Articolo metodologico

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in

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DOI:

10.3791/51231

⸱

11 marzo 2014

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

In questo articolo

Sommario

Un protocollo è descritto che utilizza anossia / fame in C. elegans per modellare ischemia / riperfusione. Risultati funzionali comprendono un aumento della mortalità, anomalie visibili in processi neuronali GFP-etichettata, e le risposte deteriorate comportamentali che richiedono la funzione neuronale.

Abstract

Protocolli per anossia / fame nel modello di organismo genetico C. elegans simulare ischemia / riperfusione. Worms sono separati dal cibo batterica e poste sotto anossia per 20 ore (ischemia simulata), e successivamente trasferiti in un ambiente normale con il cibo (riperfusione simulata). Questo sperimentali risultati paradigma in aumento della morte e danno neuronale, e tecniche sono presentati per valutare la vitalità dell'organismo, alterazioni della morfologia dei processi tocco neurone, nonché sensibilità al tocco, che rappresenta l'uscita del comportamento della funzione neuronale. Infine, un metodo per la costruzione incubatori ipossiche utilizzando contenitori cucina comune è descritto. L'aggiunta di una unità di controllo del flusso di massa consente modifiche da apportare alla miscela di gas nelle incubatrici personalizzati, e un bagno di acqua circolante consente sia il controllo della temperatura e rende facile identificare perdite. Questo metodo fornisce un'alternativa a basso costo commerciale diunità disponibili.

Introduzione

C. elegans è un nematode che è stato ampiamente adottato come multicellulare eucariotica organismo modello sin dalla sua introduzione da Brenner 1. Si tratta di un modello semplice, economico e versatile, che permette facili collegamenti tra le alterazioni genetiche e fenotipiche cambia 2.

L'ischemia è caratterizzata da una mancanza di nutrienti e di ossigeno ad un tessuto, seguita da riperfusione, quando una raffica di specie reattive dell'ossigeno è prodotto 3 e la maggior parte del danno. Nel 2002, un modello di ischemia / riperfusione (IR) in C. elegans è stato sviluppato 4 riguardanti la presentazione dell'intero worm per anossia, la privazione di nutrienti e stress da calore per circa 20 ore, seguito da 24 ore in condizioni normali. Anche se questo modello è tecnicamente un anossia-fame (AS) condizione, la morte cellulare avviene attraverso meccanismi che sono conservati nei mammiferi, incluso il danno indotto da ossidanti durante la riperfusione 5. Inoltre, simili a mammiferi IR, danno indotto da AS in C. elegans può essere evitata mediante precondizionamento ischemico 6,7 o 8,9 precondizionamento anestetico.

I protocolli di seguito viene illustrato come imitare IR in C. elegans utilizzando il modello AS, come a segnare anomalie morfologiche e comportamentali che derivano da AS, e come adattare il protocollo in modo da consentire l'esperimento possa essere condotta con un investimento iniziale inferiore utilizzando una misura, facilmente costruito un'alternativa camera .

Protocollo

1. C. elegans crescita

  1. Preparare 35 millimetri Nematode crescita media (NGM) piastre di agar seminate con i batteri OP50, come da metodi di coltivazione standard di 1.
  2. Sincronizzare C. elegans, ponendo 6 adulti gravide su un piatto NGM seminato. Rimuovere il numero di adulti dopo ~ 100 uova sono state fissate (~ 3 ore).
  3. Incubare le piastre per 3 giorni a 20 ° C, a quel punto i vermi avranno sviluppato a giovani stadio adulto e sono ottimali per questo esperimento. Protocolli alternativi per sincronizzare C. elegans sono descritte altrove 10.

2. Materiali per AS

  1. M9 tampone (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) deve essere depurata di ossigeno equilibrando con N 2 (argon può anche essere usato) durante 30 min prima dell'esperimento e tenuto circondato da ghiaccio.
  2. Fai un piccolo foro (3 millimetrilarghezza) nel coperchio di 1,5 ml provette da microcentrifuga in cui i vermi saranno collocate durante AS. Il foro permette lo scambio di gas senza tenere il coperchio aperto, in quanto questo può portare a eccessiva della carta evaporazione.

