Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.
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Articolo metodologico
Imaging attraverso il caso pupa di
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di lunga data di Drosophila come modello per la biologia cellulare e dello sviluppo ha prodotto una serie di strumenti. Insieme, queste tecniche hanno permesso l'analisi di biologia cellulare e dello sviluppo da diverse angolazioni metodologiche. L'imaging dal vivo è un metodo emergente per osservare processi cellulari dinamici, come la divisione cellulare e la motilità cellulare. Avendo mutazioni isolato in non caratterizzate proteine del ciclo cellulare putative divenne essenziale osservare mitosi in situ utilizzando l'imaging dal vivo. La maggior parte degli studi di imaging dal vivo in Drosophila sono concentrati sulle fasi embrionali che sono accessibili alla manipolazione e l'osservazione a causa delle loro piccole dimensioni e chiarezza ottica. Tuttavia, in queste fasi del ciclo cellulare è insolito in quanto manca di una o entrambe le fasi gap. Per contro, le cellule dell'ala pupa di Drosophila hanno un ciclo tipica cellula e sottoposti ad un periodo di rapida mitosi attraversa circa 20 ore di sviluppo pupa. È facile identify e isolare pupe della fase di catturare mitosi in situ. Montaggio pupe intatta disponibile la migliore combinazione di trattabilità e durata durante l'imaging, consentendo di eseguire esperimenti per diverse ore con un impatto minimo sulla vitalità cellulare e animale. Il metodo permette l'osservazione di caratteristiche più piccolo, o minore di, volare cromosomi. Regolazione delle impostazioni del microscopio e dei dettagli del montaggio, ha consentito l'estensione della preparazione per la visualizzazione dinamica della membrana delle cellule adiacenti e proteine fluorescente come la tubulina. Questo metodo funziona per tutte le proteine fluorescenti testate e in grado di catturare le caratteristiche di scala inferiori al micron su una varietà di scale temporali. Mentre limitato al esterno 20 micron della pupa con un microscopio confocale convenzionale, questo approccio all'osservazione proteine e dinamiche cellulari nei tessuti pupa in vivo può essere generalmente utile nello studio della biologia cellulare e dello sviluppo in questi tessuti.
Introduzione
La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un modello affermato per studiare molti aspetti della biologia. Ricerca Drosophila ha una storia ricca di sperimentazione genetica che permette forme sofisticate di manipolazione genetica, tra cui l'espressione, l'abbattimento e la mutazione. Con l'avvento delle etichette proteine fluorescenti, questo repertorio si è ampliato per includere studi sulle cellule e proteine in animali vivi. L'embrione mosca è un ottimo sistema per tali studi è piccolo e otticamente trasparente permettendo profondo, immagini ad alta risoluzione in vivo 1-3. Altri stadi di sv....
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Protocollo
1. Vola lavoro
- Mantenere mosche sul medio farina di mais-agar-melassa, lievito normale a temperatura ambiente 10.
- Per croci, isolare vergini entro 6 ore di eclosion. Dopo aver attraversato ai maschi del genotipo desiderato, il cambiamento vola a nuovi flaconi ogni 3-4 giorni.
Nota: Per questi esperimenti, la linea Gal4 A9 è stato usato per guidare l'espressione dei transgeni nell'ala. Fly azioni possono essere ottenute presso il centro stock a Bloomington. Azioni utilizzati in questi esperimenti includono A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (....
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Risultati
Cellule in epiteli pseudostratificato, come la sviluppo occhio Drosophila, o lo strato ventricolare del sistema nervoso centrale dei vertebrati sviluppo, subiscono movimenti nucleari, definito migrazione nucleare interkinetic, in fase con il ciclo cellulare. La replicazione del DNA avviene quando i nuclei sono o vicino alla superficie basale e cellule entrano mitosi quando i nuclei raggiungono la superficie apicale 15,16. Le cellule ala pupa formano un monostrato in rapida divisione epitelio durante .......
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Discussione
Per visualizzare, misurare e quantificare le caratteristiche delle cellule in divisione, lo sviluppo necessario di una semplice preparazione per osservare mitosi nell'ala pupa vivente di Drosophila mediante analisi confocale di His2AvGFP cellule che esprimono. Questo metodo è stato usato per documentare che il ciclo cellulare nell'ala pupa somiglianze forti alla cella cicli in epiteli pseudostratificato dal fatto che nuclei mossa alla superficie apicale dell'epitelio cui entrano mitosi. Dopo telofas.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Akira Chiba per il sostegno intellettuale, supporto materiale, e le scorte. Grazie a Julia Dallman per i commenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pattino | Genesee Scientific | 59-114 | per anestesia per mosche |
| 2 gas | Airgas South | CD50 | Per anestesia per mosche |
| Regolatore | Airgas South | CO2 Fiale | |
| mosche | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Coltura |
| di moscheDrosophila linee: A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Piatti con fondo in vetro #1 1/2 | WillCo Wells BV | Per microscopia | |
| Glicole tiodietilene | Fluka | 88559 | mountant |
| d'arte | argilla da modellare | Supporto per posizionare le pupe contro | |
| i pennelli | negozio di forniture | Per manipolare le mosche | |
| Pinze fini, Inox #5 | Strumenti di scienze fini | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | qualsiasi | 8 Gb di RAM per l'analisi di immagini/filmati | |
| Software | Software http://fiji.sc/Fiji gratuito | di analisi delle immagini | |
| Microscopio | Qualsiasi confocale a scansione rapida dovrebbe essere sufficiente | ||
| Lenti a immersione in olio 20X a secco e 40X o 63X | qualsiasi | Per l'imaging di caratteristiche | |
| tissutali, cellulari e subcellulariOlio da immersione (non fluorescente) | |||
| Stereomicroscopio | qualsiasi | Per la manipolazione delle mosche |
Riferimenti
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al.
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Ristampe e permessi
