Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell'espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.
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Articolo metodologico
Slice Cervello biotinilazione: An
In questo articolo
Sommario
Abstract
Traffico endocytic regolamentata è il meccanismo centrale facilitando una serie di eventi neuromodulatori, controllando dinamicamente recettore, canale ionico, e la cella presentazione superficie trasportatore su una scala minuti di tempo. C'è una vasta diversità di meccanismi che controllano il traffico endocitico delle singole proteine. Gli studi che indagano le basi molecolari del traffico hanno fatto affidamento principalmente sulla biotinilazione superficie per misurare quantitativamente cambiamenti nell'espressione superficiale proteina di membrana in risposta a stimoli esogeni e la manipolazione genetica. Tuttavia, questo approccio è stato limitato principalmente alle cellule coltivate, che potrebbero non riflettere fedelmente i meccanismi fisiologicamente rilevanti in gioco in neuroni adulti. Inoltre, gli approcci di cellule in coltura possono sottovalutare le differenze regionali specifici meccanismi di traffico. Qui, descriviamo un approccio che si estende biotinylation superficie cellulare per la preparazione fetta acuta cervello. Noidimostrano che questo metodo fornisce un approccio ad alta fedeltà per misurare rapidi cambiamenti nei livelli superficiali delle proteine di membrana in neuroni adulti. Questo approccio rischia di avere un ampio programma di utilità nel campo del traffico endocytic neuronale.
Introduzione
Traffico endocitico è un meccanismo cellulare ubiquitario che perfeziona la presentazione membrana plasmatica di una varietà di proteine integrali di membrana. Endocitosi fornisce nutrienti vitali per l'ambiente intracellulare 1 e desensibilizza segnalazione dei recettori in risposta all'attivazione del recettore 2. Riciclo indietro alla membrana plasmatica endocitosi può inoltre migliorare segnalazione cellulare aumentando i livelli di espressione della proteina sulla superficie cellulare 3. Inoltre, perturbazioni traffico di membrana sono implicati in numerose malattie e condizioni patologiche 4,5, sottolineando....
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Protocollo
Tutti movimentazione degli animali e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Comitato Usa (IACUC), seguendo il protocollo # approvato A1506 (Melikian, PI).
Soluzioni necessarie
Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) - Make fresco tutti i giorni
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl 2, 26 NaHCO mm 3, e 11 mm di glucosio
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Risultati
Il trasportatore della dopamina neuronale è internalizzato in risposta all'attivazione PKC in linee cellulari 16-20. Nonostante le molte relazioni che dimostrino la PKC-indotte perdite di superficie DAT in una varietà di linee cellulari e sistemi di espressione, è stato impegnativo per confermare questo dato nei neuroni dopaminergici in coltura 21-23. Abbiamo usato fettine striatali mouse per testare direttamente se DAT interiorizza in risposta all'attivazione PKC nei neuroni dopaminergici .......
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Discussione
Nonostante la conoscenza di lunga data che il traffico endocytic criticamente l'impatto segnalazione sinaptica nel cervello, si è dimostrato impegnativo per misurare quantitativamente cambiamenti nell'espressione superficie della proteina nei neuroni adulti. In questo lavoro, riportiamo un metodo affidabile per etichettare proteina di superficie ex vivo in fettine cerebrali acute. Preparazioni fetta cervello hanno una lunga storia di utilità per le registrazioni elettrofisiologiche, in quanto mantengono.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi economici in conflitto con questo lavoro.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH sovvenzioni DA15169 e DA035224 di HEM
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-biotina | Pierce | 21331 | |
| Streptavidina agarosio | Pierce | 20347 | |
| Albumina sierica bovina senza IgG, senza proteasi | Sigma | A3059 | |
| Separatore di microtomo vibrante | vari | ||
| Bagno d'acqua agitante | vari | ||
| Inserti a fondo di rete Millicell (8 & micro; | Millipore | PI8P 012 50 | Questi possono essere lavati a mano e riutilizzati |
Riferimenti
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R.
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Ristampe e permessi
