Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Sommario

I batteri possono accumulare mutazioni dannose o benefiche durante la loro vita. In una popolazione di cellule individui che hanno accumulato mutazioni benefiche possono rapidamente sovracompetire i loro simili. Qui presentiamo una procedura semplice per visualizzare la competizione intraspecie in una popolazione di cellule batteriche nel tempo utilizzando individui etichettati fluorescentmente.

Abstract

Molti microrganismi come i batteri proliferano estremamente velocemente e le popolazioni possono raggiungere alte densità cellulari. Piccole frazioni di cellule in una popolazione hanno sempre mutazioni accumulate che sono dannose o benefiche per la cellula. Se l'effetto di forma fisica di una mutazione fornisce alla sottopopolazione un forte vantaggio di crescita selettiva, gli individui di questa sottopopolazione possono rapidamente sovracompetarsi e persino eliminare completamente i loro compagni immediati. Pertanto, piccoli cambiamenti genetici e accumulo di cellule basate sulla selezione che hanno acquisito mutazioni benefiche possono portare a uno spostamento completo del genotipo di una popolazione cellulare. Qui presentiamo una procedura per monitorare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione di cellule batteriche nel tempo per cocultivazione di individui etichettati fluorescentmente del batterio modello Gram-positivo Bacillus subtilis. Il metodo è facile da eseguire e molto illustrativo per mostrare la competizione intraspecie tra gli individui in una popolazione di cellule batteriche.

Introduzione

I batteri del suolo sono solitamente dotati di reti normative flessibili e ampie capacità metaboliche. Entrambe le caratteristiche consentono alle cellule di regolare i loro percorsi catabolici e anabolizzanti per competere con i loro simili e altri microrganismi per i nutrienti, che sono disponibili in una data nicchia ecologica¹. Tuttavia, se i batteri non sono in grado di adattarsi al loro ambiente, altri meccanismi possono causare la sopravvivenza di una specie. Infatti, poiché molti batteri proliferano rapidamente e le popolazioni possono raggiungere sottopopolazioni ad alta densità cellulare possono avere mutazioni benefiche accumulate spontaneamente che forniscono alle cellule un vantaggio di crescita selettivo e quindi aumentano la loro forma fisica. Inoltre, gli hotspot mutazionali e la mutagenesi adattiva indotta dallo stress possono facilitare l'evoluzione di un batterio^{maladotto 2,3}. Pertanto, l'accumulo di mutazioni e la crescita sotto selezione continua è l'origine dell'enorme diversità microbica, anche all'interno dello^{stesso genere 4,5}. Come in natura, la formatura dei genomi batterici si verifica anche in laboratorio a causa della coltivazione continua in fase di selezione. Ciò è esemplificato dall'addomesticamento del batterio Gram-positivo B. subtilis, che viene utilizzato in tutto il mondo nella ricerca di base e nell'industria. Negli anni '40 B. subtilis è stato trattato con raggi X dannosi per il DNA seguiti da coltivazioni in una specifica condizione di crescita⁶. Le mutazioni che si sono accumulate nei batteri durante la loro addomesticamento causano la perdita di molte caratteristiche di crescita, cioè il ceppo di laboratorio B. subtilis 168 ha perso la capacità di formare colonie complesse^7,8.

Al giorno d'oggi, per i batteri modello meglio studiati Escherichia coli e B. subtilis, è disponibile una varietà di potenti strumenti per manipolare geneticamente i loro genomi al fine di affrontare specifiche questioni scientifiche. A volte l'inattivazione di un gene di interesse causa un grave difetto di crescita, che è quindi chiaramente visibile sul mezzo di crescita standard⁹. Al contrario, le mutazioni che causano un difetto di crescita debole e quindi influenzano solo leggermente la forma fisica del ceppo vengono spesso ignorate. Tuttavia, in entrambi i casi l'incubazione prolungata e la passatura dei ceppi mutanti per diverse generazioni di solito si traducono nell'accumulo di mutanti soppressori che hanno ripristinato il fenotipo del ceppo^{genitore 2,9}. La caratterizzazione dei mutanti soppressori e l'identificazione delle mutazioni che hanno ripristinato il difetto di crescita del ceppo mutante genitore è un approccio molto utile che consente la spiegazione di processi cellulari importanti e spesso^{nuovi 10,11}.

