Fagociti giocano un ruolo importante nel sistema immunitario innato rimuovendo ed eliminando microrganismi invasori nelle loro fagosomi. Phagosome maturazione è un processo complesso e strettamente regolata durante la quale un phagosome nascente subisce drastica trasformazione attraverso le interazioni ben orchestrate, con vari organuli cellulari e scomparti nel citoplasma. Questo processo, che è essenziale per la funzione fisiologica di fagociti dotando phagosomes con le loro proprietà litici e battericide, culmina nella fusione di phagosomes con i lisosomi e biogenesi dei phagolysosomes che è considerato come l'ultimo e fondamentale fase di maturazione per phagosomes. In questo rapporto, descriviamo un metodo basato imaging cellulare dal vivo per l'analisi qualitativa e quantitativa del processo dinamico di lisosomi per phagosome fornitura di contenuti, che è una caratteristica di fagolisosoma biogenesi. Questo approccio utilizza microsfere IgG rivestite come modello per phagocytosis e molecole di destrano fluoroforo coniugato come sonda carico lisosomiale luminale, per seguire la consegna di contenuto dinamico lysosmal ai fagosomi in tempo reale in macrofagi vivi usando time-lapse imaging e microscopia confocale. Qui si descrive nel dettaglio sullo sfondo, le fasi di preparazione e la configurazione step-by-step sperimentale per consentire la distribuzione facile e precisa di questo metodo in altri laboratori. Il nostro metodo descritto è semplice, robusta e, soprattutto, può essere facilmente adattato per studiare le interazioni phagosomal e maturazione in sistemi diversi e in varie impostazioni sperimentali, come l'uso di vari tipi di fagociti, la perdita di funzione esperimenti, diverse sonde, e particelle fagociti.
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Articolo metodologico
Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta
In questo articolo
Abstract
Introduzione
Fagociti professionali, tra macrofagi, svolgono un fondamentale nel sistema immunitario. Oltre ad essere la prima linea di difesa del sistema immunitario innato, ma anche svolgere un ruolo critico nella attivazione della immunità adattativa attraverso la loro segnalazione e presentanti l'antigene ruolo 1-3. Mentre la funzione dei fagociti professionali è multiforme, phagosome maturazione è la spina dorsale critico della funzione di elaborazione battericida ed antigene dei fagociti professionali 4,5. Su engulfment recettore mediata e l'assorbimento di un bersaglio fagocitaria, come batteri, phagosome nascente passa attraverso una sequenza....
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Protocollo
Cura degli animali e di tutte le procedure in questo protocollo seguono le linee guida istituzionali e nazionali.
Preparare i preparativi che sono indicati da "Π-" in anticipo.
1. Preparazione di BMMs
- Eseguire l'abbattimento dei topi da dislocazione cervicale.
- Rimuovere femore e tibia ossa, ossa liberi dal tessuto e tagliare le due estremità per l'accessibilità del midollo osseo.
- Mantenere ossa in PBS freddo o medio DMEM ghiacciata (integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina, su ghiaccio fino alla fase successiva.
Nota: Ese....
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Risultati
La corretta preparazione delle cellule e le perline per l'imaging è critica. Figura 1 mostra il profilo della semina, sonda-loading e gradini di imaging iniziale, in questo metodo, basato sulla nostra protocollo ottimizzato per BMMs. È pertanto indispensabile che i parametri di protocollo testati e ottimizzati a seconda del tipo di cellule e sonde che devono essere utilizzati.
Dopo l'aggiunta delle perline rivestite con IgG verso le cellule precaricati, è importante .......
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Discussione
Nella sezione seguente si discuterà fasi critiche del metodo presentato e le sue limitazioni. Inoltre, ci si collegherà alcuni dei problemi comuni con le loro soluzioni, introdurre eventuali modifiche e valutare i vantaggi del nostro metodo così come i metodi complementari adatti per questo approccio.
La preparazione delle perline, compreso l'accoppiamento di IgG di superficie delle sfere, è cruciale e l'uso di preparati unfresh dovrebbe essere evitata. In aggiunta a ciò, è anche fon.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del Laboratorio di Biologia phagosome per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione Helmholtz Young Investigator (Iniziativa e Networking fondi dell'Associazione Helmholtz) e un programma di priorità SPP1580 Concessione del Consiglio per la ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium senza rosso fenolo (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetale Siero Bovino (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutammina | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillina/Streptomicina | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Piatto con fondo in vetro (35 mm &vuoto;, #1.5) | WillCo Wells, Paesi Bassi | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM piatto con fondo in vetro, 35 mm | Greiner Bio one, Germania | 627871 | Alternativa: Disponibile come |
| microsfere di lattice carbossilato | Polysciences, USA | #09850 | Disponibile in diversi diametri, abbiamo usato 3 μ m |
| Microparticelle di polistirene | Kisker Biotech, Germania | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germania | 305.1.3 | |
| topo intero IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC reticolante | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich, USA | T1503 | |
| siringa da 1 ml Omnifix -F | B.Braun, Germania | 9161406V | |
| 26 Ago G (0,45 * 25 mm) | B.Baun, Germania | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Siero di cavallo | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES idratare | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0,2 μ Filtro montato su siringa M | Sartorius, Germania | 83.1826.001 |
Riferimenti
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
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Ristampe e permessi
