Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Sommario

Il protocollo qui riportato permette di valutare l'efficacia della terapia fotodinamica (PDT) in linee cellulari e l'ottimizzazione delle impostazioni PDT prima di applicare la terapia in modelli animali.

Abstract

Negli ultimi anni, vi è stata la difficoltà di trovare terapie più efficaci contro il cancro con meno effetti collaterali sistemici. Pertanto Terapia Fotodinamica è un nuovo approccio per un trattamento selettivo più del tumore.

La terapia fotodinamica (PDT) che fa uso di un fotosensibilizzatore tossico (PS), il quale, dopo attivazione con luce di una specifica lunghezza d'onda, in presenza di ossigeno, genera radicali dell'ossigeno che suscitano una risposta citotossica ^1. Nonostante la sua approvazione quasi vent'anni fa dalla FDA, PDT è oggi utilizzato solo per il trattamento di un numero limitato di tipi di cancro (pelle, della vescica) e le malattie nononcological (psoriasi, cheratosi attinica) ^2.

Il principale vantaggio della PDT è la capacità di eseguire un trattamento locale, che previene gli effetti collaterali sistemici. Inoltre, permette il trattamento di tumori in siti delicati (ad esempio attorno nervi o vasi sanguigni). Qui, un intraoperatapplicazione ive di PDT è considerato in osteosarcoma (OS), un tumore dell'osso, per indirizzare satelliti tumorali primari lasciati nel tumore tessuto circostante dopo la resezione chirurgica del tumore. Il trattamento mira a ridurre il numero di recidive e di ridurre il rischio di (postoperatorio) metastasi.

Nel presente studio, presentiamo in vitro procedure PDT stabilire le impostazioni ottimali PDT per il trattamento efficace di linee cellulari OS diffusi che vengono utilizzati per riprodurre la malattia umana in modelli murini OS intratibial consolidate. L'assorbimento del PS mTHPC è stato esaminato con uno spettrofotometro e fototossicità è stato provocato con la luce laser di eccitazione di mTHPC a 652 nm per indurre la morte cellulare valutata con WST-1 test e il conteggio delle cellule sopravvissute. Le tecniche consolidate ci consentono di definire le impostazioni ottimali PDT per futuri studi in modelli animali. Sono uno strumento semplice e rapido per la valutazione dell'efficacia di PDT in vivo.

Introduzione

Lo stato odierno del trattamento arte di osteosarcoma (OS), un tumore osseo primario, comprende una combinazione di chemioterapia neo adiuvante e chirurgia. Questo regime terapeutico rivelato un aumento del tasso di sopravvivenza dei pazienti con malattia localizzata da circa il 20% prima dell'uso della chemioterapia, per attualmente tra 60-70% ^{3, 4.} Tuttavia, negli ultimi due decenni, la sopravvivenza complessiva dei pazienti con malattia del sistema operativo locale ha plateaued ^{4, 5.} Inoltre, il 30-40% di questi pazienti ricaduta entro 3 anni dopo la diagnosi e pazienti con malattia metastatica continuare ad avere una scarsa sopravvivenza del 20-30% ^{4, 6, 7.} Per migliorare l'esito di questi pazienti, nuove strategie terapeutiche devono essere sviluppate.

La terapia fotodinamica (PDT), una terapia antitumorale piuttosto romanzo, utilizza la luce di una specifica lunghezza d'onda di eccitazione di un photosensitizer (PS), che si accumula nelle cellule tumorali dopo l'iniezione nel flusso sanguigno. Luce laser di eccitazione del PS genera radicali dell'ossigeno in presenza di ossigeno, che inducono reazione citotossica nelle cellule tumorali e cellule morte. Oltre a questo meccanismo principale, due ulteriori PDT evocato processi biologici contribuiscono alla crescita del tumore ridotta: PDT provoca vasocostrizione e la formazione di trombi del microcircolo tumore e, di conseguenza, ipossia e anossia locale all'interno del tumore, con conseguente tumore infarto. Infine, PDT ferito e cellule tumorali muoiono innescare una risposta immunitaria locale, una caratteristica piuttosto unica di PDT. Ciò comporta il sistema del complemento e l'attivazione delle cellule presentanti l'antigene dendritiche ^8. Così, si creano le condizioni per la presentazione di antigeni tumorali con conseguente attivazione di cellule linfoidi, portando a tumore immunità specifica.