Siamo interessati al controllo dell'omeostasi glutammato in B. subtilis¹². Simile a E. coli, B. subtilis risponde alla perturbazione dell'omeostasi del glutammato ( cioè blocco nella degradazione del glutammato²)dall'accumulodi mutanti soppressori. Le alterazioni genomiche in questi mutanti soppressori che sono state acquisite da mutazioni spontanee hanno dimostrato di ripristinare rapidamente l'omeostasi del glutammato^9,13. Pertanto, non sorprende che l'adattamento di B. subtilis a una condizione di crescita specifica durante l'addomesticamento del batterio si rispecchi nella sintesi enzimatica e nelle attività enzimatiche evolute, che sono coinvolte nel metabolismo del glutammato¹². È stato suggerito che la mancanza di glutammato esogeno nel mezzo di crescita durante il processo di addomesticamento sia stata la forza trainante per l'emergere e la fissazione del gene criptico glutammato deidrogenasi (GDH) gudB^CR nel ceppo di laboratorio 168^2,14. Questa ipotesi è supportata dalla nostra osservazione che la ridotta quantità di attività GDH nel ceppo di laboratorio fornisce ai batteri un vantaggio di crescita selettivo quando il glutammato esogeno è^{scarso 2}. Inoltre, la coltivazione di un ceppo di B. subtilis, sintetizzando il GDH GudB, in assenza di glutammato esogeno provoca l'accumulo di mutanti soppressori che hanno inattivato il gene gudB ². Ovviamente, la presenza di un GDH catabolicamente attivo è svantaggiosa per la cellula perché il glutammato prodotto endogenamente che potrebbe altrimenti essere utilizzato per l'anabolismo è degradato all'ammonio e al 2-ossoglutarato (Figura 1). Al contrario, quando il glutammato è fornito dal mezzo, un ceppo B. subtilis dotato di attività GDH di alto livello ha un vantaggio di crescita selettivo rispetto a un ceppo che sintetizza un solo GDH funzionale. È ragionevole supporre che l'attività gdh di alto livello consenta ai batteri di utilizzare il glutammato come seconda fonte di carbonio oltre ad altre fonti di carbonio fornite dal^{mezzo 2} (vedi figura 1). Pertanto, l'attività GDH influisce fortemente sulla forma fisica dei batteri, a seconda della disponibilità di glutammato esogeno.

Qui presentiamo un metodo molto illustrativo per monitorare e visualizzare la competizione intraspecie tra due ceppi di B. subtilis che differiscono in un singolo locus sul cromosoma (Figura 2). I due ceppi sono stati etichettati con i geni yfp e cfp che codificano i fluorofori YFP e CFP e cocultivati in diverse condizioni nutrizionali. Campionando nel tempo e placcando adeguate diluizioni su piastre di agar, i sopravvissuti in ciascuna delle colture potrebbero essere facilmente monitorati utilizzando un comune microscopio a fluorescenza stereo. La procedura descritta in questo articolo è facile da eseguire e adatta a visualizzare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione cellulare nel tempo.

Protocollo

1. Preparazione di piatti Agar, media culturali, criostock e preculture

1. Preparare i mezzi di crescita e i reagenti richiesti (vedi tabella dei materiali e dei reagenti).
2. Striature i ceppi di B. subtilis (ad es. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) esprimendo rispettivamente uno e due GDH attivi)² che saranno utilizzati nell'esperimento di competizione su piastre di agar medie SP per ottenere singole colonie. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
3. Assumere singole colonie e inoculare tubi di coltura sterile contenenti 4 ml di mezzo liquido LB. Far crescere i batteri durante la notte a 28 °C e 220 giri/min.
4. Coltivare colture notturne a 28 °C per evitare che le cellule si lecivano o spopolano.
5. Misurare la densità ottica delle colture ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD₆₀₀) utilizzando uno spettrofotometro standard.
6. Se le colture hanno raggiunto un OD₆₀₀ di 2.0, mescolare 0,75 ml delle colture con 0,75 ml di una soluzione sterile di glicerolo al 50% in tubi di reazione da 1,5 ml. L'OD_{600 finale} deve essere 1.0 per ottenere criostock contenenti circa 10⁸ cellule/ml.
7. Conservare i tubi a -80 °C.
8. Creare tre preculture di ogni ceppo etichettate con i geni cfp e yfp che codificano i geni del fluoroforo. Inoculare le precolture (tubi di coltura sterile contenenti 4 ml di mezzo liquido LB) con 1 μl di cellule da criostock a -80 °C. Incubare le colture durante la notte a 28 °C e 220 giri/min.

