I batteri possono accumulare mutazioni dannose o benefiche durante la loro vita. In una popolazione di cellule individui che hanno accumulato mutazioni benefiche possono rapidamente sovracompetire i loro simili. Qui presentiamo una procedura semplice per visualizzare la competizione intraspecie in una popolazione di cellule batteriche nel tempo utilizzando individui etichettati fluorescentmente.
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Articolo metodologico
Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti microrganismi come i batteri proliferano estremamente velocemente e le popolazioni possono raggiungere alte densità cellulari. Piccole frazioni di cellule in una popolazione hanno sempre mutazioni accumulate che sono dannose o benefiche per la cellula. Se l'effetto di forma fisica di una mutazione fornisce alla sottopopolazione un forte vantaggio di crescita selettiva, gli individui di questa sottopopolazione possono rapidamente sovracompetarsi e persino eliminare completamente i loro compagni immediati. Pertanto, piccoli cambiamenti genetici e accumulo di cellule basate sulla selezione che hanno acquisito mutazioni benefiche possono portare a uno spostamento completo del genotipo di una popolazione cellulare. Qui presentiamo una procedura per monitorare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione di cellule batteriche nel tempo per cocultivazione di individui etichettati fluorescentmente del batterio modello Gram-positivo Bacillus subtilis. Il metodo è facile da eseguire e molto illustrativo per mostrare la competizione intraspecie tra gli individui in una popolazione di cellule batteriche.
Introduzione
I batteri del suolo sono solitamente dotati di reti normative flessibili e ampie capacità metaboliche. Entrambe le caratteristiche consentono alle cellule di regolare i loro percorsi catabolici e anabolizzanti per competere con i loro simili e altri microrganismi per i nutrienti, che sono disponibili in una data nicchia ecologica1. Tuttavia, se i batteri non sono in grado di adattarsi al loro ambiente, altri meccanismi possono causare la sopravvivenza di una specie. Infatti, poiché molti batteri proliferano rapidamente e le popolazioni possono raggiungere sottopopolazioni ad alta densità cellulare possono avere mutazioni benefiche accumulate spontaneamente che forniscono alle cellule un vantaggio di crescita selettivo e quindi aumentano la loro forma fisica. Inoltre, gli hotspot mutazionali e la mutagenesi adattiva indotta dallo stress possono facilitare l'evoluzione di un batteriomaladotto 2,3. Pertanto, l'accumulo di mutazioni e la crescita sotto selezione continua è l'origine dell'enorme diversità microbica, anche all'interno dellostesso genere 4,5. Come in natura, la formatura dei genomi batterici si verifica anche in laboratorio a causa della coltivazione continua in fase di selezione. Ciò è esemplificato dall'addomesticamento del batterio Gram-positivo B. subtilis, che viene utilizzato in tutto il mondo nella ricerca di base e nell'industria. Negli anni '40 B. subtilis è stato trattato con raggi X dannosi per il DNA seguiti da coltivazioni in una specifica condizione di crescita6. Le mutazioni che si sono accumulate nei batteri durante la loro addomesticamento causano la perdita di molte caratteristiche di crescita, cioè il ceppo di laboratorio B. subtilis 168 ha perso la capacità di formare colonie complesse7,8.
Al giorno d'oggi, per i batteri modello meglio studiati Escherichia coli e B. subtilis, è disponibile una varietà di potenti strumenti per manipolare geneticamente i loro genomi al fine di affrontare specifiche questioni scientifiche. A volte l'inattivazione di un gene di interesse causa un grave difetto di crescita, che è quindi chiaramente visibile sul mezzo di crescita standard9. Al contrario, le mutazioni che causano un difetto di crescita debole e quindi influenzano solo leggermente la forma fisica del ceppo vengono spesso ignorate. Tuttavia, in entrambi i casi l'incubazione prolungata e la passatura dei ceppi mutanti per diverse generazioni di solito si traducono nell'accumulo di mutanti soppressori che hanno ripristinato il fenotipo del ceppogenitore 2,9. La caratterizzazione dei mutanti soppressori e l'identificazione delle mutazioni che hanno ripristinato il difetto di crescita del ceppo mutante genitore è un approccio molto utile che consente la spiegazione di processi cellulari importanti e spessonuovi 10,11.
