellule della linea-negativi. Contare le cellule del materiale eluito (wash-through) dalla colonna.
8. Per eseguire la selezione positiva di sottoinsiemi progenitrici ematopoietiche mediante FACS, le cellule macchia con la seguente fluorescente Abs coniugato: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, più una miscela di lignaggio Abs marcatori diretti contro CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 e Ter119 (tutti etichettati con PerCP Cy5.5). Utilizzare 0,5-1 ml di ogni Ab in un volume totale di 100 microlitri. Incubare sospensione cellulare a 4 ° C per 20-30 min.
9. Lavare le cellule come indicato nella fase 2.13 e risospendere in tampone FACS ad una concentrazione di 2-3 x 10 ⁷ cellule / ml. Filtrare cellule attraverso un tubo di 35 micron tappo filtro cella per rimuovere i grumi di cellule. Questo ultimo passo è fondamentale per evitare di intasare la macchina FACS.
10. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo FACS sul palco FACS ed ordinare CDP (lin ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ Flt3 ⁺⁾ sulbase del profilo marcatore indicato. Raccogliere le cellule purificati in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di RPMI completo.
11. Registrare il numero assoluto di cellule filtrate alla fine della corsa FACS. Agglomerare le cellule per centrifugazione come indicato nella fase 2.13 e risospendere in PBS sterile per esperimenti di trasferimento adottivo.

4. Trasferimento adottivo di CDP

Questo passaggio avviene tipicamente nel stabulario dove sono alloggiati i topi riceventi. A seconda della posizione della macchina FACS, può comportare trasporto delle popolazioni di cellule progenitrici purificate nella stabulario prima trasferimento adottivo. Sospensioni di cellule progenitrici devono essere tenuti sterile e trasportati in ghiaccio.

1. Preparare sospensioni cellulari iniettabile diluendo 10 ⁵ CDPs purificate in un volume totale di 100 microlitri di PBS sterile. Posizionare sospensione cellulare in una siringa collegata ad un ago G 27.
2. Esporre il destinatario IFNAR ^{- / -} topi (CD45.2 ⁺⁾ a una lampada riscaldante per 5-10 minuti per raggiungere iniezione efficiente attraverso la vena della coda.
3. Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e disinfettare la coda con il 70% di etanolo.
4. Iniettare 10 ⁵ FACS-purificate CDP in 100 microlitri di soluzione in coda vena con un ago G 27.
5. Controllo topi per 15-30 min per garantire non ci sono effetti deleteri della iniezione coda vena. Topi Ritorno a struttura alloggiativa.

5. Isolamento di PP e misurazione dei pDC Importi

1. A 7-10 giorni dopo il trasferimento adottivo, eutanasia topi riceventi. Aprire delicatamente il mouse dalla dissezione e di esporre l'intestino.
2. Rimuovere l'intero intestino e metterlo su carta assorbente PBS-imbevuti. Raccogliere tutti i PP visibili lungo la parete del piccolo intestino utilizzando una pinza sottile e forbici. C57BL6 e IFNAR ^{- / -} mice hanno tipicamente 5-10 PP / mouse, che sono differenti da isolate linfoidi follicoli trovatilungo l'intestino tenue ^18. Si noti che i partners di progetto sono spesso strutturalmente distinti, anche all'interno di un singolo mouse, assicurarsi così accuratamente tutti i PP sono identificati e sezionati.
3. Mettere PP in una capsula di Petri contenente PBS, e utilizzare pinze per rimuovere le feci. Ripetere questa procedura due volte per pulire PP.
4. Digest PP con 1 mg / ml di collagenasi IV in 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank 1x (HBSS) in un pallone da 50 ml con agitazione vigorosa per 1 ora a 37 ° C.
5. Posizionare il PP digerita nel vano superiore di un 40 micron setaccio cellulare e forza cellule attraverso il filtro con una siringa sterile stantuffo. Raccogliere la sospensione cellulare PP in un tubo da 15 ml.
6. Agglomerare cellule PP tese mediante centrifugazione a 500 xg per 5 min e risospendere in 6 ml di soluzione di Percoll 37% (37% Percoll in mezzo RPMI). Posizionare delicatamente 6 ml di soluzione di Percoll 70% (70% Percoll in RPMI medium) sotto la sospensione cellulare, per formare un passaggio gradiente Percoll.
7. Centrifugare le cellule per 20 min at 800 xg con la centrifuga rompere. Le cellule mononucleari migreranno all'interfaccia 37/70%. Dopo centrifugazione, popolazione cellule mononucleate dovrebbe essere raccolto da un'attenta pipettando corrispondenza della zona interfaccia. Pellet cellule raccolte mediante centrifugazione e lavate due volte in 50 ml di RPMI completo / lavaggio. Un grande volume viene utilizzato per garantire la rimozione completa Percoll.
8. Colorare le cellule raccolte PP con i seguenti anticorpi per rilevare pDCs murini che derivano dai progenitori adoptively trasferiti (CD45.1 ⁺⁾ o topi riceventi (CD45.2 ^+): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) e PDCA-1 (FITC) Abs. Eseguire citometria a flusso delle cellule PP, come indicato nei passi 3.9 e 3.10. Identificare pDCs dal loro CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ⁺ Siglec-H ⁺ PDCA-1 ⁺ fenotipo. Numeri pDC assoluti possono essere determinati dalla seguente equazione: x% pDCs anumero di cellulare tal PP = PP pDCs.