2. Cocultivazione di batteri, raccolta di campioni e stoccaggio dei campioni

1. Preparare al minimo 100 ml di C-Glc e CE-Glc (vedi tabella dei reagenti e dei materiali) e trasferire 20 ml di ogni mezzo in contenitori sterili da 100 ml di frullato.
2. Assumere 0,1 ml delle preculture coltivate durante la notte, diluirle con un mezzo LB da 0,9 ml in una cuvetta da 1,5 ml e determinare l'OD₆₀₀.
3. Per l'esperimento di competizione, prendere quelle preculture dei diversi ceppi che hanno un OD_{600 simile} tra 1.0-1.5.
4. Per ottenere popolazioni di cellule miste, diluire le cellule delle precolture che avevano l'OD₆₀₀ appropriato a un OD₆₀₀ di 0,05 in 20 ml di C-Glc e ce-Glc minimo mezzo integrato in flaconi di frullato da 100 ml. Per l'esperimento di competizione i due ceppi dovrebbero essere mescolati in un rapporto 1:1.
5. Prelevare campioni da 10 ml dai contenitori, trasferirli in tubi di plastica da 15 ml, raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 min a 4.000 x g in una centrifuga da tavolo standard e scartare il supernatante.
6. Rimorsi le cellule in un mezzo LB fresco da 0,5 ml e trasferire le cellule in una tazza di reazione sterile da 1,5 ml. Aggiungere 0,5 ml di glicerolo sterile al 50%, mescolare la sospensione con un vortice rigoroso e conservare i campioni in un congelatore a -80 °C fino a un ulteriore trattamento.
7. Incubare le cellule che vengono lasciate nei contenitori di scuotimento per un massimo di 24 ore a 37 °C e 220 giri/min. Tenere i mastri di scuotimento al buio per evitare lo sbiancamento fotografico dei fluorofori.
8. Prelevare ulteriori campioni da 0,1 ml dopo 7 ore e 24 ore di crescita. Misurare e notare l'OD₆₀₀ di diluizioni 1:10 (in C-Glc o CE-Glc mezzo minimo) dei campioni.
9. Prendi la quantità appropriata di cellule da ogni coltura per creare criostock che hanno un OD₆₀₀ di 1,0. Conservare i campioni a -80 °C fino a un ulteriore trattamento.

3. Trattamento del campione, placcatura e incubazione per analisi quantitative

1. Dopo aver raccolto tutti i campioni, scongelare i criostock e diluire le cellule in una soluzione salina allo 0,9% (vedi tabella dei reagenti e dei materiali) fino a^10-3.
2. Piastra 0,1 ml delle^10-3 diluizioni su piastre di agar medie SP e distribuire le celle utilizzando pipette di vetro sterili.
3. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C al buio fino a quando non sono apparse singole colonie.

4. Conteggio dei sopravvissuti mediante microscopia a fluorescenza stereo per l'analisi quantitativa

1. Dividi il fondo della piastra dell'agar con una penna nera in quattro parti per un migliore orientamento mentre conti i sopravvissuti sotto il microscopio a fluorescenza stereo.
2. Posizionare la piastra capovolta al microscopio e mettere a fuoco le colonie utilizzando la fonte di luce fredda.
3. Una volta che le colonie sono a fuoco, passare al set di filtri appropriato per la PCP per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppoetichettato cfp. Conta i sopravvissuti di questo ceppo etichettando le colonie con una penna e annota il numero.
4. Rimuovere le etichette con etanolo e passare al filtro YFP impostato per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppo etichettato yfp. Conta di nuovo i sopravvissuti etichettando le colonie con una penna e annota il numero.

5. Trattamento del campione e microscopia per analisi semiquantitative

1. Per cifre illustrative, individuare 10 μl della diluizione^10-4 (circa 100 celle) dal passaggio 3.1 su una piastra di agar SP (vedere figura 3).
2. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C al buio fino a quando non sono apparse singole colonie.
3. Posizionare la piastra di Petri senza coperchio al microscopio e mettere a fuoco il punto utilizzando la fonte di luce fredda.
4. Scatta foto dei punti per figure illustrative. Scegli un tempo di esposizione appropriato per scattare le foto delle colonie con la fonte di luce fredda.
5. Senza spostare la piastra, passare al set di filtri CFP, regolare il tempo di esposizione e scattare una foto. Fai lo stesso con il set di filtri YFP e salva le immagini per ulteriori analisi.

