L'origami del DNA è un metodo potente per fabbricare oggetti precisi su scala nanometrica programmando l'auto-assemblaggio di molecole di DNA. Qui descriviamo un protocollo per il ripiegamento di un robot bio-responsivo da origami di DNA, la sua purificazione e colorazione negativa per l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).
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Articolo metodologico
Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nanorobot DNA è un dispositivo nanometrico cava esagonale, progettato per aprire in risposta a stimoli specifici e presentare merci sequestrate all'interno. Entrambi gli stimoli e le merci possono essere personalizzati in base alle esigenze specifiche. Qui si descrive il protocollo di fabbricazione nanorobot DNA, con l'uso della tecnica origami di DNA. Il procedimento inizia miscelando brevi graffette DNA filamenti singoli, in una miscela di magazzino che viene poi inserito in un lungo, circolare, scaffold DNA a singolo filamento in presenza di un buffer di piegatura. Un cycler termico standard viene programmato per ridurre gradualmente la temperatura di reazione di miscelazione per facilitare la ricottura graffette da ponteggio, che è la forza guida dietro la piegatura della nanorobot. Una volta che la reazione di piegatura 60 hr è completa, graffette eccesso vengono eliminati utilizzando un filtro centrifugo, seguita da visualizzazione tramite elettroforesi in gel di agarosio-(AGE). Infine, successo fabbricazione del nanorobot viene verificata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM),con l'uso di uranile-formiato come colorazione negativa.
Introduzione
Gli usi per gli acidi nucleici nanotecnologie sono sbalorditivi. La trattabilità della base Watson-Crick accoppiamento nonché la facilità e relativo basso costo della sintesi su larga scala di oligo misura 2 ha generato un'esplosione di applicazioni 3 e ricerca nel campo delle nanotecnologie DNA. Nanotecnologie DNA strutturale, basato sul immobile 4,5 giunzione Seeman come un elemento fondamentale fa uso di DNA come unità elementare auto-assemblaggio per la costruzione di forme arbitrarie 6-8.
Il recente sviluppo del DNA ponteggi origami 9 tecnica permette per la costruzione di co....
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Protocollo
1. Preparazione di Staples Pool Miscela
- Ordinare liofilizzato DNA graffette nanorobot su piastre da 96 pozzetti come elencato nella tabella 1 (vedi Materiali) e normalizzare a 10 nmol. Per una descrizione dettagliata della progettazione e architettura del nanorobot DNA vedere Ben-Ishay et al. 14 e Douglas et al. 15).
- Ricostituire ogni fiocco bene con DNasi / ultrapuro RNasi-free a una concentrazione di 100 micron. Per punti normalizzati a 10 nmol, ricostituire con 100 ml di acqua ultrapura.
- Pool insieme 20 ml di ogni fiocco usando una pipetta multicanale e di una sterile, 55 ml di....
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Risultati
Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Tutte le corsie contengono 1 mg di DNA totale, misurata mediante spettrofotometro (OD 260). Rispetto al ponteggio circolare DNA a singolo filamento (corsia 2), nanorobots sono ostacolati nel gel causa del loro peso molecolare più elevato, il risultato di graffette ibridazione al DNA ponteggio (Lane 3. Red freccia). La banda basso peso molecolare a Lane 3 rappresenta graffette in eccesso che non si legano al DNA patibolo.......
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Discussione
Abbiamo descritto la fabbricazione, la purificazione, e visualizzazione del nanorobot DNA. Dopo la fabbricazione del telaio esagonale del dispositivo, la funzione del nanorobot è programmato con la semplice introduzione di carico specifico e fili di rilevamento al robot che facilmente trovare la posizione designata causa idrogeno-bonding complementarità con siti di aggancio disponibile singolo filamento 14 , 15,22.
Il protocollo di fabbricazione descritto utilizza una rampa di ric.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare S. Douglas per le discussioni di grande valore e consigli, e tutti i membri del laboratorio Bachelet per utili discussioni e lavoro. Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti della Facoltà di Scienze della Vita e Istituto di Nanotecnologie e Materiali Avanzati alla Bar-Ilan University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acqua distillata senza DNasi/RNasi | Gibco | 10977 | |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S | |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 | |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Filtro centrifugo Amicon Ultra 0,5 ml 100K MWCO | Amicon | UFC510024 | |
| Agarosio | Promega | V3125 | |
| TBE tampone | Promega | V4251 | |
| Bromuro di etidio 10 mg / ml soluzione | Sigma Aldrich | E1510 | |
| 1 kb marcatore di DNA | NEB | N3232S | |
| Caricamento colorante | NEB | B7021S | |
| formiato di uranile | polysciences | 24762 | |
| griglie TEM rivestite di carbonio | Servizi scientifici | EFCF400-Cu-50 | |
| Termociclatore c1000 Touch | Bio-Rad | ||
| Glow Discharge K100X | Emitech | ||
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | ||
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | ||
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
Riferimenti
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- P....
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Ristampe e permessi