Siamo interessati al controllo dell'omeostasi glutammato in B. subtilis12. Simile a E. coli, B. subtilis risponde alla perturbazione dell'omeostasi del glutammato ( cioè blocco nella degradazione del glutammato2)dall'accumulodi mutanti soppressori. Le alterazioni genomiche in questi mutanti soppressori che sono state acquisite da mutazioni spontanee hanno dimostrato di ripristinare rapidamente l'omeostasi del glutammato9,13. Pertanto, non sorprende che l'adattamento di B. subtilis a una condizione di crescita specifica durante l'addomesticamento del batterio si rispecchi nella sintesi enzimatica e nelle attività enzimatiche evolute, che sono coinvolte nel metabolismo del glutammato12. È stato suggerito che la mancanza di glutammato esogeno nel mezzo di crescita durante il processo di addomesticamento sia stata la forza trainante per l'emergere e la fissazione del gene criptico glutammato deidrogenasi (GDH) gudBCR nel ceppo di laboratorio 1682,14. Questa ipotesi è supportata dalla nostra osservazione che la ridotta quantità di attività GDH nel ceppo di laboratorio fornisce ai batteri un vantaggio di crescita selettivo quando il glutammato esogeno èscarso 2. Inoltre, la coltivazione di un ceppo di B. subtilis, sintetizzando il GDH GudB, in assenza di glutammato esogeno provoca l'accumulo di mutanti soppressori che hanno inattivato il gene gudB 2. Ovviamente, la presenza di un GDH catabolicamente attivo è svantaggiosa per la cellula perché il glutammato prodotto endogenamente che potrebbe altrimenti essere utilizzato per l'anabolismo è degradato all'ammonio e al 2-ossoglutarato (Figura 1). Al contrario, quando il glutammato è fornito dal mezzo, un ceppo B. subtilis dotato di attività GDH di alto livello ha un vantaggio di crescita selettivo rispetto a un ceppo che sintetizza un solo GDH funzionale. È ragionevole supporre che l'attività gdh di alto livello consenta ai batteri di utilizzare il glutammato come seconda fonte di carbonio oltre ad altre fonti di carbonio fornite dalmezzo 2 (vedi figura 1). Pertanto, l'attività GDH influisce fortemente sulla forma fisica dei batteri, a seconda della disponibilità di glutammato esogeno.
Qui presentiamo un metodo molto illustrativo per monitorare e visualizzare la competizione intraspecie tra due ceppi di B. subtilis che differiscono in un singolo locus sul cromosoma (Figura 2). I due ceppi sono stati etichettati con i geni yfp e cfp che codificano i fluorofori YFP e CFP e cocultivati in diverse condizioni nutrizionali. Campionando nel tempo e placcando adeguate diluizioni su piastre di agar, i sopravvissuti in ciascuna delle colture potrebbero essere facilmente monitorati utilizzando un comune microscopio a fluorescenza stereo. La procedura descritta in questo articolo è facile da eseguire e adatta a visualizzare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione cellulare nel tempo.
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Protocollo
1. Preparazione di piatti Agar, media culturali, criostock e preculture
- Preparare i mezzi di crescita e i reagenti richiesti (vedi tabella dei materiali e dei reagenti).
- Striature i ceppi di B. subtilis (ad es. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) e BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) esprimendo rispettivamente uno e due GDH attivi)2 che saranno utilizzati nell'esperimento di competizione su piastre di agar medie SP per ottenere singole colonie. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
- Assumere singole colonie e inoculare tubi di coltura sterile contenenti 4 ml di mezzo liquido LB. Far crescere i batteri durante la notte a 28 °C e 220 giri/min.
- Coltivare colture notturne a 28 °C per evitare che le cellule si lecivano o spopolano.
- Misurare la densità ottica delle colture ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro standard.
- Se le colture hanno raggiunto un OD600 di 2.0, mescolare 0,75 ml delle colture con 0,75 ml di una soluzione sterile di glicerolo al 50% in tubi di reazione da 1,5 ml. L'OD600 finale deve essere 1.0 per ottenere criostock contenenti circa 108 cellule/ml.
- Conservare i tubi a -80 °C.
- Creare tre preculture di ogni ceppo etichettate con i geni cfp e yfp che codificano i geni del fluoroforo. Inoculare le precolture (tubi di coltura sterile contenenti 4 ml di mezzo liquido LB) con 1 μl di cellule da criostock a -80 °C. Incubare le colture durante la notte a 28 °C e 220 giri/min.
2. Cocultivazione di batteri, raccolta di campioni e stoccaggio dei campioni
- Preparare al minimo 100 ml di C-Glc e CE-Glc (vedi tabella dei reagenti e dei materiali) e trasferire 20 ml di ogni mezzo in contenitori sterili da 100 ml di frullato.
