Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey

Sommario

Le misurazioni elettroniche di von Frey sono un'alternativa efficace e migliorata ai classici filamenti di von Frey, in quanto consentono una misurazione rapida e precisa dei cambiamenti nelle soglie di prelievo meccanico dei roditori agli stimoli di pressione applicati continuamente prima e dopo un evento infiammatorio.

Abstract

Misurare i cambiamenti indotti dall'infiammazione nelle soglie di ritiro della zampa posteriore dalla pressione meccanica è una tecnica utile per valutare i cambiamenti nella percezione del dolore nei roditori. Le soglie di astinenza possono essere misurate prima al basale e poi dopo il farmaco, il veleno, la lesione, l'allergene o l'infiammazione evocata in altro modo applicando una forza accurata su aree molto specifiche della pelle. Un apparato elettronico di von Frey consente una valutazione precisa delle soglie di ritiro delle zampe posteriori del topo che non sono limitate dalle dimensioni dei filamenti disponibili, a differenza delle classiche misurazioni di von Frey. La facilità e la rapidità delle misurazioni consentono l'incorporazione della valutazione degli esiti della sensibilità tattile in diversi modelli di dolore infiammatorio e neuropatico a rapida insorgenza, poiché è possibile effettuare più misurazioni in un breve periodo di tempo. Le misurazioni sperimentali per i singoli soggetti roditori possono essere controllate internamente rispetto alle risposte di base individuali e ai criteri di esclusione facilmente stabiliti per standardizzare le risposte di base all'interno e tra i gruppi sperimentali. Pertanto, le misurazioni con un apparato elettronico di von Frey rappresentano un'utile modifica dei ben consolidati saggi classici basati sui filamenti di von Frey per l'allodinia meccanica dei roditori che possono essere applicati anche ad altri modelli di mammiferi non umani.

Introduzione

Le malattie croniche non trasmissibili sono responsabili di una quota sproporzionata del carico umano di mortalità e morbilità¹. Il dolore cronico è sempre più riconosciuto come una componente importante del carico globale di malattia². Ciò ha dato un grande impulso alle innovazioni nella prevenzione, nella gestione e nel trattamento del dolore. Allo stesso tempo, ci sono abbondanti prove che la biologia sottostante al dolore è il complesso³. I meccanismi alla base del dolore protettivo, disadattivo e cronico indicano un'intricata interazione tra il sistema immunitario e quello nervoso^3,4. La delucidazione di questi meccanismi richiede approcci sperimentali quantitativi rigorosi e riproducibili, dalla dissezione molecolare all'analisi comportamentale.

I modelli di roditori sono stati preziosi nella caratterizzazione degli attori molecolari del dolore infiammatorio e neuropatico⁵. La riduzione del tempo e dell'intensità delle risposte precedentemente specificate agli stimoli nocivi viene utilizzata per misurare gli stati di dolore in questi animali, poiché i soggetti roditori non sono altrimenti in grado di riportare una sensazione di dolore⁶. Le risposte alterate alla temperatura e alla pressione sono comunemente usate come metriche della sensibilità tissutale nei modelli di roditori di nocicezione infiammatoria che può essere causata da infezione^7,8, esposizione chimica^{6, 9,10}, incisione chirurgica¹¹, nonché dolore neuropatico causato dalla legatura dei nervi¹².