3. Anossia / fame

  1. Condurre tutti gli esperimenti, almeno in triplicato.
  2. Aggiungere 1 ml di tampone RT, M9 ossigenato per ogni placca 35 mm avente vermi adulti giovani coltivate come descritto sopra. Fare attenzione a non rimuovere i batteri dalla piastra (aggiungere M9 ai bordi dove i batteri non sono state seminate). Dopo circa 1 min i vermi dovrebbero essere nuotare nella M9.
  3. Cappotto un puntale da 1 ml con BSA pipettando ed espellendo una soluzione sterile BSA 1%.
  4. Inclinare con cautela il piatto contenente i vermi in un tampone M9, rimuovere la M9 dallo stesso luogo in cui è stato aggiunto, e posizionare la sospensione nei tubi microcentrifuga preparati. Far riposare in ghiaccio fino i vermi siano depositati sul fondo delle provette (~ 1-2 Min).
  5. Rimuovere la quantità massima di M9 possibile senza disturbare i vermi dal tubo (lasciando circa 100 ml), aggiungere 1 ml di M9 ossigeno purgato e ghiacciata e posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando i vermi si depositano sul fondo di nuovo. Ripetere l'ultimo passaggio 3x. In ultimo lavaggio, rimuovere la M9 fino ~ 100 microlitri rimane nel tubo.
  6. Mettere le provette con i vermi in deoxygenated M9 all'interno di una camera anossica / ipossia (vedere le istruzioni qui di seguito, Sezione 3.6.1) o, in alternativa, in un contenitore sigillato personalizzato (vedi istruzioni qui sotto, sezione 3.6.2).
    1. Se una camera anossica / ipossica commerciale deve essere utilizzato, lasciare alcune M9 spurgato all'interno della camera prima di iniziare la fase 3.5 e ripetere il punto 3.5 una volta che i vermi sono all'interno della camera.
    2. Se una camera personalizzato deve essere utilizzato, una descrizione dettagliata di come creare un apparecchio a basso costo è presentato alla fine di questo protocollo ed è stato descritto da un altro gruppo in precedenza 11. In breve:
      1. Fare due fori in un coperchio da 250 ml Tupperware-tipo di contenitore e aggiungere connettori per tubi a loro. Uno sarà utilizzato per iniettare la miscela di gas mentre l'altro sarà l'uscita gas in un bagno d'acqua.
      2. Posizionare i vermi nella camera e sigillare la camera con il coperchio.
      3. Gas con un costante flusso di N 2 (100 ml / min).
      4. Porre il contenitore in un bagno di acqua a 26 ° C. Assicurarsi che il tubo di uscita è ben immerso in acqua così non ritorni vie e che non vi siano perdite nel sistema (apparente da bolle derivanti dalla camera stessa).
  7. Incubare i vermi a 26 ° C per 20 ore.

4. Riperfusione simulata

  1. Dopo 20 ore in condizioni di AS, rimuovere i tubi dalla camera di incubazione in aria ambiente.
  2. Pipetta C. elegans con una punta BSA rivestito (come al punto 3.3) su un OP50 testa di serie 35 millimetri piastra NGM. Incubare le piastre a 20 ° C per 24 ore.Dopo questo, i vermi saranno pronti per essere segnato.

5. Identificare Morto Versus Live Worms

  1. Utilizzando un pick platino, toccare leggermente la parte superiore della testa della vite senza fine. Vermi vivi si sposteranno indietro dopo essere stato toccato. Se i vermi sono nonresponsive, segnare come morto. Occasionalmente, un verme non si muoverà all'indietro, ma può presentare un leggero movimento della testa da lato a lato. Anche se non è tecnicamente morto, questi vermi sono quasi certo di scadenza entro poche ore, e dovrebbero essere classificati come morti. Se si aspetta troppo tempo per segnare i vermi, schiusa interna della progenie può accadere e queste "borse-di-vermi" può rompersi, facendo rilevare le carcasse molto difficile.
  2. Rimuovere entrambi i vermi vivi e morti dalla piastra se essi sono computati al fine di evitare conteggi doppi. I vermi vivi possono essere spostati in un piatto a parte per eseguire test comportamentali. La quantità di vermi viventi relativi al totale è rappresentato come la% di vermi sopravvissuti (Figura 1A ).