Risultati

I nostri risultati mostrano la strategia di gating per l'isolamento di CDP da cellule di midollo osseo del topo (Figura 1), come descritto nei protocolli 2 e 3. CDPs costituiscono circa il 0,1% del totale delle cellule del midollo osseo, e circa 4-6 x 10 ⁴ CDP possono essere isolate da un mouse. Al momento del trasferimento adottivo, CDP si differenziano in pDCs e CDC ^10.

Discussione

La tecnica qui descritta trasferimento adottivo valutato il contributo della CDP alla popolazione PP pDC in topi riceventi che sono carenti in PP pDCs (es IFNAR ^{- / -} topi). In esperimenti futuro, sarà importante per valutare il potenziale di altri sottoinsiemi progenitrici nel generare pDCs PP, in particolare se pDCs PP derivano da Flt3 ⁺ CLPS. Questa domanda è significativa in quanto non è chiaro il motivo per cui pDCs PP sono unicamente sensibili ai segnali IFNAR-STAT1 per PP accantonam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6J	JAX	664
B6. SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
Provette coniche da 15 ml	BD Biosciences	352095
Provette coniche da 50 ml	BD Biosciences	352070
Pinzette chirurgiche
Forbici sterili a coppia piccola Forbici
sterili a coppia grande
40 μ filtro cellulare m	BD Biosciences	352340
35 μ provette con tappo per filtro cellulare m	BD Biosciences	352235
tampone per lisi di globuli rossi	Sigma	R7757
tampone			PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filtro sterilizzato
Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
Collagenasi IV		Worthington LS004188
Microsfere IgG anti-ratto di capra	Milteyni Biotec	130-048-501
colonna LD	Milteyni Biotec	130-042-901
Ratto anti-D3	BD Biosciences	555273
Ratto anti-CD19	BD Biosciences	553783
Rat anti-CD11b	BD Biosciences	553308
Rat anti-CD11c	BD Biosciences
Ratto anti-Ter119	BD Biosciences	553671
Anti-CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
Anti-CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
Anti-CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
Anti-CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
Anti-F4/80 ( PerCP)	eBiosciences	45-4801
Anti-Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
Anti-SCA-1 (PE. Cy7)	eBiosciences	25-5981
Anti-CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
Anti-c-kit (APC. Cy7)	eBiosciences	47-1171
Anti-IL-7R (Blu Pacifico)	eBiosciences	48-1271
Anti-Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
Anti-CD45.1 (APC. Cy7)	BD Biosciences	560579
Anti-CD45.2 (PE. Cy7)	Biolegend	109830
Anti-CD11c (Blu Pacifico)	eBiosciences	48-0114
Anti-B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
Anti-Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
Selezionatore cellulare	BD Biosciences,		ad es. BD Fortessa
Lampada
Mouse retrattino
1 ml Siringhe	Becton Dickinson	309602
27½ Aghi G (sterili)	Becton Dickinson	305109