Finora, PDT è stato usato per trattare diversi tipi di tumori dei tessuti molli e hyperplasia, quali cheratosi attinica, esofago di Barrett, tumori endobronchiali, cancro della vescica, carcinomi a cellule basali, e il trattamento palliativo della testa e del collo ^2. Il trattamento è noto per indurre locale, necrosi larga scala con solo pochi effetti collaterali, e quindi ha il potenziale per eradicare selettivamente tessuto tumorale. Nonostante questi vantaggi, l'applicazione di PDT rimane tecnicamente più impegnativo rispetto alla somministrazione di farmaci chemioterapici. Al fine di raggiungere la massima efficacia, la concentrazione PS, tempo di esposizione alla luce e totale trasferimento di energia luminosa devono essere ottimizzate. Questo può essere fatto in esperimenti in vivo, ma, a causa del gran numero relativo di parametri che devono essere ottimizzate, è più efficiente per determinare inizialmente condizioni ottimali in vitro.

Negli esperimenti descritti di seguito, abbiamo testato l'efficacia in vitro di PDT utilizzando il PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-idrossifenil) chlOrin, abbreviato mTHPC (Figura 1A). mTHPC è il principio attivo contenuto nel medicinale Foscan, che viene attualmente utilizzato in clinica per il trattamento palliativo del carcinoma della testa e del collo. Si tratta di uno dei più potenti PS, inducendo danno cellulare massiccia già a basse concentrazioni, ed è stato dimostrato di essere superiore ad altri PS in termini di penetrazione nel tessuto ^{9, 10.} Il suo spettro di assorbimento della luce (Figura 1B) presenta due picchi prominenti, una a 417 nm ed una seconda a 652 nm, che sono utilizzati per la localizzazione del tessuto di accumulare PS e per l'induzione PDT, rispettivamente.

Attualmente, una formulazione liposomiale per mTHPC è in fase di sviluppo. Qui, descriviamo le procedure per quantificare l'assorbimento di questa formulazione liposomiale, e per eseguire PDT in due linee di cellule del sistema operativo umani, la bassa HOS metastatico e le alte cellule metastatiche 143B. Alcuni dei dati presentati qui sono stati segnalati in precedenza ^11. The approccio qui descritto permette di studiare l'effetto di un fenotipo metastatico sul PDT efficacia. 143B cellule, ortotopicamente iniettate nelle arti posteriori del sistema immunitario topi SCID con deficit causano tumori intratibial metastatizzanti primari, un modello mimando la malattia metastasi umana. Così, gli esperimenti proposti in vitro sono perfettamente adatti per valutare le impostazioni ottimali PDT per essere successivamente utilizzati in esperimenti in vivo.