La sensibilità meccanica, o risposta agli stimoli di pressione, viene spesso misurata utilizzando i classici filamenti di von Frey (CvF) - una serie (ad esempio 0,4-15 g¹³) di punte pesate applicate manualmente per testare il tessuto in incrementi seriali fino a quando i comportamenti del dolore non sono indotti nei controlli rispetto ai soggetti sperimentali. Esistono vari metodi per utilizzare queste punte o peli per valutare la sensibilità meccanica^6,13; Il metodo più frequentemente utilizzato è il seguente. Una punta con una certa pressione (all'interno della serie; ad esempio 2 g¹³) viene selezionato come punto di partenza e la soglia di ritiro del 50% di un ratto o di un topo (l'intensità dello stimolo richiesta per produrre una risposta il 50% delle volte in cui la punta viene applicata al tessuto) viene determinata spostandosi verso l'alto e verso il basso del peso della punta in base alla visualizzazione di comportamenti di risposta precedentemente specificati¹³. Le soglie assolute di astinenza del 50% per i gruppi di trattamento vengono quindi confrontate tra i punti temporali basali e post-trattamento. Questa tecnica manuale richiede molto tempo. Oltre all'aumento del tempo trascorso da ciascun soggetto confinato in una camera di von Frey, questo aumenta anche il numero di volte in cui le punte di prova di vari pesi vengono applicate al tessuto infiammato causando un maggiore disagio ai roditori nello studio. Inoltre, vengono calcolate e confrontate soglie di prelievo del 50% tra gruppi di roditori; Le risposte individuali dei soggetti sperimentali non sono tipicamente normalizzate alle loro risposte basali individuali non trattate con, per quanto ne sappiamo, un'eccezione⁶. Di conseguenza, i soggetti roditori non vengono solitamente segnalati come assegnati ai gruppi di trattamento sulla base di risposte di base coerenti all'interno di un intervallo precedentemente determinato e nemmeno i singoli soggetti vengono valutati sulla base di una serie di criteri di esclusione applicati in modo coerente che consentono di standardizzare le risposte di base per qualsiasi particolare serie di studi e saggi.

Qui, presentiamo un metodo alternativo per misurare la sensibilità tattile delle zampe posteriori del topo dopo l'esposizione al veleno di Bothrops jararaca utilizzando un apparato elettronico di von Frey (EvF). Cunha e colleghi⁶ hanno aperto la strada all'uso delle tecniche EvF nei roditori e hanno sistematicamente confrontato l'efficacia di CvF ed EvF per dimostrare che EvF fornisce "una misura più sensibile, oggettiva e quantitativa" della sensibilità tattile nei modelli di roditori di dolore infiammatorio. In breve, nelle misurazioni EvF, una punta von Frey in polipropilene non igroscopico di diametro uniforme (0,8 mm) di rigidità adeguata per il tessuto da testare è collegata a una sonda elettronica e a un lettore che mostra la forza/peso con cui il roditore si ritrae dalla punta. Ci sono diverse differenze importanti tra le misurazioni CvF ed EvF. In primo luogo, il processo di misurazione delle risposte di base e sperimentali utilizzando l'EvF è notevolmente semplificato poiché la pressione sulla zampa posteriore può essere applicata con forza crescente fino a quando non c'è una risposta e non è necessario cambiare le punte come in CvF; Gli animali trascorrono meno tempo confinati nelle camere di saggio e sono quindi meno stressati e più a loro agio durante un esperimento. In secondo luogo, l'EvF consente una relativa facilità di implementazione dei criteri di esclusione razionale per i soggetti dello studio sotto forma di intervalli di soglie di base accettabili. Ciò consente la standardizzazione delle risposte di base all'interno e tra i gruppi di trattamento. In terzo luogo, la risposta di un soggetto a seguito di un trattamento sperimentale viene sempre confrontata con la propria risposta basale individuale, creando importanti controlli interni per le misurazioni. In quarto luogo, l'accuratezza delle soglie di prelievo viene registrata a un livello di risoluzione più elevato, poiché la pressione può essere applicata in modo continuo piuttosto che in incrementi disponibili sotto forma di pesi di filamenti manuali. Come per i saggi CvF ben progettati, anche gli esperimenti basati su EvF vengono eseguiti con lo stesso investigatore (cieco al trattamento) che applica la forza e registra i comportamenti di risposta. È importante notare che questa tecnica richiede tempo e impegno da parte dei ricercatori per stabilire la coerenza interna delle misurazioni e richiede che gli esperimenti siano pianificati in modo tale da tenere tolleranze appropriate per i topi che potrebbero dover essere esclusi a causa di risposte basali incoerenti.

