Un modello murino di cervicale lesioni del midollo spinale per studiare post-lesionale respiratoria neuroplasticità

Sommario

L'insufficienza respiratoria è la principale causa di morte in seguito ad una lesione del midollo spinale cervicale. Avere un modello animale preclinico riproducibile, quantificabili, e affidabile di insufficienza respiratoria indotta da una lesione cervicale parziale aiuterà a capire la successiva neuroplasticità respiratorie e non respiratorie e consentire strategie di sperimentazione di riparazione putative.

Abstract

Una lesione del midollo spinale cervicale induce paralisi permanente, e spesso porta a distress respiratorio. Ad oggi non terapeutica efficienti sono stati sviluppati per migliorare / migliorare l'insufficienza respiratoria dopo un trauma ad alta cervicale del midollo spinale (SCI). Qui proponiamo un modello pre-clinico murino di alta SCI al 2 (C2) livello metameric cervicale per studiare diverse neuroplasticità respiratoria post-lesionale. La tecnica consiste di una lesione chirurgica parziale al livello C2, che indurrà una hemiparalysis del diaframma a causa di una deafferentazione dei motoneuroni frenico dai centri respiratori situati nel tronco cerebrale. Il lato controlaterale della lesione rimane intatto e permette il recupero degli animali. A differenza di altri siti di importanza comunitaria che influenzano la funzione locomotoria (a livello toracico e lombare), la funzione respiratoria non necessita di motivazione degli animali e la quantificazione del deficit / recupero può essere facilmente effettuata (diaframma e la registrazione del nervo frenicos, tutto ventilazione corpo). Questa pre-clinica modello C2 SCI è un modello pre-clinico potente, utile e affidabile per studiare vari eventi neuroplasticità delle vie respiratorie e non respiratorie a diversi livelli (molecolare alla fisiologia) e testare diverse putativi strategie terapeutiche che potrebbero migliorare la respirazione in pazienti SCI.

Introduzione

Trauma del midollo spinale è un pregiudizio comune osservata nella popolazione umana con incidenze drammatici, come la paralisi permanente. Tuttavia, la gravità del danno dipende dal livello e l'entità del trauma iniziale. L'insufficienza respiratoria è la causa principale della mortalità a seguito di lesione superiore cervicale del midollo spinale (SCI) ^1. Attualmente, l'unico trattamento terapeutico è quello di posizionare il paziente in ventilazione assistita. Da alcuni pazienti possono essere svezzati fuori l'assistenza ventilatoria ^2, a causa del recupero spontaneo che si verifica con ritardo post-lesionale, la necessità di sviluppare nuove terapie non invasive innovative è urgente ^3. Avere un buon modello preclinico standardizzato per studiare l'effetto di un SCI cervicale su insufficienza respiratoria e perciò studiare l'applicazione di putativi strategie terapeutiche, è essenziale.

In questo articolo tecnico, si descrive una specifica pre-clinica modello murino oinsufficienza respiratoria f indotta da una parziale SCI cervicale al livello C2. Questo modello è attualmente utilizzato da diversi laboratori di tutto il mondo (per le recensioni: ^4-13). Tuttavia, lievi differenze nella procedura chirurgica possono essere osservati tra i diversi ricercatori per generare questo particolare cervicale lesione modello murino. L'effetto di un C2 SCI sull'uscita respiratorio è stato descritto nel 1895 da Porter ^14. Un hemisection cervicale induce una deafferentazione dei motoneuroni frenico dalla loro unità centrale (nella rVRG nel tronco cerebrale, Figura 1A) sul lato omolaterale di lesioni, portando ad una attività del nervo frenico silenziosa e la successiva paralisi diaframma. Il lato controlaterale rimane intatto e permette all'animale di sopravvivere. Diversamente differente SCI situato in un segmento vertebrale inferiore (ad esempio una lesione contusivi a livello C4 ^15), l'integrità del nucleo motoneurone frenico su entrambi i lati è conservato. Dopo un CERVlesione C2 iCal, alcune attività spontanea può essere osservata sul lato ipsilaterale (frenico e diaframma) a causa di una attivazione di controlaterale sinapsi silenti che attraversavano la linea mediana della colonna vertebrale a livello segmentale C3-C6 (percorsi frenico incrociate, CPP, Figura 1B) . L'attivazione del CPP, che è, per definizione, un hemisection C2 combinato con un phrenicotomy controlaterale che inducono un ipsilaterale parziale recupero del nervo frenico, può verificarsi da ore a settimane post-lesione ^16-18. Il vero effetto benefico di questa via CPP sul recupero respiratorio è limitata ¹⁹ e ulteriori indagini e il trattamento deve essere sviluppata per migliorare la grandezza di restauro spontanea ^3.

