Articolo metodologico

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma In Vitro

DOI:

10.3791/51213

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18 marzo 2014

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1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo qui riportato permette di valutare l'efficacia della terapia fotodinamica (PDT) in linee cellulari e l'ottimizzazione delle impostazioni PDT prima di applicare la terapia in modelli animali.

Abstract

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Negli ultimi anni, vi è stata la difficoltà di trovare terapie più efficaci contro il cancro con meno effetti collaterali sistemici. Pertanto Terapia Fotodinamica è un nuovo approccio per un trattamento selettivo più del tumore.

La terapia fotodinamica (PDT) che fa uso di un fotosensibilizzatore tossico (PS), il quale, dopo attivazione con luce di una specifica lunghezza d'onda, in presenza di ossigeno, genera radicali dell'ossigeno che suscitano una risposta citotossica 1. Nonostante la sua approvazione quasi vent'anni fa dalla FDA, PDT è oggi utilizzato solo per il trattamento di un numero limitato di tipi di cancro (pelle, della vescica) e le malattie nononcological (psoriasi, cheratosi attinica) 2.

Il principale vantaggio della PDT è la capacità di eseguire un trattamento locale, che previene gli effetti collaterali sistemici. Inoltre, permette il trattamento di tumori in siti delicati (ad esempio attorno nervi o vasi sanguigni). Qui, un intraoperatapplicazione ive di PDT è considerato in osteosarcoma (OS), un tumore dell'osso, per indirizzare satelliti tumorali primari lasciati nel tumore tessuto circostante dopo la resezione chirurgica del tumore. Il trattamento mira a ridurre il numero di recidive e di ridurre il rischio di (postoperatorio) metastasi.

Nel presente studio, presentiamo in vitro procedure PDT stabilire le impostazioni ottimali PDT per il trattamento efficace di linee cellulari OS diffusi che vengono utilizzati per riprodurre la malattia umana in modelli murini OS intratibial consolidate. L'assorbimento del PS mTHPC è stato esaminato con uno spettrofotometro e fototossicità è stato provocato con la luce laser di eccitazione di mTHPC a 652 nm per indurre la morte cellulare valutata con WST-1 test e il conteggio delle cellule sopravvissute. Le tecniche consolidate ci consentono di definire le impostazioni ottimali PDT per futuri studi in modelli animali. Sono uno strumento semplice e rapido per la valutazione dell'efficacia di PDT in vivo.

Introduzione

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Lo stato odierno del trattamento arte di osteosarcoma (OS), un tumore osseo primario, comprende una combinazione di chemioterapia neo adiuvante e chirurgia. Questo regime terapeutico rivelato un aumento del tasso di sopravvivenza dei pazienti con malattia localizzata da circa il 20% prima dell'uso della chemioterapia, per attualmente tra 60-70% 3, 4. Tuttavia, negli ultimi due decenni, la sopravvivenza complessiva dei pazienti con malattia del sistema operativo locale ha plateaued 4, 5. Inoltre, il 30-40% di questi pazienti ricaduta entro 3 anni dopo la diagnosi e pazienti con malattia metastatica continuare ad avere una scarsa sopravvivenza....

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Protocollo

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1. Confronto tra l'assorbimento del mTHPC nei rispettivi basso e altamente metastatico HOS e 143B OS Linee Cellulari

  1. Preparare terreno di coltura contenente DMEM, Ham F12, e siero fetale di vitello inattivato al calore in un rapporto 4.5:4.5:1.
    Nota: La formulazione liposomiale del PS mTHPC è stato disciolto in acqua ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml mTHPC.
  2. Tavola 0.2 x 10 6 HOS e cellule 143B / pozzetto in piastre da 6 pozzetti (triplicato per ogni condizione), e lasciare che le cellule aderiscono durante la notte.
    Nota: il numero deve essere regolato per linee di cellule s....

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Risultati

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Con le tecniche qui riportate, abbiamo studiato a base di mTHPC PDT in cellule umane del sistema operativo. In primo luogo, l'assorbimento dipendente dal tempo e dose di mTHPC è stato studiato nel partire HOS metastatico e nelle linee cellulari 143B OS altamente metastatiche. mTHPC assorbimento può essere valutata misurando la fluorescenza di mTHPC con uno spettrofotometro a fluorescenza (Figura 2, riprodotto con il permesso Reidy et al. 11). Figura 2A illustra l'ass.......

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Discussione

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Per ottenere citotossicità ottimale in risposta a PDT, è fondamentale scegliere le impostazioni di luce laser destra e tempi di incubazione. Le procedure qui descritte sono coerenti ed efficienti per determinare PS assorbimento e quantificare citotossicità PDT indotta in vitro. Utilizzando le specifiche lunghezze d'onda di assorbimento della PS mTHPC, il PS assorbimento cellulare può essere determinato in modo diretto, e il PS può essere attivato per generare citotossici specie reattive dell'ossigeno. <.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare biolitec Research GmbH (Jena, Germania) per averci gentilmente fornito con la formulazione liposomiale mTHPC, con un ringraziamento speciale a Susanna Gräfe e Arno Wiehe per il loro aiuto e la competenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare Kerstin Reidy, che ha generato una gran parte dei risultati ed è stato corresponsabile per la sua pubblicazione 11.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Schweizerischer Verein Balgrist, dell'Università di Zurigo, il Krebsliga Zurigo così come da una sovvenzione da Walter L. e Johanna Lupo Foundation, Zurigo, Svizzera e una sovvenzione da Eur....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMPAA GmbH, Friburgo, GermaniaE15-883
HAM F12PAA GmbH, Friburgo, GermaniaE15-817
Siero fetale di vitello inattivato termicamenteGIBCO, Basilea, Svizzera10500-064
mTHPCbiolitec Research GmbH, Jena, GermaniaPoiché questa formulazione liposomiale proviene da R& Al momento è disponibile il numero di catalogo D
no. Stock: 1,5 mg/ml; fornito in una miscela 9:1 di dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoilfosfatidilglicerolo (DPPG; purezza >99%)
Lettore di piastre Spectramax Gemini XSMolecular Devices, Sunnyvale, CAID# 861
Microscopio Zeiss Observer.Z1Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germania
Ceralas PDT 652 nm Laserbiolitec AG, Jena, GermaniaLD652nm2W400u
Reagente solubile in acqua per tetrazolio (WST)Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Svizzera1644807

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (....

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Captazione del fotosensibilizzatoresaggio WST 1spettrofotometria di fluorescenzaattivazione tramite luce lasersaggio di viabilit cellulareconcentrazione di M T H P Cradicali dell ossigeno citotossicicitotossicit in vitro

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