Una valutazione della sensibilità meccanica facile da implementare, efficace e ben controllata facilita l'aggiunta della valutazione comportamentale a modelli di eventi infiammatori come l'avvelenamento - l'esempio che abbiamo usato qui per illustrare le capacità e la potenza delle misurazioni EvF nella misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile. Abbiamo scoperto che i topi svizzeri ND4 maschi hanno mostrato una maggiore sensibilità meccanica dopo l'iniezione di veleno derivato dalla vipera sudamericana Bothrops jararaca nella zampa posteriore. Le risposte comportamentali sono state accompagnate da edema, afflusso di neutrofili e degranulazione dei mastociti nel tessuto interessato.

Protocollo

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) del Macalester College ha approvato tutti i protocolli. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi svizzeri ND4 maschi di 8-12 settimane.

1. Preparazione e iniezione del veleno di Bothrops jararaca

1. ATTENZIONE: Il veleno di B. jararaca è tossico. Indossare guanti, maschera e protezione per gli occhi quando si maneggia la polvere e si preparano le soluzioni.
2. Somministrare 45 μg/kg di veleno di B. jararaca (regime determinato da precedenti esperimenti dose-risposta) o un veicolo salino allo 0,9% (10 μl) tramite iniezione intraplantare in entrambe le zampe posteriori utilizzando siringhe da insulina da 3/10 ml con aghi da 29 G x 1/2. Nota: A seconda del disegno sperimentale, le soluzioni di trattamento e di controllo possono essere iniettate separatamente rispettivamente in ciascuna zampa posteriore per fornire controlli interni all'interno di ciascun soggetto.

2. Configurazione e funzionamento dell'apparato elettronico von Frey

1. Posizionare l'unità elettronica von Frey sul supporto della sonda. Assicurarsi che la sonda e il cavo siano collegati correttamente all'unità display e accendere lo strumento. Impostare il valore di lettura su zero (0,00 g) nella modalità di configurazione e posizionare delicatamente il peso di prova fornito (5,00 g) sul cono della sonda von Frey.
2. Registrare la lettura su un quaderno di laboratorio e ripetere questa procedura al termine della sessione di test. Se si verifica una discrepanza superiore a 0,20 g tra le letture del peso di prova prima e dopo la sessione di prova, o se la lettura fluttua una volta applicato il peso di prova, potrebbe essere necessaria una nuova calibrazione dell'apparecchio (da parte del produttore).
3. Per valutare la soglia di ritiro della zampa posteriore del topo, utilizzare l'apposita punta in polipropilene tra quelle fornite con la sonda. La scelta della punta dipende dal tessuto da sondare. Le punte rigide funzionano bene per il tessuto della zampa posteriore meno sensibile e più duro, mentre le punte semi-flessibili possono essere una scelta migliore per un'area più tenera come la cresta ano-genitale (Chatterjea, non pubblicato). Montare delicatamente la punta rigida sul cono della sonda.
4. Per registrare la pressione massima applicata, commutare la modalità di funzionamento da impostazione a funzionamento in modo tale che la pressione massima applicata venga registrata sul display. In questa modalità, la lettura della pressione massima applicata verrà salvata sullo schermo del display quando la sonda viene retratta.

