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Summary

Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine ​​e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell'espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.

Abstract

Traffico endocytic regolamentata è il meccanismo centrale facilitando una serie di eventi neuromodulatori, controllando dinamicamente recettore, canale ionico, e la cella presentazione superficie trasportatore su una scala minuti di tempo. C'è una vasta diversità di meccanismi che controllano il traffico endocitico delle singole proteine. Gli studi che indagano le basi molecolari del traffico hanno fatto affidamento principalmente sulla biotinilazione superficie per misurare quantitativamente cambiamenti nell'espressione superficiale proteina di membrana in risposta a stimoli esogeni e la manipolazione genetica. Tuttavia, questo approccio è stato limitato principalmente alle cellule coltivate, che potrebbero non riflettere fedelmente i meccanismi fisiologicamente rilevanti in gioco in neuroni adulti. Inoltre, gli approcci di cellule in coltura possono sottovalutare le differenze regionali specifici meccanismi di traffico. Qui, descriviamo un approccio che si estende biotinylation superficie cellulare per la preparazione fetta acuta cervello. Noidimostrano che questo metodo fornisce un approccio ad alta fedeltà per misurare rapidi cambiamenti nei livelli superficiali delle proteine ​​di membrana in neuroni adulti. Questo approccio rischia di avere un ampio programma di utilità nel campo del traffico endocytic neuronale.

Introduction

Traffico endocitico è un meccanismo cellulare ubiquitario che perfeziona la presentazione membrana plasmatica di una varietà di proteine ​​integrali di membrana. Endocitosi fornisce nutrienti vitali per l'ambiente intracellulare ¹ e desensibilizza segnalazione dei recettori in risposta all'attivazione del recettore ^2. Riciclo indietro alla membrana plasmatica endocitosi può inoltre migliorare segnalazione cellulare aumentando i livelli di espressione della proteina sulla superficie cellulare ^3. Inoltre, perturbazioni traffico di membrana sono implicati in numerose malattie e condizioni patologiche ^4,5, sottolineando la necessità di studiare i meccanismi molecolari che governano la proteina traffico endocitico. Mentre molte proteine ​​utilizzano meccanismi di internalizzazione classici clatrina-dipendente, prova di montaggio nel corso degli ultimi anni dimostra che più i meccanismi di endocitosi clatrina-indipendente governano il potenziale endocitica di una serie crescente diproteine ^​​6,7. Quindi, la necessità di indagare i meccanismi endocitiche agevolare il traffico nei sistemi pertinenti fisiologici è cresciuta notevolmente.

Nel cervello, il traffico endocitico dei recettori, canali ionici e trasportatori di neurotrasmettitori ha un ruolo primario nella creazione di plasticità sinaptica ^8-11 e risposta ai farmaci d'abuso ^12-15, in ultima analisi, un impatto eccitabilità neuronale e risposte sinaptiche. Ad oggi la maggior parte degli studi di traffico neuronali contare su entrambi i sistemi di espressione eterologa o neuroni primari in coltura, nessuno dei quali può riflettere in maniera affidabile i meccanismi in gioco in neuroni adulti. Qui riportiamo un approccio che utilizza biotinilazione superficie per misurare quantitativamente i livelli di proteina di superficie in fettine cerebrali acute derivanti da roditori adulti. Usando questo approccio, presentiamo i dati che dimostrano che il topo striato trasportatore della dopamina interiorizza rapidamente in rerisposta a forbolo estere mediata proteina chinasi C (PKC) attivazione.

Protocol

Tutti movimentazione degli animali e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Comitato Usa (IACUC), seguendo il protocollo # approvato A1506 (Melikian, PI).

Soluzioni necessarie

Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) – Make fresco tutti i giorni

125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4, 1.2 mM MgCl _2, 2.4 mM CaCl _2, 26 NaHCO mm _3, e 11 mm di glucosio

Nota: Preparare ACSF come una soluzione madre 10x, esclusi NaHCO ₃ e glucosio. Rendere soluzioni di lavoro 1x ogni giorno dal magazzino 10x, che completa con fresco NaHCO ₃ e glucosio.

