Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Sommario

I batteri possono accumulare mutazioni dannose o benefiche durante la loro vita. In una popolazione di cellule individui che hanno accumulato mutazioni benefiche possono rapidamente sovracompetire i loro simili. Qui presentiamo una procedura semplice per visualizzare la competizione intraspecie in una popolazione di cellule batteriche nel tempo utilizzando individui etichettati fluorescentmente.

Abstract

Molti microrganismi come i batteri proliferano estremamente velocemente e le popolazioni possono raggiungere alte densità cellulari. Piccole frazioni di cellule in una popolazione hanno sempre mutazioni accumulate che sono dannose o benefiche per la cellula. Se l'effetto di forma fisica di una mutazione fornisce alla sottopopolazione un forte vantaggio di crescita selettiva, gli individui di questa sottopopolazione possono rapidamente sovracompetarsi e persino eliminare completamente i loro compagni immediati. Pertanto, piccoli cambiamenti genetici e accumulo di cellule basate sulla selezione che hanno acquisito mutazioni benefiche possono portare a uno spostamento completo del genotipo di una popolazione cellulare. Qui presentiamo una procedura per monitorare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione di cellule batteriche nel tempo per cocultivazione di individui etichettati fluorescentmente del batterio modello Gram-positivo Bacillus subtilis. Il metodo è facile da eseguire e molto illustrativo per mostrare la competizione intraspecie tra gli individui in una popolazione di cellule batteriche.

Introduzione

I batteri del suolo sono solitamente dotati di reti normative flessibili e ampie capacità metaboliche. Entrambe le caratteristiche consentono alle cellule di regolare i loro percorsi catabolici e anabolizzanti per competere con i loro simili e altri microrganismi per i nutrienti, che sono disponibili in una data nicchia ecologica¹. Tuttavia, se i batteri non sono in grado di adattarsi al loro ambiente, altri meccanismi possono causare la sopravvivenza di una specie. Infatti, poiché molti batteri proliferano rapidamente e le popolazioni possono raggiungere sottopopolazioni ad alta densità cellulare possono avere mutazioni benefiche accumulate spontaneamente ....

Protocollo

1. Preparazione di piatti Agar, media culturali, criostock e preculture

1. Preparare i mezzi di crescita e i reagenti richiesti (vedi tabella dei materiali e dei reagenti).
2. Striature i ceppi di B. subtilis (ad es. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) esprimendo rispettivamente uno e due GDH attivi)² che saranno utilizzati nell'esperimento di competizione su piastre di agar medie SP per ottenere singole colonie. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.

Risultati

Il metodo qui descritto è stato applicato con successo per visualizzare la concorrenza intraspecie in una popolazione cellulare costituita da ceppi di B. subtilis etichettati rispettivamente con i geni cfp e yfp che codificano i fluorofori CFP e YFP. Come illustrato nella figura 3, il metodo può essere utilizzato per visualizzare la concorrenza intraspecie in modo molto illustrativo. Individuando i campioni su piccole aree, la composizione clonale della popolazione cellulare è .......