3. Considerazioni generali per la valutazione della soglia di ritiro della zampa posteriore

1. Idealmente, sono necessari due ricercatori per misurare la soglia di ritiro della zampa posteriore (sensibilità meccanica) utilizzando un apparecchio EvF: uno per far funzionare l'apparato ed eseguire le misurazioni e un altro per trascrivere le misurazioni registrate e maneggiare i topi.
2. Al fine di ridurre le distorsioni, lo sperimentatore che utilizza l'apparecchiatura deve essere all'oscuro dei trattamenti e dei valori soglia di sospensione registrati. Inoltre, per garantire la coerenza tra le misurazioni, la stessa persona dovrebbe valutare tutte le soglie di prelievo di base e sperimentali.
3. Eseguire tutte le misurazioni in una stanza silenziosa e a temperatura controllata e alla stessa ora del giorno¹⁴.
4. Lo sperimentatore che registra le misurazioni dovrebbe posizionare ciascun topo in camere individuali di alloggiamento multiunità di polimetilmetacrilato (PMMA) posizionate su un supporto da pavimento a rete. Copri le camere con coperchi perforati in PMMA e posiziona sopra un oggetto pesante per evitare che i topi fuoriescano. Posizionare del materiale assorbente sotto il supporto per assorbire/raccogliere i rifiuti escreti. Lasciare che i topi si acclimatino per 15 minuti nelle camere prima della valutazione della soglia di prelievo basale o sperimentale ^6,7,10.
5. Le zampe posteriori dei topi devono essere facilmente accessibili attraverso le aperture del pavimento in rete; quindi, posizionare il supporto da pavimento in rete ad un'altezza comoda su un carrello con freni o su un piano di lavoro stabile accessibile da tutti i lati.
6. Durante le misurazioni, i topi potrebbero dover essere distratti con un pellet di cibo¹⁵ posizionato appena fuori dalla camera di misurazione o un rumore molto leggero prodotto picchiettando o facendo scorrere una penna lungo la rete metallica del pavimento della camera prima, ma non durante, la misurazione. Questo induce il mouse a rimanere fermo, consentendo allo sperimentatore di iniziare a effettuare le misurazioni più facilmente.

4. Valutazione della soglia di ritiro della zampa posteriore di base

1. La prima serie di misurazioni di base deve essere eseguita 48 ore prima della somministrazione del trattamento. Azzerare la sonda al montaggio della punta rigida. Usando due mani, sollevare lentamente la sonda per stimolare il centro (area del poggiapiedi) della zampa posteriore sinistra o destra (se entrambe le zampe hanno ricevuto lo stesso trattamento).
2. Aumentare gradualmente la pressione fino a quando non si osservano comportamenti di risposta nocicettiva definiti come la retrazione della zampa posteriore, il leccamento della zampa posteriore o il salto a quattro zampe^6,10. Istruire l'altro investigatore a trascrivere la pressione che ha suscitato il comportamento osservato.
3. Misurare la soglia di prelievo del topo situato nella camera adiacente. Continua fino a quando non hai valutato una volta le soglie di prelievo di ciascun topo. Ripetere altre quattro volte, in modo che ogni mouse venga misurato 5 volte come descritto in precedenza¹⁰.
4. Per ogni topo, calcola il valore mediano delle 5 misurazioni, quindi calcola quanto ogni valore si discosta dalla mediana. Seleziona 3 valori che si discostano meno e calcolane la media per ottenere una soglia di prelievo di base come descritto in precedenza¹⁰. In questa dimostrazione, la misurazione è stata standardizzata utilizzando 3 valori su 5; Sebbene il numero specifico di misurazioni possa variare in base al disegno sperimentale, è importante assicurarsi che tutti i topi vengano colpiti un numero uguale di volte per valutare le linee di base.
5. Ripetere le misurazioni di base 24 ore dopo. Effettuare 5 misurazioni per topo e fare la media delle 3 più vicine alla mediana per ottenere una soglia di astinenza di base.
6. Per calcolare la soglia di astinenza media al basale di un topo, calcolare la media delle soglie di astinenza al basale prese a 48 e 24 ore prima del trattamento. Se la soglia media di astinenza al basale è inferiore a 3,50 g, o se le due soglie al basale differiscono di 2,00 g o più, escludere il topo dall'esperimento. Questi criteri assicurano che tutti i topi nell'esperimento abbiano risposte di base coerenti e soglie di sospensione di base sufficientemente alte che consentano di osservare soglie più basse dopo il trattamento.
7. Nota: la soglia di esclusione dipenderà dal tessuto da sondare, dal ceppo degli animali studiati e dal tipo di punta utilizzata. Ad esempio, abbiamo scoperto che 3,5 g sono un utile punto di riferimento per il tessuto ND4 della zampa posteriore, ma le aree più dolenti come la cresta ano-genitale necessitano di una soglia di esclusione più bassa (Chatterjea, non pubblicato).
8. Assegnare i topi ai gruppi di trattamento in modo che la linea di base media di astinenza dei gruppi sperimentali sia il più simile possibile prima della somministrazione dei trattamenti.