Saccarosio-integrato ACSF (SACSF) – Make fresco tutti i giorni

250 suc mMrosa, 2.5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4, 1.2 mM MgCl _2, 2.4 mM CaCl _2, 26 NaHCO mm _3, e glucosio 11 mM

Nota: Preparare SACSF come una soluzione madre 10x, esclusi NaHCO ₃ e glucosio. Rendere soluzioni di lavoro 1x ogni giorno dal magazzino 10x, che completa con fresco NaHCO ₃ e glucosio.

Solfo-N-hydroxysuccinyl-SS-biotina (solfo-NHS-SS-biotina, Pierce Chemical Company)

Le soluzioni madre dovrebbero essere 200 mg / ml in DMSO e sono resistenti a molteplici cicli di congelamento / scongelamento. Aliquote vengono conservati a -20 ° C. L'estere succinil viene rapidamente idrolizzato in soluzione acquosa, quindi le soluzioni di lavoro deve essere preparata immediatamente prima di applicare a fette.

Slice Quench Solution

ACSF integrato con la glicina 100 mM

RIPA Lysis Buffer

Tris 10 mM, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na desossicolato

RIPA con inibitori della proteasi (RIPA / PI) – Fare fresco tutti i giorni

RIPA integrato con 1 mM leupeptina, 1 mM pepstatina, 1 micron aprotinin, e 1 mm phenylmethyl fluoruro sulfonyl.

1. Preparare cervello Fette

1. Fai fresco SACSF 1x e 1x ACSF
2. Raffreddare SACSF sul ghiaccio in un piccolo bicchiere. Questo verrà utilizzato per contenere il cervello di topo appena raccolto.
3. Saturare il ACSF e SACSF con l'ossigeno facendo gorgogliare con il 95% / 5% O ₂ / CO _2, 20 min in ghiaccio.
4. P30-38 topi dovrebbero essere utilizzati per la vitalità del tessuto ottimale. Sacrificare animali per dislocazione cervicale e decapitazione e rapidamente rimuovere i cervelli in prechilled, SACSF ossigenato.
5. Utilizzando un microtomo vibrante, fare 300 sezioni di cervello micron nella regione di interesse.
6. Se lo si desidera, le fette possono essere ulteriormente sezionati prima del recupero per arricchire di particolari regioni del cervello o di diritto separato e emisferi sinistro da utilizzare come controllo e fette sperimentali, rispettivamente.
7. Utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur, trasferire fette di maglia a fondo le camere fissati in piastre da 24 pozzetti.
8. Lasciare le fette di recuperare per 40 min, 31 ° C in ACSF ossigenato, con continui, gentile bubbling.

2. Trattamento farmacologico (se del caso) e Slice biotinilazione

1. Una volta recuperato, lavare fette 3x in preriscaldata (37 ° C), ossigenato ACSF gorgogliamento costantemente con il 95% / 5% O ₂ / CO _2.
2. Aggiungere composti di prova e incubare con l'ossigenazione continua.
   1. Per comodità, aggiungere un ^secolo volume di 10x farmaco concentrato 1/10, e miscelare capovolgendo delicatamente.
   2. Agitare delicatamente le piastre in un bagno di acqua alla temperatura desiderata.
3. Dopo il trattamento farmaco, rapidamentefette freddo di lavaggio 3x in ghiaccio ACSF freddo.

3. Proteine ​​di superficie Biotinylate

1. Preparare 1,0 mg / ml solfo-NHS-SS-biotina in ghiaccio ACSF fredda immediatamente prima dell'etichettatura.
2. Aggiungere 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotina a fette e fette di incubare in ghiaccio, 45 min.
3. Lavare le fette tre volte velocemente con ghiaccio freddo ACSF, poi incubare per 10 min in ghiaccio ACSF freddo sul ghiaccio.
4. Lavare le fette tre volte con ghiaccio freddo tampone fetta quench e incubare con 0,75 ml fetta tampone di tempra due volte, 25 min, sul ghiaccio per placare la connessione solfo-NHS-SS-biotina.