Protocollo

1. Confronto tra l'assorbimento del mTHPC nei rispettivi basso e altamente metastatico HOS e 143B OS Linee Cellulari

1. Preparare terreno di coltura contenente DMEM, Ham F12, e siero fetale di vitello inattivato al calore in un rapporto 4.5:4.5:1.
   Nota: La formulazione liposomiale del PS mTHPC è stato disciolto in acqua ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Tavola 0.2 x 10 ⁶ HOS e cellule 143B / pozzetto in piastre da 6 pozzetti (triplicato per ogni condizione), e lasciare che le cellule aderiscono durante la notte.
   Nota: il numero deve essere regolato per linee di cellule singole. Una confluenza del 80-90% è più adatto al momento dell'esperimento.
3. Il giorno seguente, incubare le cellule con una concentrazione fissa di mTHPC per diversi periodi di tempo (assorbimento dipendente dal tempo), o con concentrazioni crescenti di mTHPC durante un periodo di tempo fisso (dose assorbimento dipendente).
4. Incubare le cellule con mTHPC per tempo specifico points o concentrazioni di mTHPC.
   Nota: In questo studio, sia l'HOS e linee cellulari 143B sono state incubate con 0,6 ug / ml mTHPC per 0, 2,5, 5 o 10 ore, o con 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC per 5 ore. I periodi di tempo richiesti e dosaggi possono variare a seconda della linea cellulare utilizzata.
5. Ricordatevi di lavorare sempre al buio o in condizioni di luce soffusa per evitare l'esposizione a luce diretta delle cellule.
6. Dopo incubazione delle cellule alle condizioni indicate, aspirare il terreno e lavare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, staccare le cellule con 0,5 ml di tripsina / EDTA e contare le cellule.
7. Dopo distacco, centrifugare le cellule a 400 xg per 5 min, aspirare il terreno e risospendere le cellule in PBS ad una densità finale di 200.000 cellule / ml.
8. Pipettare 100 ml di sospensione cellulare ottenuta (ossia 20.000 cellule) in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza di queste cellule in uno spettrofotometro a fluorescenza. L'impostaziones per mTHPC misure di fluorescenza sono: 417 nm per l'eccitazione e 652 nm per l'emissione.
9. Per calcolare la quantità di mTHPC internalizzato per cella, normalizzare l'unità di fluorescenza relativa (RFU) per il numero di cellule e volume cellulare come segue:
10. Preparare una curva standard utilizzando diverse concentrazioni di mTHPC in PBS 0-4 mcg / ml (misure uso triplice copia). Pipettare 100 ml di ogni diluizione in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza dei pozzetti usando le impostazioni descritte sotto passo 1.6.
11. Dividere la RFU (ottenuto per 20.000 cellule) dalla pendenza della curva standard lineare di mTHPC, che rappresenta la concentrazione di mTHPC (in mg / ml) nel pozzo.
12. Dividere questa concentrazione mTHPC per 10 per ottenere la quantità totale di mTHPC in un pozzetto (in mg, che rappresenta 100 microlitri di sospensione cellulare) e dividere questo valore per il volume di 20.000 cellule.
13. Calcolare il volume con la formula per una sfera: (4/3 x π) xr ^3. Ottenere il raggio r misurando il diametro di 20 cellule trypsinized al microscopio, e dividendo questo valore per 2.
14. Infine, normalizzare tutti i valori a quelli ottenuti con cellule HOS dopo 10 ore di incubazione (dose assorbimento dipendente) o trattati con 10 mg / ml mTHPC (uptake funzione del tempo), che sono stati fissati al 100%.