Nota: le misurazioni di base possono essere eseguite prima di 48 ore prima di un esperimento. Tuttavia, devono essere completate almeno 2 serie di misurazioni di base a intervalli regolari prima dell'inizio dei trattamenti.

5. Valutazione sperimentale della soglia di ritiro della zampa posteriore

1. Valutare la soglia di ritiro della zampa posteriore (sensibilità meccanica) dopo il trattamento nei punti temporali appropriati determinati dal disegno dell'esperimento. Riportare i topi nelle loro gabbie con accesso a cibo e acqua subito dopo il completamento delle misurazioni.
2. Segui i passaggi descritti sopra; prendi 3 invece di 5 misurazioni per ridurre la possibilità di sovrastimolare il tessuto della zampa posteriore (trattata), soprattutto se la sensibilità deve essere valutata in più punti temporali. Se due misurazioni su tre effettuate differiscono di oltre 2,00 g, eseguire una quarta misurazione.
3. Calcolare la media di 3 misurazioni per ottenere la soglia di astinenza sperimentale per ciascun topo. Per tutti i topi per i quali sono state effettuate 4 misurazioni, calcolare la media di tre che si discostano meno dalla mediana, al fine di ottenere la soglia di ritiro sperimentale.
4. Per ottenere la soglia di sospensione delta per ciascun topo in un determinato momento, sottrarre il basale dalla soglia di sospensione sperimentale. Ripetere per tutti i topi e tutti i punti temporali sperimentali⁹.
5. Eseguire opportune analisi statistiche sui dati raccolti. In questo caso abbiamo utilizzato JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) per eseguire l'analisi post hoc dell'ANOVA unidirezionale e dell'HSD di Tukey.

Risultati

L'amministrazione locale del veleno di B. jararaca provoca cambiamenti nella sensibilità tattile della zampa posteriore e nell'edema dei tessuti nei topi maschi Swiss ND4.

1,5 ore dopo la somministrazione di 45 µg/kg di veleno di B. jararaca, topi maschi Swiss ND4 ritraevano le zampe posteriori a una pressione di 3,0 g inferiore rispetto al valore basale (Figura 1A). Il ritiro basale per tutti i gruppi avveniva a circa 4,5 g di pressione applicata; dopo il trattamento con veleno, i topi sperimentali ritraevano le zampe posteriori a una pressione di 1-1,5 g (dati non mostrati). I topi di controllo trattati con soluzione fisiologica mostravano una riduzione minima o nulla nella risposta alla pressione rispetto al valore basale in tutti i tempi sperimentali analizzati. Le soglie di risposta ridotte nei topi trattati sono state chiaramente mantenute a 3 e 6 ore dopo l'avvelenamento (Figura 1A) e risultavano indistinguibili dai controlli a 24 ore (dati non mostrati). Le zampe posteriori dei topi avvelenati presentavano edema tissutale caratteristico dell'infiammazione. A 1,5 ore dalla somministrazione del veleno, le zampe posteriori trattate, misurate come precedentemente descritto¹⁰, erano 1,5 mm più spesse rispetto al valore basale; l'edema è stato mantenuto fino a 3 e 6 ore (Figura 1B). Al contrario, le zampe trattate con soluzione fisiologica non hanno mostrato gonfiore né variazioni di spessore durante il periodo sperimentale. Per l'esperimento rappresentativo qui mostrato, un totale di 21 topi sono stati utilizzati per le misurazioni basali e 14 sono stati selezionati per l'inclusione nell'esperimento. Sono stati assegnati ai gruppi di trattamento in modo che le risposte medie di ritiro al valore basale fossero di circa 4,5 g per ciascun gruppo nel complesso.

I cambiamenti indotti dal veleno di B. jararaca nella sensibilità tattile sono accompagnati dalla degranulazione dei mastociti e dall'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori di topi maschi Swiss ND4.