4. Preparare lisati di tessuto

1. Lavare le fette tre volte in ghiaccio ACSF freddo e trasferire ogni fetta in una provetta con una pipetta Pasteur fuoco lucido.
2. Pellet delicatamente fetta mediante centrifugazione a 200 xg, 1 min e con attenzione aspirare restante ACSF.
3. Aggiungere 400 ml di ghiaccio freddo RIPA / PI e rompere il tessuto pipettando su e giù una volta attraverso un pip P200ette.
4. Trasferimento dissociato fetta / RIPA in una nuova provetta e incubare 30 min, 4 ° C, rotazione, per completare lisi.
5. Pellet detriti cellulari mediante centrifugazione, 18.000 xg, 15 min, 4 ° C.
6. Determinare concentrazioni di proteine ​​lisato usando il saggio proteico BCA, con albumina di siero bovino (BSA) come standard.

5. Isolare Biotinylated Proteine

1. Ottimizzare Bead / totale rapporto proteine.
   Nota: I singoli livelli di espressione della proteina può variare notevolmente tra le diverse regioni del cervello. A meno che tutte le proteine ​​biotinilato in una data quantità di lisato tissutale è stata ripresa, non è possibile rilevare con precisione i potenziali cambiamenti nell'espressione superficie. Pertanto, è imperativo determinare empiricamente la ottimale tallone / rapporto proteine ​​totali per una particolare regione proteina / cervello prima di intraprendere un nuovo studio fetta biotinylation.
   1. Incubare 25 microlitri streptavidina agarosio perline con crescente quantitàs di lisato tissutale (intervallo di 25-200 mg), e poi procedere come descritto di seguito per l'associazione, lavaggio e eluizione passi.
   2. Quantificare le bande immunoreattive conseguenti e scegliere un rapporto tallone / lisato nel range lineare del legame che permetterà quantificazione accurata di una aumentata o diminuita espressione di superficie proteica.
2. Preparare Beads streptavidina-agarosio
   1. Determinare il volume totale cordone necessario per tutti i campioni. Preparare un volume di cordone sufficiente per tale importo più uno supplementare (cioè 4 campioni a 25 ml / campione = 100 perline microlitri + uno supplementare = 125 perline microlitri.
   2. Vortex streptavidina tallone stock e pipetta fuori desiderato volume. Se si utilizza una pipetta P200, tagliare l'estremità della punta per evitare il blocco o il tallone danni.
   3. Lavare perle 3 volte in 0,5-1,0 ml RIPA / PI per rimuovere i conservanti, vortex dopo ogni aggiunta RIPA e la raccolta di perle tra un lavaggio mediante centrifugazione 18.000 xg, 1 min, a temperatura ambiente temperamentoatura.
   4. Aspirare il tampone tra un lavaggio con una pipetta Pasteur di vetro collegato a un pallone di vuoto. Un P200 punta di plastica attaccato alla fine della pipetta Pasteur di vetro offre un controllo più preciso durante l'aspirazione. Non è necessario rimuovere assolutamente tutto il buffer per i primi due lavaggi, in quanto rischia di perline di aspirazione nella pipetta. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere quanto più il tampone in eccesso possibile senza aspirare le perline.
   5. Aggiungi RIPA / PI per portare perle al loro volume originario, pipettare su e giù per risospendere. Evitare vortex, a questo punto, come perle si attaccano alla parete del tubo.
   6. Perline aliquote in provette da microcentrifuga utilizzando un P200 con la punta tagliata. Pipetta su e giù parecchie volte tra il campionamento per assicurare perle rimangono uniformemente sospese e disperse tra i tubi.
3. Proteine ​​biotinilate legarsi a streptavidina perline
   1. Distribuire lisati cellulari ai tubi contenenti le perline agarosio. Per gli esperimenti whe re più campioni vengono confrontati, assicurarsi di utilizzare la stessa quantità di proteine ​​per ogni campione per confronti accurati.
   2. Aggiungere ulteriori RIPA / PI per portare a campioni ad un volume di 200 microlitri minimo. Questo assicura che i campioni si mescoleranno in modo adeguato durante l'incubazione e anche unifica le concentrazioni di proteine ​​di tutti i campioni.
   3. Porre i tubi in un rotatore provetta e miscelare notte a 4 ° C.
   4. In tubi separati, dispensare un equivalente del volume totale lisato utilizzato per ogni campione. In alternativa, se i volumi di campione sono alti, una frazione del volume totale lisato può essere riservato invece, per accogliere volumi carico massimo su gel SDS-PAGE. Questi saranno utilizzati per normalizzare l'espressione di superficie alla quantità totale di proteine.
   5. Aggiungere sia un uguale volume di 2x o 1/5 volume di 6x tampone campione SDS-PAGE e sia incubare a 4 ° C, in parallelo con i campioni di perline o conservare a -20 ° C fino vengono analizzati campioni.