6. Toccare risposta Assay

  1. Una descrizione dettagliata di questo protocollo è stato presentato in Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 luglio 2006), WormBook, ed. La C. elegans Comunità di Ricerca, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
    1. A segnare per la risposta al tocco, identificare i vermi che si muovono e toccano leggermente il lato della testa del verme (vicino alla parte centrale della faringe) con uno scalpello ciglio (Figura 3).
    2. Se il worm si muove indietro, segnare come reattivo, se non, segnare come non risponde (Figura 1B). Ripetere questa operazione 10-15x per ogni vite senza fine con intervalli di 10 secondi. Sonda almeno 10 vermi in ogni gruppo per avere dati precisi. Lo stesso test può essere utilizzato per valutare i cambiamenti in avanti locomotore seguente tocco leggero alla parete posteriore del corpo. Fare attenzione a non toccare la testa o la coda del verme, dal momento che questo stimola un comportamento diverso.
    3. Infine, inceppi di controllo genetico aziendali [N2 Bristol wild-type per il positivo, mec (mechanosensory) mutante di negativo - ad esempio CB1338 mec-3 (e1338) IV] per calibrare la forza con cui a toccare i vermi. Troppo dura di una stimolazione sarà suscitare una risposta comportamentale in mutanti MEC, troppo poco non si suscitare un effetto nei controlli N2 tipo selvatico.

7. Neuronale modifiche

  1. Per visualizzare Post come modificazioni neuronali, utilizzare un ceppo che esprime GFP in-rispondere al tocco MEC neuroni 4,5. Questi neuroni sono lunghi processi che corrono lungo la parete del corpo e sono facilmente segnati per anomalie morfologiche. Inoltre, l'informazione morfologica può essere integrato con misure comportamentali di funzione neuronale, come descritto sopra. Un ceppo che può essere utilizzato per questo scopo è TU2583, che è disponibile dalla C. elegans Genetics Center e contiene il transgene integrato uIs25 che esprimono GFP from il mec-18 promotore o, in alternativa TU2562, che contiene un mec-3 :: GFP fusion integrata.
  2. Preparare un pad agarosio.
    1. Sciogliere 2% agarosio in acqua, portare a 1x M9 con uno stock 10x, e mantenere la soluzione a 70 ° C.
    2. Una goccia (~ 20 microlitri) di questa soluzione in un vetrino (25 mm x 75 mm) che è stato inserito tra altri due slitte, ognuna delle quali ha un unico pezzo di nastro sul loro lato inferiore.
    3. Posizionare un vetrino finale perpendicolare alla prima sulla superficie della soluzione di agarosio al 2%, e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Questo dovrebbe formare un pad che è lo spessore del nastro.
    4. Rimuovere la slitta superiore e aggiungere 10 ml di M9 contenenti 0,1% Tetramisole, che immobilizzare i vermi.
  3. Spostare alcuni (~ 10) vivere vermi sul 2% agarosio diapositiva. Posizionare un vetrino su di loro e visualizzare GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza in un obiettivo 100X con l'illuminazione adeguata.
  4. Danneggiatoneuroni mostrerà una stringa citosolico membrana del reticolo perle nei processi, composto punctum multiple (Figura 2A), e / o anomalie in cui i processi sembrano essere ignorate (Figura 2B). Conte punctum e le anomalie in entrambi i neuroni per ogni verme, con un totale di almeno 10 vermi.