Oltre all'aumento della sensibilità tattile e all'edema tissutale, abbiamo anche valutato l'afflusso di neutrofili (Figure 2A-B) e la degranulazione dei mastociti (Figure 2C-D) nei piedi posteriori di topi avvelenati rispetto a quelli trattati con soluzione salina. I neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a essere reclutate in una lesione dalla circolazione ed è noto che mediino le risposte nocicettive infiammatorie^10,16,17. I mastociti sono cellule sentinella residenti nei tessuti¹⁸ e la loro degranulazione è stata associata a risposte nocicettive nel piede posteriore del topo¹⁰ e nella dura madre del ratto¹⁹.

In questo studio, abbiamo osservato che l'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori inoculate con veleno era aumentato di quasi 1.000 volte rispetto alle zampe posteriori trattate con soluzione salina (Figura 3A), valutato mediante conteggio di sezioni sagittali plantari di tessuto in paraffina da 4 µm colorate con ematossilina-eosina¹⁰, prelevate 1,5 ore dopo la somministrazione del veleno da topi sacrificati.

Nelle zampe trattate con soluzione salina, i mastociti plantari nel tessuto della zampa posteriore erano per lo più integri o mostravano una lieve degranulazione (Figura 3B). Al contrario, le zampe posteriori intossicate mostravano una degranulazione moderata ed estesa dei mastociti nel 15-20% dei casi (Figura 3B). Le sezioni di tessuto descritte in precedenza sono state colorate con blu di toluidina e il numero di granuli visibili è stato contato per ogni mastocita osservato al fine di determinare lo stato di degranulazione, come descritto in precedenza¹⁰.

Figura 1. L'amministrazione locale del veleno di B. jararaca provoca variazioni della sensibilità meccanica della zampa posteriore e edema tissutale nei topi maschi Swiss ND4. Le soglie di ritrazione di base e la larghezza iniziale della zampa sono state valutate rispettivamente 48 e 24 ore prima del trattamento intraplantare con veleno di B. jararaca (Bjv; 45 µg/kg) o con soluzione fisiologica (10 µl). Le soglie di ritrazione sono state misurate a 1,5, 3 e 6 ore dopo il trattamento (A). La larghezza media della zampa (valore medio della larghezza della zampa sinistra e destra di un topo) nella regione medio-plantare è stata valutata mediante calibro digitale al basale e successivamente a 1,5, 3 e 6 ore dopo il trattamento, al fine di determinare l'edema tissutale come precedentemente descritto¹⁰ (B). Le significatività sono state confrontate con i topi trattati con soluzione fisiologica (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 rispettivamente). n = 10-11 topi per gruppo di trattamento. Clicca qui per visualizzare l'immagine in dimensioni maggiori.

Figura 2. B. jararaca l'ipersensibilità meccanica indotta dal veleno è accompagnata dalla degranulazione dei mastociti e dall'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori di topi maschi ND4 Swiss 3 topi/trattamento sono stati sottoposti a eutanasia mediante CO₂ a 1,5 ore dal trattamento e le loro zampe posteriori sono state escisse, conservate in formalina al 10% per 24 ore, trasferite in etanolo al 70%, decalcificate per 1-2 settimane in EDTA al 15% e incluse in paraffina. 4 µm sezioni sagittali sono state colorate con ematossilina-eosina (A-B) e blu di toluidina (C-D) per la visualizzazione dei neutrofili (A-B) e mastociti (C-D), rispettivamente. Le immagini sono state acquisite a 400X e 1.000X come indicato. Clicca qui per visualizzare l'immagine a dimensione maggiore. 