6. Analisi dei dati

1. Utilizzare software come Excel per le analisi quantitative dei dati. In base alle colonie contate, calcola la percentuale di colonie gialle e blu rispetto all'intero numero di colonie, che sono impostate al 100%.
2. Utilizzare i numeri calcolati per creare un diagramma a barre in pila (vedere figura 4 e figura 5). Utilizzate un programma di elaborazione delle immagini come Adobe Photoshop per costruire immagini unite delle immagini scattate dai diversi punti. In alternativa, il software liberamente disponibile ImageJ, scaricabile da http://rsbweb.nih.gov/ij/ può essere utilizzato per l'elaborazione delle immagini.
3. Aprire le immagini da un punto scattate con il set di filtri CFP e il set di filtri YFP. Ottimizza il contrasto e la luminosità per ridurre la fluorescenza di fondo dal supporto.
4. Passare a una delle immagini e selezionare tutte. Copiare l'immagine e incollarla nell'altra immagine.
5. Utilizzare la funzione "schivare il colore" per unire le immagini o sovrapporre le immagini fluorescenti utilizzando la scheda canali. Immagini unite delle colonie da diversi media e diversi punti di tempo rappresentano la crescita dei diversi ceppi all'interno della coltura liquida.

7. Suggerimenti specifici: esperimento di commutazione di colorante e cocultivazione di ceppi isogenici etichettati con cfp e yfp

L'espressione di uno dei due geni codificanti al fluoroforo in B. subtilis potrebbe influenzare la forma fisica e quindi il tasso di crescita dei batteri. Pertanto, si raccomanda di eseguire i seguenti esperimenti al fine di escludere che l'eliminazione di un ceppo concorrente dalla popolazione cellulare durante la coltivazione sia semplicemente dovuta a un effetto negativo del fluoroforo:

1. Ripetere l'intero esperimento e cocultivare ceppi etichettati inversamente (ad esempio, il ceppo precedente etichettato cfpè ora etichettato con il gene yfp e viceversa). Sebbene inversi, i risultati ottenuti dovrebbero essere paragonabili all'osservazione precedente secondo cui un ceppo ha un vantaggio di crescita selettivo rispetto all'altro ceppo.
2. Ripetere l'intero esperimento e cocultivare i ceppi isogenicietichettati con yfp e cfp ( ad esempio BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Stimare l'effetto negativo di uno dei due fluorofori sulla forma fisica dei batteri seguendo la composizione della popolazione cellulare nel tempo.

Risultati

Il metodo qui descritto è stato applicato con successo per visualizzare la concorrenza intraspecie in una popolazione cellulare costituita da ceppi di B. subtilis etichettati rispettivamente con i geni cfp e yfp che codificano i fluorofori CFP e YFP. Come illustrato nella figura 3, il metodo può essere utilizzato per visualizzare la concorrenza intraspecie in modo molto illustrativo. Individuando i campioni su piccole aree, la composizione clonale della popolazione cellulare è ...