Questo protocollo fornisce un potente tipo di modello murino pre-clinico per lo studio delle vie respiratorie plasticità post-lesionale a vari livelli (fisiologia respiratoria da motoneuroni pre e frenico, interneuroni, molecolare e cellular, locomozione dell'arto anteriore per esempio), nonché un modello per verificare invasive e non invasive strategie terapeutiche mirate per migliorare la respirazione e il recupero motorio seguente lesione del midollo spinale cervicale C2 parziale.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico della sedia RBUCE-UP di eccellenza (Università di Paris Sud, convenzione di sovvenzione n ° 246.556) e l'Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines.

1. Preparazione di strumenti chirurgici sterilizzati

1. Pulire gli strumenti chirurgici con detergente da laboratorio.
2. Sterilizzare gli strumenti prima della chirurgia.
3. In una sessione chirurgica, sterilizzare gli strumenti posizionando le punte in un cordone sterilizzatore caldo per 10 min a 180 ° C tra 2 interventi chirurgici.

2. Preparazione dei farmaci

1. Preparare 2 x 1 ml siringhe per i farmaci pre-anestetico cocktail e post-operazione droghe.
2. Secondo il peso del ratto, preparare una siringa con farmaci pre-anestetici: carprofen (5 mg / kg), buprenorfina (50 mg / kg), Baytril (5 mg / kg) e Dexmedetomidine (0,5 mg / kg). Completa il volume a 1 ml con Ringer lattato.
3. Preparare inun'altra siringa l'inversione per i farmaci pre-anestetico: atipamezolo (500 mcg / kg).

3. Anestesia del Topo

1. Somministrare per via sottocutanea per l'animale la soluzione dei farmaci pre-anestetico di cui al punto 2.2. Poi, mettere l'animale torna in gabbia e aspettare che l'effetto sedativo.
2. Posizionare il topo in una camera chiusa riempita di 5% isoflurano in 100% O _2, e attendere che il ritmo respiratorio rallenta (circa 30 sec). Quindi, rimuovere il ratto dalla camera e posizionarlo sul tavolo intubazione.

4. Orotracheale intubazione

1. Lie l'animale sulla schiena, quindi fissare la testa mettendo una cinghia collegata a denti davanti al tavolo.
2. Con una luce in fibra ottica, illuminare lo spazio toracico. Poi, mettere un laringoscopio (o un costume fatto uno, Jou et al. ²⁰ per i dettagli) nella bocca dell'animale. Visualizza le corde vocali.
3. SlidE e posizionare una guida orotracheal nella trachea (tra le corde vocali). Far scorrere il tubo orotracheale (16 G dimensione del catetere) sulla guida.
4. Rimuovere la guida e controllare con uno specchio laringeo posto all'estremità del tubo orotracheale per la presenza di umidità, confermando la posizione appropriata del tubo nella trachea e non nell'esofago.
5. Collegare il tubo di un ventilatore roditore (683 roditore ventilatore, Harvard Apparatus) e regolare la concentrazione di isoflurano al 2% (100% O _2).
6. Fissare il tubo orotracheale con del nastro adesivo chirurgico.

5. Chirurgia Vertebrale

1. Posto l'animale in decubito ventrale su una placca chirurgica riscaldata, con il naso che punta a 90 ° per il chirurgo. Mantenere la temperatura corporea intorno 37,5 ° C per tutta la chirurgia.
2. Radersi i capelli con Clippers tra le scapole e rimuovere i capelli con una garza.
3. Pulire la pelle con betadine, poi con 70% di alcol. Ripetere questa operazione 3 volte.
4. Un pizzico piedi viene eseguita prima dell'inizio della chirurgia per garantire la corretta profondità dell'anestesia.   Quindi, eseguire una laterale incisione cutanea rostro-caudale con le forbici tra le scapole.
5. Tagliare il acromiotrapezius muscolo rostro-caudale seguendo il tendine per evitare emorragie. Poi dissociare il muscolo romboide per accedere ai muscoli spinale (che circondano la vertebra).
6. Ritrarre il muscolo spinale da C1 a C3 vertebra. La vertebra C2 è quella con un apofisi prominente.
7. Pulire il muscolo intorno alla parte dorsale della vertebra utilizzando tamponi di cotone sterile.
8. Iniziare a rimuovere con attenzione l'apofisi di C2 con un rongeur. Quindi, continuare meticolosamente fino alla dorsale del midollo spinale è esposto. Assicurarsi che laminectomia è una laminectomia emi dorsale. Prestare particolare attenzione alla dura madre che racchiude il midollo spinale e le arterie in prossimità di questa zona.
9. Con # 55 pinze, sezionare rostro-caudale la dura lungo C2, il prossimo proseguire lateralmente su ciascun lato rostrale e caudale.
10. Spugna il liquido cerebrospinale.
11. Effettuare una sezione laterale sotto la cervicale dorsale radice numero 2 con le microscissors. Verificare con un micro bisturi che l'estensione della lesione è abbastanza vicino per raggiungere la linea mediana del midollo spinale (vedere la Figura 2A per una vista dorsale della lesione). Se no, allora un altro taglio potrebbe essere fatto per completare la lesione. In caso di sanguinamento, utilizzare tamponi di cotone sterili. Fare attenzione a non andare al lato controlaterale, in caso contrario, l'animale non si riprenderà dall'infortunio e avrà una insufficienza respiratoria.
12. Suturare i muscoli come strato protettivo e suturare la pelle. Pulire la ferita con Betadine saturo garza sterile.
13. Turn-off il vaporizzatore isoflurano e iniettare i farmaci di inversione (atipamezolo [500 mg / kg, im]), controllare la temperatura corporea.
14. Quando l'animale inizia a respirare contro il ventilatore,scollegare il tubo tracheale dal ventilatore e quindi rimuovere il tubo orotracheale. Posto l'animale in una gabbia riscaldata per il recupero.