- Assumere 0,1 ml delle preculture coltivate durante la notte, diluirle con un mezzo LB da 0,9 ml in una cuvetta da 1,5 ml e determinare l'OD600.
- Per l'esperimento di competizione, prendere quelle preculture dei diversi ceppi che hanno un OD600 simile tra 1.0-1.5.
- Per ottenere popolazioni di cellule miste, diluire le cellule delle precolture che avevano l'OD600 appropriato a un OD600 di 0,05 in 20 ml di C-Glc e ce-Glc minimo mezzo integrato in flaconi di frullato da 100 ml. Per l'esperimento di competizione i due ceppi dovrebbero essere mescolati in un rapporto 1:1.
- Prelevare campioni da 10 ml dai contenitori, trasferirli in tubi di plastica da 15 ml, raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 min a 4.000 x g in una centrifuga da tavolo standard e scartare il supernatante.
- Rimorsi le cellule in un mezzo LB fresco da 0,5 ml e trasferire le cellule in una tazza di reazione sterile da 1,5 ml. Aggiungere 0,5 ml di glicerolo sterile al 50%, mescolare la sospensione con un vortice rigoroso e conservare i campioni in un congelatore a -80 °C fino a un ulteriore trattamento.
- Incubare le cellule che vengono lasciate nei contenitori di scuotimento per un massimo di 24 ore a 37 °C e 220 giri/min. Tenere i mastri di scuotimento al buio per evitare lo sbiancamento fotografico dei fluorofori.
- Prelevare ulteriori campioni da 0,1 ml dopo 7 ore e 24 ore di crescita. Misurare e notare l'OD600 di diluizioni 1:10 (in C-Glc o CE-Glc mezzo minimo) dei campioni.
- Prendi la quantità appropriata di cellule da ogni coltura per creare criostock che hanno un OD600 di 1,0. Conservare i campioni a -80 °C fino a un ulteriore trattamento.
3. Trattamento del campione, placcatura e incubazione per analisi quantitative
- Dopo aver raccolto tutti i campioni, scongelare i criostock e diluire le cellule in una soluzione salina allo 0,9% (vedi tabella dei reagenti e dei materiali) fino a10-3.
- Piastra 0,1 ml delle10-3 diluizioni su piastre di agar medie SP e distribuire le celle utilizzando pipette di vetro sterili.
- Incubare le piastre durante la notte a 37 °C al buio fino a quando non sono apparse singole colonie.
4. Conteggio dei sopravvissuti mediante microscopia a fluorescenza stereo per l'analisi quantitativa
- Dividi il fondo della piastra dell'agar con una penna nera in quattro parti per un migliore orientamento mentre conti i sopravvissuti sotto il microscopio a fluorescenza stereo.
- Posizionare la piastra capovolta al microscopio e mettere a fuoco le colonie utilizzando la fonte di luce fredda.
- Una volta che le colonie sono a fuoco, passare al set di filtri appropriato per la PCP per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppoetichettato cfp. Conta i sopravvissuti di questo ceppo etichettando le colonie con una penna e annota il numero.
- Rimuovere le etichette con etanolo e passare al filtro YFP impostato per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppo etichettato yfp. Conta di nuovo i sopravvissuti etichettando le colonie con una penna e annota il numero.
5. Trattamento del campione e microscopia per analisi semiquantitative
- Per cifre illustrative, individuare 10 μl della diluizione10-4 (circa 100 celle) dal passaggio 3.1 su una piastra di agar SP (vedere figura 3).
- Incubare le piastre durante la notte a 37 °C al buio fino a quando non sono apparse singole colonie.
- Posizionare la piastra di Petri senza coperchio al microscopio e mettere a fuoco il punto utilizzando la fonte di luce fredda.
- Scatta foto dei punti per figure illustrative. Scegli un tempo di esposizione appropriato per scattare le foto delle colonie con la fonte di luce fredda.
- Senza spostare la piastra, passare al set di filtri CFP, regolare il tempo di esposizione e scattare una foto. Fai lo stesso con il set di filtri YFP e salva le immagini per ulteriori analisi.
6. Analisi dei dati
- Utilizzare software come Excel per le analisi quantitative dei dati. In base alle colonie contate, calcola la percentuale di colonie gialle e blu rispetto all'intero numero di colonie, che sono impostate al 100%.