8. Lab-made Hypoxic Camera

  1. Uno stile Tupperware, richiudibile, contenitore chiuso ermeticamente può essere retrofit come una camera anossica. Fare attenzione a scegliere un contenitore che è il più piccolo possibile. Un piccolo contenitore crea un ambiente ipossico più veloce ed è più facile da montare nel bagno d'acqua (Figura 4).
  2. Fai due fori sul coperchio (può essere fatto con un cacciavite o riscaldando pinze e costringendo nel coperchio) e inserire un connettore di plastica o di metallo che si inserisce il tubo (Figura 5A). Utilizzare colla che può essere posizionato sotto l'acqua, e diventa difficile anche dopo essiccamento, evitando di movimentoil connettore e quindi riducendo la possibilità di perdite (Figura 5B).
  3. Il contenitore deve essere collocato nella vasca d'acqua in modo che sia completamente sommerso (Figura 4). Per immergere il contenitore, utilizzare un peso bottiglia o un peso immersioni.
  4. Uno dei raccordi dei tubi saranno utilizzati per introdurre una miscela di gas e l'altro tubo fungerà da sovrappressione, quindi, andrebbe lasciata sotto l'acqua in modo che il contenitore è sigillato rispetto all'ambiente esterno (Figura 4).
  5. La composizione dell'aria può essere modulata utilizzando il gas su misura, controllori di flusso di massa o di qualsiasi apparato che mescola i gas desiderati. Il flusso di gas deve essere controllato, come flusso elevato può creare eccessiva evaporazione. Ad esempio, in un contenitore da 250 ml, 100 ml / min di gas fornirà buon spazio per i vermi e un flusso adeguato.
  6. La lunghezza del tubo deve essere ridotto al minimo, in quanto possono essere permeabile ai gas, unallowing l'ingresso di O 2. È importante evitare l'uso di silicone, Tygon provette come questi materiali sono permeabili scambio di gas. Noi preferiamo tubi di polipropilene o nylon. Vetro o tubi di metallo mantengono i gas bene, ma sono anche più difficili da lavorare.

Risultati

Sottoponendo C. elegans a 20 ore di AS a 26 ° C in un laboratorio-made camera di incubazione personalizzato come descritto (punto 3.6.2) ha comportato una significativa mortalità (Figura 1A) 5. L'imaging fluorescente successiva di punctum e le interruzioni nei GFP etichettati processi neuronali di sopravvissuti ha confermato la presenza di anomalie morfologiche (Figura 2). I sopravvissuti anche risposto male alla luce della parete di tocco del corpo (Figura 1B). Questo modello è stato utilizzato da più gruppi per studiare come la predisposizione genetica, intervento farmaceutico, e la plasticità metabolica colpisce esiti AS dipendenti 4-6,8,9,12,13.

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Figura 1. C. elegans sopravvivenza e la risposta al tocco dopoAS. A) Percentuale di vermi che esporre 24 ore post-AS sopravvivenza. Il ceppo N2 è il background genetico wild type, e KWN85 contiene un transgene integrato che etichette neuroni MEC con GFP. B) Risposta a toccare stimoli di vivere C. elegans (N2 Strain) dopo AS. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Toccare modifiche neurone dopo AS. Neurone touch (PLML e PLMR) anomalie come i processi tortuosi e pause (A) o l'accumulo di aggregati GFP nei processi (B) sono stati monitorati in sopravvivenza anestetizzata C. elegant ans dopo AS.

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Figura 3. Scelta ciglio. Un ritiro ciglio assemblato. Nel riquadro, un particolare del ciglio incollato al legno stuzzicadenti.

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Figura 4. Lab-made camera ipossica all'interno del bagno d'acqua. Un contenitore chiuso pronto per iniziare l'esperimento. Le frecce indicano l'entrata e l'uscita del gas ed il peso della bottiglia usata per evitare che flottante.

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Figura 5. Dettagli del lato interno ed esterno del coperchio del contenitore. A) lato esterno del coperchio del contenitore, indicando il tubo e il suo connettore attaccato al foro precedentemente realizzato. B) lato esterno del coperchio del contenitore, indicando il connettore del tubo attaccato al foro precedentemente realizzato.