Figura 3. La sensibilità meccanica indotta dal veleno di B. jararaca è accompagnata da aumenti significativi nei livelli di degranulazione dei mastociti e nell'afflusso di neutrofili nelle zampe posteriori di topi maschi ND4 Swiss. I neutrofili e i mastociti su sezioni di tessuto colorate sono stati contati utilizzando un microscopio Olympus CX21LED. I neutrofili sono stati contati in 3 zampe posteriori per trattamento, dalla caviglia alle dita, in campi adiacenti a un ingrandimento di 400X  (A). I mastociti sono stati contati in 3 cuscinetti plantari per trattamento e il loro stato di degranulazione è stato valutato in base al numero di granuli visibili al di fuori del contorno cellulare: intatto (0), lieve (0-10), moderato (10-20), esteso (21+), come descritto in precedenza¹⁰ (B).  Per evitare di contare due volte le stesse cellule, i ricercatori che valutavano il numero di neutrofili e i livelli di degranulazione dei mastociti nelle sezioni delle zampe posteriori hanno utilizzato una griglia riportata nel reticolo dell'oculare. I ricercatori erano ciechi rispetto ai trattamenti. Le significatività sono state confrontate con i topi trattati con soluzione salina (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 rispettivamente). n =3 topi per gruppo di trattamento.  Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Discussione

La misurazione dei cambiamenti nelle risposte di astinenza è uno strumento importante utilizzato per valutare i cambiamenti nella sensibilità tattile nei modelli di dolore e infiammazione dei roditori. Qui dimostriamo l'utilità di un apparato elettronico di von Frey per eseguire questa valutazione. Ci sono diversi vantaggi in questa tecnica: i) possiamo valutare rapidamente le risposte di astinenza alla pressione applicata per più topi in più punti temporali abbastanza vicini tra loro, ii) possiamo usare una singola punta per applicare una pressione continua e specifica a una piccola area di tessuto, iii) possiamo misurare con precisione la pressione precisa applicata per ottenere una risposta di ritiro, e iv) possiamo facilmente implementare solidi limiti di base, criteri di esclusione e controlli interni per garantire che le valutazioni comportamentali siano il più precise e obiettive possibile.

I passaggi critici per garantire i migliori risultati per un test EvF sono la calibrazione preventiva dello strumento e le pratiche di misurazione coerenti. Come dettagliato nella sezione del protocollo, lo strumento deve essere maneggiato con cura e deve essere garantita un'adeguata calibrazione prima e durante l'uso. Prima di effettuare qualsiasi misurazione, le letture del peso di prova devono essere confermate per garantire un funzionamento ottimale della macchina. Se le letture fluttuano in modo significativo o se le letture del peso di prova non sono accurate, è necessario contattare prontamente il produttore per tarare l'apparecchiatura. Con questo in mente, è consigliabile, se possibile, disporre di un apparato elettronico di von Frey di riserva per non compromettere gli esperimenti sensibili al tempo a causa di un'imprevista necessità di calibrazione dello strumento. Inoltre, un singolo ricercatore ben addestrato dovrebbe prendere tutte le misurazioni di base e sperimentali per un determinato studio o serie di esperimenti, rimanendo all'oscuro dei gruppi di trattamento. I topi devono essere valutati in una stanza tranquilla, tenuti a una temperatura costante, acclimatati alle camere EvF per almeno 15 minuti ma non trattenuti nella camera più a lungo del necessario (soprattutto se vengono effettuate più misurazioni in un solo giorno) in modo da ridurre al minimo lo stress e le variazioni comportamentali indotte dal disagio.

Le misure EvF offrono miglioramenti significativi rispetto alle tecniche CvF esistenti. I ricercatori possono applicare una pressione continua e non devono passare da una punta all'altra di vari pesi come avviene negli esperimenti sui filamenti CvF⁶. Questo porta a un minor numero di colpi sul tessuto, il che è particolarmente rilevante in caso di tessuto infiammato o ferito. È possibile misurare la pressione precisa alla quale si verifica il ritiro rispetto alle misurazioni di prelievo del 50% che sono anche limitate dai pesi dei filamenti disponibili utilizzati nelle misurazioni CvF¹³. Poiché è possibile implementare criteri di esclusione razionali e uniformi (come discusso sopra), i topi possono essere assegnati a gruppi sperimentali in modo tale che tutti i gruppi abbiano linee di base medie simili all'inizio dell'esperimento. Le misurazioni EvF valutano i cambiamenti nella risposta comportamentale a un dato stimolo e non le risposte assolute stesse. Pertanto, il cambiamento di ciascun topo nella risposta nocicettiva è misurato come la differenza tra i suoi singoli ritiri sperimentali e quelli al basale, fornendo così controlli interni per ogni misurazione effettuata.