2. Misurazione della fototossicità di PS In Vitro

1. Seed 3.000 cellule / pozzetto in una piastra a 96 pozzetti (triplicato per ciascuna concentrazione di mTHPC usati) e farli aderire durante la notte. Analogamente preparare una piastra da 96 pozzetti supplementari e trattare le cellule come descritto di seguito, ma poi messo da parte per l'imaging a contrasto di fase.
   Nota: il numero deve essere regolata per ogni linea singola cella. Una confluenza del 50-60% al momento dell'esperimento è ideale.
   1. Tenere a mente per aggiungere il corrispondente controllo di tossicità scuro di cellule per ciascuna delle concentrazioni mTHPC. Ilse sono cellule che saranno incubate in assenza o in presenza di concentrazioni selezionati di mTHPC, ma non si illuminerà.
2. Il giorno seguente, incubare le cellule con differenti concentrazioni di mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 e 10 mg / ml) a seconda delle linee cellulari e tenerli al buio per 5 ore.
   1. Fare riferimento alla sezione 1.3.2
      Nota: Il tempo di incubazione prima illuminazione dipende dalla linea cellulare e del PS usato, quindi è consigliabile per testare diverse concentrazioni e tempi diversi in esperimenti separati.
3. Dopo l'incubazione per il periodo di tempo indicato, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere nuovo terreno fresco, senza mTHPC.
4. Illuminare le cellule con un diodo laser 652 nm, specifico per lo spettro di assorbimento mTHPC (vedi Figura 1).
   1. Impostare il laser a 21.88 mW / cm ² potenza ad una altezza di 13,5 centimetri distaSNO dalle cellule, al fine di ottenere una dose di energia 5 J / cm ^2. Illuminare le cellule per 230 sec. Non illuminare le cellule di controllo tossicità scuri (con e senza mTHPC).
      Nota: indossare sempre occhiali per proteggere gli occhi dalla luce laser utilizzato per l'eccitazione del PS.
5. Dopo l'illuminazione, mantenere le celle al buio a 37 ° C per 24 ore. Successivamente, aggiungere acqua tetrazolio solubile (WST-1) reattivo (10 μl/100 ml di media).
6. Tre ore dopo l'aggiunta del reagente WST-1, misurare l'assorbanza dei singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti a 415 nm.
7. Per calcolare la percentuale di cellule sopravvissute, impostare la media dei valori ottenuti per le cellule trattate mTHPC non per ciascuna condizione al 100% (cioè illuminati, senza mTHPC e nonilluminated senza mTHPC).

3. Stima del numero di cellule contando cellulare

1. Seed 20.000 cellule / noill in una piastra a 24 pozzetti e farli aderire durante la notte.
2. Incubare le cellule per 5 ore con mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, e 1,25 mg / ml) e illuminare come descritto sopra.
3. Raccogliere il mezzo, lavare le cellule una volta con PBS, li trypsinize e alla loro raccolta per centrifugazione a 400 xg per 5 min.
4. Dopo centrifugazione, aspirare il terreno e risospendere le cellule in 200 ml di terreno fresco.
5. Contare le cellule in una camera di Neubauer.

Risultati

Con le tecniche qui riportate, abbiamo studiato a base di mTHPC PDT in cellule umane del sistema operativo. In primo luogo, l'assorbimento dipendente dal tempo e dose di mTHPC è stato studiato nel partire HOS metastatico e nelle linee cellulari 143B OS altamente metastatiche. mTHPC assorbimento può essere valutata misurando la fluorescenza di mTHPC con uno spettrofotometro a fluorescenza (Figura 2, riprodotto con il permesso Reidy et al. ^11). Figura 2A illustra l...

Discussione

Per ottenere citotossicità ottimale in risposta a PDT, è fondamentale scegliere le impostazioni di luce laser destra e tempi di incubazione. Le procedure qui descritte sono coerenti ed efficienti per determinare PS assorbimento e quantificare citotossicità PDT indotta in vitro. Utilizzando le specifiche lunghezze d'onda di assorbimento della PS mTHPC, il PS assorbimento cellulare può essere determinato in modo diretto, e il PS può essere attivato per generare citotossici specie reattive dell'ossigeno. <...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	PAA GmbH, Friburgo, Germania	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Friburgo, Germania	E15-817
Siero fetale di vitello inattivato termicamente	GIBCO, Basilea, Svizzera	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Germania		Poiché questa formulazione liposomiale proviene da R& Al momento è disponibile il numero di catalogo D no. Stock: 1,5 mg/ml; fornito in una miscela 9:1 di dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoilfosfatidilglicerolo (DPPG; purezza >99%)
Lettore di piastre Spectramax Gemini XS	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscopio Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germania
Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Germania	LD652nm2W400u
Reagente solubile in acqua per tetrazolio (WST)	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Svizzera	1644807