Discussione

Diversi metodi sono stati sviluppati per analizzare la forma fisica competitiva dei^{batteri 16}. In molti casi i batteri sono stati etichettati con diverse cassette di resistenza agli antibiotici¹⁷. Simile al nostro approccio, l'etichettatura delle cellule con cassette di resistenza agli antibiotici consente la valutazione della forma fisica competitiva dei batteri durante la cocultivazione in condizioni di crescita definite. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per determinare la forma fisica...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(NH4)2SO4	Roth, Germania	3746
Agar	Difco, USA	214010
Citrato ferrico di ammonio (CAF)	Sigma-Aldrich, Germania	9714
CaCl2	Roth, Germania	5239
Glucose	Applichem, Germania	A3617
Glycerol	Roth, Germania	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Germania	6878
KCl	Applichem, Germania	A3582
KH2PO4	Roth, Germania	3904
KOH	Roth, Germania	6751
MgSO4• 7H2O	Roth, Germania	P027
MnCl2	Roth, Germania	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Germania	102786
NaCl	Roth, Germania	9265
Brodo nutriente	Roth, Germania	X929
Glutammato di potassio	Applichem, Germania	A3712
Triptone	Roth, Germania	8952
Triptofano	Applichem, Germania	A3445
Estratto di lievito	Roth, Germania	2363
1,5 ml Provette di reazione	Sarstedt, Germania	72.690.001
2,0 ml Provette di reazione	Sarstedt, Germania	72.691
15 ml Provette di plastica con tappo a vite	Sarstedt, Germania	62.554.001
Piastre di Petri	Sarstedt, Germania	82.1473
1,5 ml Cuvette in polistirene	Sarstedt, Germania	67.742
Provette di coltura in vetro da 15 ml	Marca, Germania	7790 22
Palloni da 100 ml con tappi in alluminio Marca	, Germania	928 24
Pipette sterili in vetro da 10 ml	Marca, Germania	278 23
Incubatrice (28 e 37 ° C)	New Brunswick	M1282-0012
Set di pipette standard (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1.000 μ l)	Eppendorf, Germania	4910 000.034, 4910 000.042,Centrifuga
da tavolo per provette di reazione da 1,5 e 2 ml	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germania	75002425
Centrifuga da tavolo per provette in plastica da 15 ml	Heraeus Biofuge Primo R, Germania	75005440
Spettrofotometro standard	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germania	80-2112-21
Microscopio a stereofluorescenza	Zeiss SteREO Lumar V12, Germania	495008-0009-000
Congelatore (-20 e -80 ° C)	-	-
Frigorifero (4 gradi; C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4,	Germania-pHmetro
	pH-metro 766, Calimatic, Knick, Germania	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germania	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germania	sostituito da
Black pen (pennarello indelebile)	Staedler, Germania	317-9
Programma Powerpoint	Microsoft, USA-Office
Programma Excel	Microsoft, USA-Programma		per l'elaborazione dei dati
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	sostituito da CS6, download	Programma per computer per l'elaborazione delle immagini
PC	o	Mac-ZEN
pro 2011 software per il microscopio	a stereofluorescenzaZeiss, Germania	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Ottenuto tramite Zeiss
Ricette di soluzioni specifiche
SP Medium
8 g Brodo
0.25 mg MgSO4• 7H2O
1 g KCl
15 g di agar per terreno			se necessario
aggiungere 1 L con autoclave H2O			per 20 min a 121 gradi; C
1 ml di CaCl2 (0,5 M), sterilizzato per filtrazione
1 ml di MnCl2 (10 mM), sterilizzato per filtrazione
2 ml di citrato ferrico ammonico (CAF, 2,2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
LB Medium
10 g di Triptone
5 g Estratto
10 g NaCl
15 g agar per LB solido medio			se necessario
aggiungere 1 L con autoclave H2O			per 20 min a 121 gradi C
C-Glc Minimo Medio
200 ml 5 x Sali C
10 ml L-Triptofano (5 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml di citrato ferrico di ammonio (CAF, 2.2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml di sali
25 ml Glucosio (20%)			autoclavato per 20 minuti a 121 gradi C
aggiungere 1 L con H2O
CE-Glc Medium minimo
200 ml 5 x Sali C
10 ml di L-Triptofano (5 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml di citrato ferrico di ammonio (CAF, 2,2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml III’ sali
20 ml Glutammato (40%)
25 ml Glucosio (20%), autoclavato per 20 min a 121 gradi C
aggiungere 1 L con H2O
sterili 5 x C sali
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4&toro; 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
aggiungere 1 L con autoclave sterile H2O			per 20 minuti a 121 gradi; Sali
			III'
0,232 g MnSO4• 4H2O
12,3 g MgSO4• 7H2O
aggiungere 1 L con H2O sterile, autoclave per 20 min a 121 gradi; C
40% Soluzione
200 g di acido
regolare il pH a 7,0 aggiungendo circa 80 g KOH
aggiungere 0,5 L con autoclave sterile H2O			per 20 minuti a 121 gradi; C
0.9% Soluzione salina (NaCl)
aggiungere 1 L con autoclave sterile H2O			per 20 min a 121 ° C
50% soluzione di glicerolo
295 ml di glicerolo (87%)
aggiungere 0,5 L con autoclave sterile H2O			per 20 minuti a 121 gradi; C
Batteri (Tutti i ceppi sono basati sul ceppo Bacillus subtilis 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)			di ceppi di laboratorio
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)