Discussione

Diversi metodi sono stati sviluppati per analizzare la forma fisica competitiva dei^{batteri 16}. In molti casi i batteri sono stati etichettati con diverse cassette di resistenza agli antibiotici¹⁷. Simile al nostro approccio, l'etichettatura delle cellule con cassette di resistenza agli antibiotici consente la valutazione della forma fisica competitiva dei batteri durante la cocultivazione in condizioni di crescita definite. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per determinare la forma fisica.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(NH4)2SO4	Roth, Germania	3746
Agar	Difco, USA	214010
Citrato ferrico di ammonio (CAF)	Sigma-Aldrich, Germania	9714
CaCl2	Roth, Germania	5239
Glucose	Applichem, Germania	A3617
Glycerol	Roth, Germania	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Germania	6878
KCl	Applichem, Germania	A3582
KH2PO4	Roth, Germania	3904
KOH	Roth, Germania	6751
MgSO4• 7H2O	Roth, Germania	P027
MnCl2	Roth, Germania	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Germania	102786
NaCl	Roth, Germania	9265
Brodo nutriente	Roth, Germania	X929
Glutammato di potassio	Applichem, Germania	A3712
Triptone	Roth, Germania	8952
Triptofano	Applichem, Germania	A3445
Estratto di lievito	Roth, Germania	2363
1,5 ml Provette di reazione	Sarstedt, Germania	72.690.001
2,0 ml Provette di reazione	Sarstedt, Germania	72.691
15 ml Provette di plastica con tappo a vite	Sarstedt, Germania	62.554.001
Piastre di Petri	Sarstedt, Germania	82.1473
1,5 ml Cuvette in polistirene	Sarstedt, Germania	67.742
Provette di coltura in vetro da 15 ml	Marca, Germania	7790 22
Palloni da 100 ml con tappi in alluminio Marca	, Germania	928 24
Pipette sterili in vetro da 10 ml	Marca, Germania	278 23
Incubatrice (28 e 37 ° C)	New Brunswick	M1282-0012
Set di pipette standard (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1.000 μ l)	Eppendorf, Germania	4910 000.034, 4910 000.042,Centrifuga
da tavolo per provette di reazione da 1,5 e 2 ml	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germania	75002425
Centrifuga da tavolo per provette in plastica da 15 ml	Heraeus Biofuge Primo R, Germania	75005440
Spettrofotometro standard	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germania	80-2112-21
Microscopio a stereofluorescenza	Zeiss SteREO Lumar V12, Germania	495008-0009-000
Congelatore (-20 e -80 ° C)	-	-
Frigorifero (4 gradi; C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4,	Germania-pHmetro
	pH-metro 766, Calimatic, Knick, Germania	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germania	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germania	sostituito da
Black pen (pennarello indelebile)	Staedler, Germania	317-9
Programma Powerpoint	Microsoft, USA-Office
Programma Excel	Microsoft, USA-Programma		per l'elaborazione dei dati
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	sostituito da CS6, download	Programma per computer per l'elaborazione delle immagini
PC	o	Mac-ZEN
pro 2011 software per il microscopio	a stereofluorescenzaZeiss, Germania	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Ottenuto tramite Zeiss
Ricette di soluzioni specifiche
SP Medium
8 g Brodo
0.25 mg MgSO4• 7H2O
1 g KCl
15 g di agar per terreno			se necessario
aggiungere 1 L con autoclave H2O			per 20 min a 121 gradi; C
1 ml di CaCl2 (0,5 M), sterilizzato per filtrazione
1 ml di MnCl2 (10 mM), sterilizzato per filtrazione
2 ml di citrato ferrico ammonico (CAF, 2,2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
LB Medium
10 g di Triptone
5 g Estratto
10 g NaCl
15 g agar per LB solido medio			se necessario
aggiungere 1 L con autoclave H2O			per 20 min a 121 gradi C
C-Glc Minimo Medio
200 ml 5 x Sali C
10 ml L-Triptofano (5 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml di citrato ferrico di ammonio (CAF, 2.2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml di sali
25 ml Glucosio (20%)			autoclavato per 20 minuti a 121 gradi C
aggiungere 1 L con H2O
CE-Glc Medium minimo
200 ml 5 x Sali C
10 ml di L-Triptofano (5 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml di citrato ferrico di ammonio (CAF, 2,2 mg/ml), sterilizzato per filtrazione
10 ml III’ sali
20 ml Glutammato (40%)
25 ml Glucosio (20%), autoclavato per 20 min a 121 gradi C
aggiungere 1 L con H2O
sterili 5 x C sali
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4&toro; 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
aggiungere 1 L con autoclave sterile H2O			per 20 minuti a 121 gradi; Sali
			III'
0,232 g MnSO4• 4H2O
12,3 g MgSO4• 7H2O
aggiungere 1 L con H2O sterile, autoclave per 20 min a 121 gradi; C
40% Soluzione
200 g di acido
regolare il pH a 7,0 aggiungendo circa 80 g KOH
aggiungere 0,5 L con autoclave sterile H2O			per 20 minuti a 121 gradi; C
0.9% Soluzione salina (NaCl)
aggiungere 1 L con autoclave sterile H2O			per 20 min a 121 ° C
50% soluzione di glicerolo
295 ml di glicerolo (87%)
aggiungere 0,5 L con autoclave sterile H2O			per 20 minuti a 121 gradi; C
Batteri (Tutti i ceppi sono basati sul ceppo Bacillus subtilis 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)			di ceppi di laboratorio
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)

nutriente SP solido di lievitoIII'Cdi glutammatoL-glutammicoRaccolta