Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci Mycobacterium tuberculosis Amplificazione Microarray

Sommario

Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.

Abstract

La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray-MDR-TB che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse. Un microarray di amplificazione combina asimmetrica PCR, selezione del formato di destinazione, l'etichettatura di destinazione e microarray ibridazione all'interno di un'unica soluzione e in una sola camera microfluidica. Un metodo di elaborazione batch è dimostrato con un 9-plex master mix asimmetrico e bassa densità elemento gel microarray per la genotipizzazione multi-droga Mycobacterium tuberculosis resistenti (MDR-TB). Il protocollo qui descritto può essere completato in 6 ore e fornire corretta genotipizzazione con almeno 1.000 equivalenti cellulari di DNA genomico. Incorporando on-chip fasi di lavaggio è fattibile, che si tradurrà in un metodo amplicone interamente chiuso e sistema. Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è in definitiva limitata dal numero di coppie di primer che possono essere combinati in un unico master mix e ancora ottenere una sensibilità desiderata e metriche di performance specificità, piuttosto che il numero di sonde che sono immobilizzati sulla matrice. Allo stesso modo, il tempo di analisi totale può essere accorciato o allungato in funzione dell'uso specifico previsto, domanda di ricerca, e limiti desiderati di rilevamento. Tuttavia, l'approccio generale semplifica notevolmente workflow microarray per l'utente finale, riducendo il numero di fasi di elaborazione manualmente intensivo e richiede tempo, e fornisce un percorso biochimico e microfluidica semplificata per tradurre diagnostici basati su microarray nella pratica clinica di routine.

Introduzione

Rilevamento caso precoce e un trattamento rapido sono considerate le strategie di controllo più efficaci per ridurre Mycobacterium tuberculosis (MTB) trasmissione ^1, e ora c'è un ampio consenso nella comunità TB che un punto di assistenza (POC) o in prossimità POC test per diagnosticare contemporaneamente TB ed è necessaria resistenza ai farmaci (DR). Tecnologie come GeneXpert di Cefeidi e di altri test di amplificazione degli acidi nucleici riducono il tempo di diagnosi per molti pazienti affetti da tubercolosi, e di fornire una rapida read-out che indica la resistenza alla rifampicina o mutazioni selezionate che conferiscono resistenza agli ....

Protocollo

Per i laboratori che seguono le precauzioni universali della PCR, è operativamente più efficace per includere diversi microarrays di amplificazione e guarnizioni per substrato e lavare tutti i microarrays amplificazione simultaneamente in un contenitore di massa, come descritto qui. Formati di consumo sono disponibili per l'esecuzione di post-amplificazione passi microarray di lavaggio in modo del tutto sigillato, prova amplicone chiuso, come riportato altrove ^30,33.

1. Setup

1. Estrarre e purificare acidi nucleici dal campione in appropriate condizioni di biosicurezza con un metodo di scelta. Il requisito è che gli....

Risultati

Analisi di immagine qualitativa può fornire indicazioni in fonti di rumore sperimentale o variabilità che sono difficili da individuare in tabelle di dati generati dal software automatizzato di analisi di immagine. Quindi, può essere utile verificare visivamente che: 1) tutti gli elementi gel sono integro e non danneggiato, 2) lo sfondo globale è esente da artefatti fluorescenti che possono influenzare il segnale individuo a valori di rumore (SNR), 3) non vi è alcuna prova di formazione di bolle o non uniforme di amplif.......

Discussione

Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è infine dettata dall'efficienza del multiplex PCR asimmetrica, non microarray. Nella nostra esperienza, 10-12 coppie di primer uniche possono essere facilmente multiplexing in un formato di amplificazione microarray. Criteri di progettazione di primer e sonde convenzionali applicano a nuovi saggi, salvo che uno deve anche considerare potenziali interazioni tra acidi nucleici soluzione monofase e sonde immobilizzate microarray, l'efficienza termica del t.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microarray di amplificazione MDR-TB, con guarnizione applicata e vetrini di copertura pretagliati	Akonni Biosystems
, contenente 2X tampone PCR con HotStar Taq più	Qiagen	#206143
Taq polimerasi	Qiagen	#201207
acqua priva di RNAsi	Qiagen	#206143
Formamide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP227-500
20 mg mL-1 albumina sierica bovina non acetlata (BSA)	Sigma-Aldrich	#3B6917
5X miscela di primer MDR-TB concentrata	Akonni Biosystems	Inquire
500 fg uL-1 amplificazione e controllo dell'inibizione	Akonni Biosystems	Inquire
20X SSPE	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP1328-4
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP151-500
Spray disinfettante	Tecnologie attuali, Inc.
70% di alcol isopropilico	Decon Labs, Inc.	#8416
Imager microarray, con software automatizzato per l'analisi delle immagini e dei dati	Akonni Biosystems	100-20011
Termociclatore con inserto a blocco piatto	Akonni Biosystems	100-10021
Stazione di lavaggio ad alta produttività e supporto per vetrini	ArrayIt	HTW
Pinze da dissezione	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#10-300
Mini Vortexer	VWR	#3365040
Mini-centrifuga	VWR	#93000-196
Kit compressore aerografo	Pneumatico centrale	#95630