Forse il limite più significativo dell'EvF è che, in modo simile alla sua controparte manuale, lo stesso ricercatore deve effettuare tutte le misurazioni per una particolare serie di misurazioni di base e sperimentali. Ciò rende l'aumento della tecnica impegnativo dal punto di vista del tempo, del personale e delle attrezzature. Scopriamo che ~20 topi alla volta (a seconda della configurazione delle camere di saggio) possono essere misurati in 30-45 minuti o meno in più punti temporali, a condizione che ci siano almeno 45 minuti tra le misurazioni. Una considerazione correlata a questo proposito è la curva di apprendimento dei singoli sperimentatori. La coerenza interna deve essere stabilita prima che un singolo ricercatore possa intraprendere un esperimento su larga scala e ciò richiede molte ore di pratica dedicata che coinvolgono misurazioni ripetute della risposta di base fino al raggiungimento della coerenza desiderata. Inoltre, l'utilizzo dei cutoff di base implica che non tutti i topi di base per un esperimento possono essere inclusi; Scopriamo che il 25-30% dei topi al basale per esperimento sono tipicamente esclusi.

In termini di modifiche e applicazioni future, le misurazioni comportamentali dell'EvF aggiungono una potente dimensione a un'ampia gamma di modelli di infiammazione per analizzare il dolore acuto e/o cronico concomitante che può essere alla base di patologie infiammatorie. Nell'avvelenamento, abbiamo scoperto che cambiamenti pronunciati e rapidi nella sensibilità tattile accompagnavano gli esiti attesi di gonfiore tissutale, reclutamento leucocitario e degranulazione dei mastociti nelle zampe posteriori di topi maschi ND4. Questi risultati corroborano le precedenti osservazioni sui contributi dei mediatori dei mastociti alla sensibilità termica nei ratti²⁰ e alla sensibilità meccanica indotta dal veleno di B. jararaca nei topi svizzeri ND4 misurati utilizzando CvF²¹. Il protocollo EvF può essere facilmente modificato per l'uso su tessuti diversi dalla zampa posteriore , ad esempio l'addome⁷ e la cresta ano-genitale⁸ , dove il CvF è attualmente utilizzato. I modelli di roditori di allergie, guarigione delle ferite, neuropatie e altre patologie possono essere facilmente adattati per includere misure di sensibilità meccanica nei tessuti che includono e oltre la zampa posteriore.

In sintesi, l'EvF è una tecnica utile ed efficace che aggiorna un approccio classico di misurazione della nocicezione nei roditori ed è un nuovo importante strumento per sondare i complessi meccanismi alla base del dolore in un'ampia gamma di modelli di malattia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ND4 Topi maschi svizzeri	Harlan	0-32	I topi utilizzati qui avevano 8-12 settimane e sono stati alloggiati e utilizzati secondo le linee guida IACUC del Macaleter College.
Siringa da insulina da 3 ml/100 con ago BD da 29 G 1/2 BD309301			Smaltire dopo ogni utilizzo nell'apposito contenitore.
B. jararaca veleno	Sigma	V5625	ATTENZIONE: Sostanza tossica. Indossare una protezione per gli occhi e la pelle. Sciogliere in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.
Apparecchio elettronico von Frey; sonda = 90 g campo	IITC	2394	Muoversi delicatamente e assicurarsi che sia sempre orizzontale. Per azzerare la sonda, premere "Programma" e "Cancella". Per passare dalla modalità di configurazione a quella di funzionamento, premere "Function" (per la lettura "MH") o "MAX".
Supporto in rete + camere in PMMA	IITC	410	Da posizionare su un banco di lavoro stabile o su un carrello con quattro ruote per accedere a tutti i lati.
Solo punte rigide elettroniche von Frey, gamma 90 g	IITC	2390	n/a