ove_title "> 6. Elute e analizzare campioni

1. Pellet perline mediante centrifugazione 18.000 xg, 2 min, a temperatura ambiente.
2. Aspirare il surnatante e lavare perline tre volte con 0,75 ml RIPA. Per ridurre al minimo la perdita di tallone, lasciare un piccolo volume di testa di tampone sopra perline tra i lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il più RIPA possibile, senza disturbare il pellet tallone.
3. Eluire le proteine ​​biotinilate da perline streptavidina riducendo il legame disolfuro. Aggiungere 25 microlitri 2x SDS-PAGE riduzione tampone del campione, vortice bene e ruotare campioni di 30 minuti, a temperatura ambiente.
   Nota: Molte proteine ​​di membrana hanno una forte tendenza ad aggregarsi quando bollito in tampone campione SDS-PAGE, gravemente compromettere la loro mobilità elettroforetica. Se questo è il caso per la proteina indagato, evitare riscaldamento dei campioni e, invece, eluire lentamente a temperatura ambiente. Se bollente è assolutamente necessario (ad esempio, se un'altra proteina valutati in parallelo richiede bollente), sample buffer può essere completato con 2 M urea (concentrazione finale) per ridurre al minimo l'aggregazione. Mentre efficace nel ridurre l'aggregazione in alcuni casi, urea compromette spesso apparenze banda.
4. Analizzare i campioni immunoblot.
5. Scongelare campioni totali lisato e ruotare in parallelo con i campioni del branello, 30 min, temperatura ambiente.
6. Proteine ​​separate su gel SDS-PAGE.
7. Identificare proteine ​​(s) di interesse mediante immunoblotting.
   1. Essere certi che le bande vengono rilevati nell'intervallo lineare di rilevamento per una corretta quantificazione.
   2. Per assicurare che il reagente biotinilazione non ha avuto accesso alle proteine ​​intracellulari via le cellule danneggiate / compromessi. Questo si realizza meglio mediante immunoblotting in parallelo per una proteina intracellulare specifiche per il tipo di cellule in fase di studio.
   3. Quantificare densità band e calcolare la proteina relativa densità di superficie come percentuale del livello di espressione della proteina totale.

Representative Results

Discussion

Nonostante la conoscenza di lunga data che il traffico endocytic criticamente l'impatto segnalazione sinaptica nel cervello, si è dimostrato impegnativo per misurare quantitativamente cambiamenti nell'espressione superficie della proteina nei neuroni adulti. In questo lavoro, riportiamo un metodo affidabile per etichettare proteina di superficie ex vivo in fettine cerebrali acute. Preparazioni fetta cervello hanno una lunga storia di utilità per le registrazioni elettrofisiologiche, in quanto mantengono connessioni sinaptiche e la vitalità delle cellule fino a ore dopo la loro preparazione. Inoltre, le strategie di affettamento possono essere ottimizzati per preservare specifiche connessioni sinaptiche tra varie regioni cerebrali di interesse.