6. Assistenza post-chirurgica

Dopo l'intervento chirurgico, gli animali sono costantemente monitorati per garantire il miglior ambiente possibile per il recupero. Antibiotici (Baytril, 5 mg / kg), anti-infiammatori (Carprofene, 5 mg / kg) e buprenorfina (50 mg / kg) farmaci sono somministrati ogni 12 ore per i primi 2 giorni post-intervento chirurgico per prevenire infezioni e ridurre il verificarsi del dolore post-operatorio. I ratti hanno accesso ad libitum a cibo morbido e acqua (o acqua gelatine per la prima giornata post-operatoria). Fluidi sottocutanei possono essere usati per prevenire la disidratazione sui primi giorni post-operatorie. Il peso corporeo e l'assunzione di cibo vengono monitorati giornalmente. Il loro ambiente si arricchisce tutto l'esperimento e il tempo di post-infortunio (dual abitazioni, tubi nelle loro gabbie).

Risultati

Entità della lesione

Il successo e la riproducibilità di questo particolare modello sperimentale dipendono l'esperienza di ciascun manipolatore / chirurgo. La successiva quantità di recupero respiratorio (attività del nervo frenico e del diaframma) a seguito di una lesione C2 è correlata con la restante ventrolateral risparmiato materia bianca ^21. Poiché la lesione è "fatto a mano" e richiede una certa pratica del chirurgo, l'entità di ogni pregi...

Discussione

Difficoltà tecniche di rendere il Injury Modello C2

Il modello murino lesione C2 è un interessante strumento per lo studio delle vie respiratorie neuroplasticità post-lesionale. Tuttavia, i passi necessari per produrre un modello riproducibile e affidabile sono numerosi e ciascuno di essi potrebbero avere un impatto sui risultati dello studio. Ad esempio, durante il processo di intubazione, estrema cura deve essere presa in quanto il tubo orotracheale può produrre una infiam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Animal
Male Sprague Dawley Rat	Janvier		225-250 g
Strumenti chirurgici
Student Dumont #5 forcipe	Strumento per le scienze 91150-20		91100-12
Mayo-Stille Forbici	Fine Science Tool	14013-15	Forbici a
molla curve per studenti Vannas	Fine Science Tool	91500-09	Forbici a molla dritte
- Lame da 8 mm	Fine Science Tool	15025-10	Dritto Blunt/Blunt
Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tool	16121-14	Coltello da
dissezione curvo - Fine Tip	Fine Science Tool	10055-12	Dritto
Olsen-Hegar Porta-Ago Strumento	Fine Science	12002-14	Seghettato
Weitlaner-Locktite Retrattore	Fine Science	Tool 17012-11	2x3
Suture chirurgiche smussate assorbibili	Centravet	BYO001	Dimensione della sutura 4-0
Equipment
Hot Bead Steriliser	Fine Science Strumento	18000-45
Catetere	Centravet	CAT188	16 G
Laringoscopio
Filo
Specchio laringeo	Centravet	MIR011
Ringer lattato	Centravet	RIN020
Siringa	Centravet Ago Centravet
O2	Air Liquid I1001M20R2A001
683 RodentT Ventilatore 115/230V	Harvard Apparatus	55-0000
Vaporizzatore autonomo	WPI	EZ-155
Letto riscaldato a linea sottile	WPI	EZ-211
Contenitore d'aria	WPI	EZ-258
Drugs
Carprofene	Centravet
Rimadyl	Centravet	RIM011
Buprenorfina	Centravet	BUP001
Baytril	Centravet	BAY001
Dexmedetomidina	Centravet	DEX010
Atipamezolo	Centravet	ANT201
Soluzione di betadina	Centravet	VET002
Isoflurano	Centravet	VET066

Strumento per le scienze fini di guida