- Utilizzare i numeri calcolati per creare un diagramma a barre in pila (vedere figura 4 e figura 5). Utilizzate un programma di elaborazione delle immagini come Adobe Photoshop per costruire immagini unite delle immagini scattate dai diversi punti. In alternativa, il software liberamente disponibile ImageJ, scaricabile da http://rsbweb.nih.gov/ij/ può essere utilizzato per l'elaborazione delle immagini.
- Aprire le immagini da un punto scattate con il set di filtri CFP e il set di filtri YFP. Ottimizza il contrasto e la luminosità per ridurre la fluorescenza di fondo dal supporto.
- Passare a una delle immagini e selezionare tutte. Copiare l'immagine e incollarla nell'altra immagine.
- Utilizzare la funzione "schivare il colore" per unire le immagini o sovrapporre le immagini fluorescenti utilizzando la scheda canali. Immagini unite delle colonie da diversi media e diversi punti di tempo rappresentano la crescita dei diversi ceppi all'interno della coltura liquida.
7. Suggerimenti specifici: esperimento di commutazione di colorante e cocultivazione di ceppi isogenici etichettati con cfp e yfp
L'espressione di uno dei due geni codificanti al fluoroforo in B. subtilis potrebbe influenzare la forma fisica e quindi il tasso di crescita dei batteri. Pertanto, si raccomanda di eseguire i seguenti esperimenti al fine di escludere che l'eliminazione di un ceppo concorrente dalla popolazione cellulare durante la coltivazione sia semplicemente dovuta a un effetto negativo del fluoroforo:
- Ripetere l'intero esperimento e cocultivare ceppi etichettati inversamente (ad esempio, il ceppo precedente etichettato cfpè ora etichettato con il gene yfp e viceversa). Sebbene inversi, i risultati ottenuti dovrebbero essere paragonabili all'osservazione precedente secondo cui un ceppo ha un vantaggio di crescita selettivo rispetto all'altro ceppo.
- Ripetere l'intero esperimento e cocultivare i ceppi isogenicietichettati con yfp e cfp ( ad esempio BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) e BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Stimare l'effetto negativo di uno dei due fluorofori sulla forma fisica dei batteri seguendo la composizione della popolazione cellulare nel tempo.
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Risultati
Il metodo qui descritto è stato applicato con successo per visualizzare la concorrenza intraspecie in una popolazione cellulare costituita da ceppi di B. subtilis etichettati rispettivamente con i geni cfp e yfp che codificano i fluorofori CFP e YFP. Come illustrato nella figura 3, il metodo può essere utilizzato per visualizzare la concorrenza intraspecie in modo molto illustrativo. Individuando i campioni su piccole aree, la composizione clonale della popolazione cellulare è ...
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Discussione
Diversi metodi sono stati sviluppati per analizzare la forma fisica competitiva deibatteri 16. In molti casi i batteri sono stati etichettati con diverse cassette di resistenza agli antibiotici17. Simile al nostro approccio, l'etichettatura delle cellule con cassette di resistenza agli antibiotici consente la valutazione della forma fisica competitiva dei batteri durante la cocultivazione in condizioni di crescita definite. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per determinare la forma fisica...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Il lavoro nel laboratorio degli autori è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), il Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) e il Centro di Biologia Molecolare di Gottinga (GZMB). Gli autori vorrebbero riconoscere Jörg Stülke per i commenti utili e la lettura critica del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (NH4)2SO4 | Roth, Germania | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Citrato ferrico di ammonio (CAF) | Sigma-Aldrich, Germania | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germania | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germania | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germania | 4043 | |
| K2HPO4• 3H2O | Roth, Germania | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germania | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germania | 3904 | |
| KOH | Roth, Germania | 6751 | |
| MgSO4• 7H2O | Roth, Germania | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germania | T881 | |
| MnSO4• 4H2O | Merck Millipore, Germania | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germania | 9265 | |
| Brodo nutriente | Roth, Germania | X929 | |
| Glutammato di potassio | Applichem, Germania | A3712 | |
| Triptone | Roth, Germania | 8952 | |