Gran parte del lavoro preliminare indagini sul traffico proteina neuronale in preparazioni cervello-derivato è dipeso principalmente dalla sinaptosomi e colture di neuroni primari. Il metodo slice approccio biotinilazione acuta vanta diversi vantaggi rispetto a uno dei thESE: sinaptosomi vengono fisicamente rimossi dal assone e non possono contenere i fattori molecolari necessari per ricapitolare fedelmente intatto il traffico proteina neuronale. Inoltre, preparazioni sinaptosomali sono spesso contaminati con frammenti di membrana che possono alterare i risultati sperimentali. Colture neuronali primarie sono in genere derivate da neuroni evolutivamente immaturi, che non possono essere adeguatamente differenziati nelle loro fenotipi neuronali mature esprimono meccanismi di traffico specifiche cellule. Al contrario, fettine acute presentano elevato grado di vitalità delle cellule e sono derivati ​​da animali adulti. Inoltre, il traffico di superficie può essere paragonato a seguito manipolazioni molecolari in vivo, come il gene di consegna / knockdown, optogenetic neuronale stimolazione / inibizione, o in seguito a trattamenti farmacologici in vivo o adattamenti comportamentali.

Anche se ci sono molti vantaggi per l'ex vivo spidocchi approccio, ci sono diverse limitazioni. Acuta (noncultured) fettine di cervello hanno validità limitata e non sono quindi adatti per trattamenti farmacologici cronici. Inoltre, abbiamo osservato che non rimangono vitali durante gli esperimenti cambiamento di temperatura, dove le fette stanno rapidamente raffreddato e rewarmed. Inoltre, fette sono più valida quando preparati da topi P21-P35, potenzialmente limitando la quantità di tempo che i trattamenti in vivo possono essere intrapresi prima di eseguire esperimenti. Infatti, utilizzando una soluzione high-saccarosio taglio, troviamo che il traffico DAT è meno riproducibile osservata in fette preparate da topi P35-P42 (Gabriel e Melikian, dati non pubblicati). Tuttavia, osserviamo nettamente migliorata redditività fetta negli animali più vecchi con la preparazione fetta modificato come descritto da Zhao et al. ²⁴ Questo approccio è un'ottima alternativa in cui i parametri metodologici richiedono l'utilizzo di animali più vecchi (cioè. Seguente eitla sua espressione virale mediata proteine ​​/ RNA, i comportamenti che istituiscono, o cronica a trattamenti farmacologici in vivo).

Ci sono diversi fattori tecnici supplementari che possono influenzare il risultato sperimentale. E 'indispensabile per determinare empiricamente ottimale tallone / rapporto totale proteine ​​necessarie per catturare tutte le proteine ​​biotinilato in una data quantità di proteine ​​totali lisato prima di tentare esperimenti quantitativi. Questo problema è spesso trascurato, ma può essere il fattore decisivo di essere in grado di rilevare i cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​di superficie. Se tutte le proteine ​​biotinilato non è quantitativamente recuperato, cambiamenti nei livelli superficiali saranno o non rilevabili o impreciso misurata. Un'altra variabile che potrebbe influenzare i risultati è il volume di tampone di lisi utilizzato dissociare le fette di tessuto. La massa di tessuto assoluto utilizzato dipenderà dalla regione di interesse in fase di studio, e verrà likely richiedono più o meno tampone di lisi per conseguire solubilizzazione tessuto completo. Come tale, concentrazioni di proteine ​​lisato finali possono inoltre variare da regioni cerebrali. Pertanto, le condizioni di lisi devono essere determinate empiricamente per una data regione del cervello e mantenute costanti tra esperimenti indipendenti.

In sintesi, forniamo un protocollo dettagliato per misurare il traffico proteina neuronale in neuroni adulti con fettine di cervello ex vivo acute. Utilizzo di questo approccio rischia di portare ad una più approfondita comprensione dei meccanismi che sono alla base della tratta endocitiche funzione neuronale.

Materials

sulfo NHS-SS-biotin	Pierce	21331
Streptavidin agarose	Pierce	20347
IgG-free, Protease-free bovine serum albumin	Sigma	A3059
Vibrating microtome sectioner	various
Shaking water bath	various
Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size)	Millipore	PI8P 012 50	These can be washed by hand and reused