Discussione

Come è stato ampiamente utilizzato in C. elegans per modellare lesioni IR. Alcuni punti chiave dovrebbero essere evidenziati per questo protocollo: C. elegans sono resistenti a una vasta gamma di lesioni, che giustifica la necessità per 3 insulti concomitanti (calore, fame e anossia) per raggiungere morte con questo sistema. Solo Anoxia non uccide i vermi in questa finestra di tempo 14. Inoltre, l'aumento della temperatura è un ulteriore stress, quindi è importante monitorare attentamente. In senso stretto, la fame non contribuisce significativamente al grado di mortalità osservata 7, di per sé, ma sembra ridurre la variabilità tra le repliche sperimentali. Dato che non ci può essere variabilità significativa dal giorno per giorno, è estremamente importante per confrontare i campioni eseguiti direttamente in parallelo, e di ripetere gli esperimenti su più giorni. In generale, i risultati vengono valutati per tre piastre separate di 50-100 vermi / condizione sperimentale e questi sono in media e considerato come una singola replica sperimentale. In generale, tra i sette ei nove repliche sembrano essere sufficienti per raggiungere o escludere la significatività statistica.

Ha bisogno anche lo stadio di sviluppo dei vermi utilizzati nell'esperimento essere attentamente monitorati come la suscettibilità delle diverse fasi di AS danni varia significativamente 15,16. L'uso dei giovani adulti è standard, e la fase larvale (L3 e L4) vermi sembrano essere più resistenti agli effetti dannosi di AS (dati non pubblicati).

Questo protocollo offre due modi per eseguire gli esperimenti, uno con un apparato di laboratorio-made (utilizzando contenitori Tupperware tipo e gas in ingresso 11) e altre con una camera ipossica commerciali 4,6. Anossia può essere ottenuto con altri mezzi che consumano l'ossigeno, come descritto altrove 13,17. L'uso di tecniche alternative per creare un ambiente ipossico può cambiare il tempo di incubazione AS necessarioper creare la quantità desiderata di morte. Targeting ~ 20% di sopravvivenza è un punto di partenza ideale per studiare interventi protettivi, mentre l'80% è altrettanto ideale per gli interventi che aggravano gli effetti negativi di AS. Un altro avvertimento importante è il momento in cui i punteggi osservatore vermi morti / vivi. Se il tempo di analisi è estesa oltre 24 ore, i dati possono essere fuorviante in quanto vermi morti diventano sempre più difficili da identificare. Ciò può essere dovuto alle carcasse verme diventare relativamente trasparente nel tempo, ma anche al fatto che gli embrioni fecondati possono svilupparsi in progenie post-mortem all'interno delle carcasse e disturbare loro che emergono.

L'analisi della morfologia neuronale può essere modificato per guardare proteina espressione modelli 18, frammentazione nucleare 4 e altri parametri 19 sostituendo un ceppo verme che esprime l'appropriato marcatore geneticamente codificato. Un avvertimento finale è che la visualizzazione dellaprocessi neuronali dovrebbero essere fatte meno di 30 min dopo aver posizionato i vermi sul vetrino. Animali tenuti sotto anestesia su vetrini per periodi più lunghi possono presentare danni AS-indipendente. Regolare la quantità di animali per vetrino in base al tempo necessario per monitorare e analizzare loro.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Figure 1 e 2 sono stati precedentemente pubblicati in Biologia Free Radical & Medicina (Queliconi et al. 5) e hanno copyright detenuti da Elsevier. Questo lavoro è stato supportato dal Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), l'Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de processos Redox em Biomedicina, il Núcleo de Apoio à Pesquisa de processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), e USPHS GM087483 (KN ). BBQ è uno studente di dottorato sostenuto da una borsa di studio FAPESP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ceppo N2 CGCCeppo di tipo selvatico.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)CGCTU2583transgene fluorescente integrato utilizzato per marcare i neuroni tattili.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

CB1338 mec-3 (e1338)IVCGCCB1338mutante mec-3 canonico insensibile al tocco.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

Provetta per microcentrifugaEppendorf0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscopio Nikon USATE2000-U
Incubatore a bassa temperaturaSheldon Manufacturing Inc.Modello 2005
PicconcimeUn plettro per ciglia può essere preparato attaccando una ciglia su uno stuzzicadenti di legno, quindi attaccando lo stuzzicadenti in una pipetta di vetro Pasteur (Figura 3).
ipossicaCoy8307030Scatola a guanti ipossica dotata di catalizzatore al paladio e controller CO2.
per ciglia Camera

Riferimenti

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