| Triptofano | Applichem, Germania | A3445 | |
| Estratto di lievito | Roth, Germania | 2363 | |
| 1,5 ml Provette di reazione | Sarstedt, Germania | 72.690.001 | |
| 2,0 ml Provette di reazione | Sarstedt, Germania | 72.691 | |
| 15 ml Provette di plastica con tappo a vite | Sarstedt, Germania | 62.554.001 | |
| Piastre di Petri | Sarstedt, Germania | 82.1473 | |
| 1,5 ml Cuvette in polistirene | Sarstedt, Germania | 67.742 | |
| Provette di coltura in vetro da 15 ml | Marca, Germania | 7790 22 | |
| Palloni da 100 ml con tappi in alluminio Marca | , Germania | 928 24 | |
| Pipette sterili in vetro da 10 ml | Marca, Germania | 278 23 | |
| Incubatrice (28 e 37 ° C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Set di pipette standard (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1.000 μ l) | Eppendorf, Germania | 4910 000.034, 4910 000.042,Centrifuga | |
| da tavolo per provette di reazione da 1,5 e 2 ml | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germania | 75002425 | |
| Centrifuga da tavolo per provette in plastica da 15 ml | Heraeus Biofuge Primo R, Germania | 75005440 | |
| Spettrofotometro standard | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germania | 80-2112-21 | |
| Microscopio a stereofluorescenza | Zeiss SteREO Lumar V12, Germania | 495008-0009-000 | |
| Congelatore (-20 e -80 ° C) | - | - | |
| Frigorifero (4 gradi; C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, | Germania-pHmetro | |
| pH-metro 766, Calimatic, Knick, Germania | 766 | ||
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germania | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germania | sostituito da | |
| Black pen (pennarello indelebile) | Staedler, Germania | 317-9 | |
| Programma Powerpoint | Microsoft, USA-Office | ||
| Programma Excel | Microsoft, USA-Programma | per l'elaborazione dei dati | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | sostituito da CS6, download | Programma per computer per l'elaborazione delle immagini |
| PC | o | Mac-ZEN | |
| pro 2011 software per il microscopio | a stereofluorescenzaZeiss, Germania | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Ottenuto tramite Zeiss |
| Ricette di soluzioni specifiche | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Brodo | |||
| 0.25 mg MgSO4• 7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g di agar per terreno | se necessario | ||
| aggiungere 1 L con autoclave H2O | per 20 min a 121 gradi; C | ||
| 1 ml di CaCl2 (0,5 M), sterilizzato per filtrazione | |||
| 1 ml di MnCl2 (10 mM), sterilizzato per filtrazione | |||
| 2 ml di citrato ferrico ammonico (CAF, 2,2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione | |||
| LB Medium | |||
| 10 g di Triptone | |||
| 5 g Estratto | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar per LB solido medio | se necessario | ||
| aggiungere 1 L con autoclave H2O | per 20 min a 121 gradi C | ||
| C-Glc Minimo Medio | |||
| 200 ml 5 x Sali C | |||
| 10 ml L-Triptofano (5 mg/ml), sterilizzato per filtrazione | |||
| 10 ml di citrato ferrico di ammonio (CAF, 2.2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione | |||
| 10 ml di sali | |||
| 25 ml Glucosio (20%) | autoclavato per 20 minuti a 121 gradi C | ||
| aggiungere 1 L con H2O | |||
| CE-Glc Medium minimo | |||
| 200 ml 5 x Sali C | |||
| 10 ml di L-Triptofano (5 mg/ml), sterilizzato per filtrazione | |||
| 10 ml di citrato ferrico di ammonio (CAF, 2,2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione | |||
| 10 ml III’ sali | |||
| 20 ml Glutammato (40%) | |||
| 25 ml Glucosio (20%), autoclavato per 20 min a 121 gradi C | |||
| aggiungere 1 L con H2O | |||
| sterili 5 x C sali | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4&toro; 3H2O | |||
| 16,5 g (NH4)2SO4 | |||
| aggiungere 1 L con autoclave sterile H2O | per 20 minuti a 121 gradi; Sali | ||
| III' | |||
| 0,232 g MnSO4• 4H2O | |||
| 12,3 g MgSO4• 7H2O | |||
| aggiungere 1 L con H2O sterile, autoclave per 20 min a 121 gradi; C | |||
| 40% Soluzione | |||
| 200 g di acido | |||
| regolare il pH a 7,0 aggiungendo circa 80 g KOH | |||
| aggiungere 0,5 L con autoclave sterile H2O | per 20 minuti a 121 gradi; C | ||
| 0.9% Soluzione salina (NaCl) | |||
| aggiungere 1 L con autoclave sterile H2O | per 20 min a 121 ° C | ||
| 50% soluzione di glicerolo | |||
| 295 ml di glicerolo (87%) | |||
| aggiungere 0,5 L con autoclave sterile H2O | per 20 minuti a 121 gradi; C | ||
| Batteri (Tutti i ceppi sono basati sul ceppo Bacillus subtilis 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp) | di ceppi di laboratorio | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp) |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
