Sequenziale In vivo Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Sommario

La misurazione quantitativa della funzione progenitrici del midollo in guarigione della frattura richiede una tecnologia di imaging seriale ad alta risoluzione. Qui, sono ottenute utilizzando protocolli per microscopia intravitale e inseguimento osteo-lineage sequenzialmente immagine e quantificare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali endogene osteogenico / progenitrici nel processo di riparazione di fratture ossee.

Abstract

Bone gira continuamente ed è altamente rigenerante seguendo lesioni. Cellule staminali / progenitrici osteogenici sono stati a lungo ipotizzato di esistere, ma in vivo dimostrazione di tali cellule è stato solo di recente raggiunto. Qui, sono forniti vivo tecniche di imaging ad investigare il ruolo delle cellule staminali / progenitrici osteogenici endogeni (OSPCs) e la loro progenie in riparazione ossea. Utilizzando cellule osteo-lineage tracing modelli e immagini intravitale di microfratture indotte in osso cranica, OSPCs può essere direttamente osservato durante i primi giorni dopo la lesione, in cui si verificano eventi critici nel processo di riparazione precoce. Siti di lesione può essere ripreso in sequenza rivelando che OSPCs trasferirsi al pregiudizio, aumentare in numero e differenziarsi in osteoblasti che formano l'osso. Questi metodi offrono un mezzo per indagare il ruolo dei regolatori molecolari delle cellule staminali-intrinseci ed estrinseci per la rigenerazione e la riparazione ossea.

Introduzione

Malattie degenerative delle ossa e perdita di massa ossea correlata all'età portando ad un elevato rischio di fratture osteoporotiche è diventata una sfida importante nella salute pubblica ^1. Manutenzione Bone è controllato da osteoblasti che formano l'osso e osteoclasti osso-riassorbimento. Difetti di cellule che formano l'osso sono una causa principale di perdita di massa ossea legata all'età e le malattie degenerative delle ossa ^2,3. Mentre la vasta ricerca si è concentrata sul miglioramento della guarigione della frattura, la scoperta di farmaci affidabili per curare le malattie degenerative delle ossa e per invertire la debolezza delle fratture osteoporotiche rimane una questione importante. Così, studiando la fonte di cellule ossee e dei loro meccanismi di controllo nella rigenerazione e riparazione ossea fornisce un quadro nuovo per migliorare la rigenerazione scheletrico e inverse malattie perdita ossea.

È stato proposto l'esistenza di cellule mesenchimali multipotenti nel midollo osseo basata sull'identificazione delle popolazioni clonogeniche che potrebbero diversaIATE in osteogenico, lignaggi adipogenico e condrogeniche ex vivo ^4. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali scheletriche / mesenchimali (SSC / MSC) sono una fonte naturale di osteoblasti e sono fondamentali per il turnover osseo, ristrutturazione e riparazione di fratture ^5,6 . Inoltre, il nostro studio-lineage tracing rivelato che gli osteoblasti maturi hanno inaspettatamente breve emivita (~ 60 giorni) e sono continuamente alimentati dalla loro cellule staminali / progenitrici in entrambe le normali condizioni omeostatiche e riparazione di frattura ^6. Tuttavia, l'identità in vivo di cellule staminali e come tali cellule reagiscono a fratturarsi lesioni e la fornitura di cellule ossee sono chiari. Pertanto, è importante sviluppare un metodo che sia in grado di analizzare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle endogeni SSC / MSC in circostanze fisiologiche.

Riparazione della frattura è un processo multi-cellulare e dinamico regolato da una serie di complessicitochine e fattori di crescita ^7. L'approccio più comune per gli studi di frattura è quello di utilizzare un modello animale con frattura delle ossa lunghe e analizzare ossa sezionando osso e tecniche di immunofluorescenza ^8-10. Questo processo di riparazione può essere monitorato da più tecniche di imaging, tra cui micro-CT ^11, vicino infrarosso fluorescenza ^12, e chemiluminescenza immagini ^13. Tuttavia, ogni tecnica ha alcune limitazioni e non vi è stato alcun modo efficace per monitorare la funzione SSC / MSC a livello cellulare in vivo. Recentemente, confocale / due fotoni microscopia intravitale è stato sviluppato e utilizzato per rilevare le cellule tumorali trapiantate e cellule staminali ematopoietiche nel contesto del loro microambiente midollare anche a risoluzione unicellulare in animali vivi ^14. Combinando questa tecnologia con una serie di modelli di tracciamento lignaggio, siamo stati in grado di definire che le cellule staminali osteogenic / progenitrici possono essere geneticamente caratterizzati da ac transitoriativazione della resistenza myxovirus -1 (Mx1) promotore e progenitori MX1-indotta in grado di mantenere la maggior parte degli osteoblasti maturi nel tempo, ma non partecipare alla generazione dei condrociti nel topo adulto ^6. Inoltre, abbiamo dimostrato che OSPCs MX1-etichettati forniscono la maggior parte dei nuovi osteoblasti in guarigione della frattura ^6.

Qui, utilizzando modelli di monitoraggio osteo-lignaggio e la microscopia intravitale, un protocollo è prevista per definire la cinetica in vivo di ⁺ osteogenici cellule staminali / progenitrici MX1 nella riparazione della frattura. Questo protocollo offre immagini sequenziale per monitorare il trasferimento di osteogenici staminali / progenitori in siti di frattura e la misurazione quantitativa di espansione osteoprogenitrici nel processo di riparazione precoce. Questo approccio può essere utile in diversi contesti compresa la valutazione dei candidati terapeutici per migliorare la riparazione ossea.

Protocollo

1. Mouse e precondizionamento

Nota: Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni e tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital. Tutto l'intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito in condizioni sterili, usando materiale sterile autoclave. Mx1-Cre ^15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-pomodoro), sono stati acquistati da Jackson Laboratories. topi osteocalcina-GFP sono stati forniti dal Dr. Henry Kronenberg. Per l'analisi quantitativa delle migrazioni OSPC e la proliferazione in vivo, sono stati utilizzati Mx1-Cre ⁺ Rosa-YFP ⁺ (singolo colore-giornalista) topi. Per il monitoraggio più dettagliata del loro differenziazione in osteocalcina ⁺ maturare osteoblasti, abbiamo usato trigenic Mx1-Cre ⁺ Rosa-pomodoro ⁺ Ocn-GFP ⁺topi.

1. Per etichettare ⁺ cellule MX1 in vivo, preparare acido polyinosinic-policitidilico (PIPC, 2,5 mg / ml) in soluzione di PBS sterile e iniettare 200 microlitri per 20 g di Mx1-Cre del mouse ⁺ giornalista intraperitoneale una volta ogni due giorni per 10 giorni.
2. Per eliminare le cellule MX1 ⁺ ematopoietiche residenti, irradiare topi con una singola dose di 9,5 Gy. Dopo 24 ore di irradiazione, di trapianto di tipo selvatico cellule del midollo osseo (1x10 ⁶ cellule / mouse) per via endovenosa ^16. Nota: Poiché le cellule Mx1-inducibile includono cellule ematopoietiche e osteoclasti ematopoietiche-derivati, l'eliminazione delle cellule ematopoietiche MX1 ⁺ migliora la qualità delle immagini e la quantificazione di ⁺ cellule osteogeniche MX1.
3. Dopo il trapianto di midollo osseo, monitorare animali da quattro a sei settimane per ottenere un successo ripopolazione di cellule donatore di midollo.

2. Moutilizzare Preparazione

1. Anestetizzare topo mediante iniezione intraperitoneale di 50 ml di ketamina / xilazina (100 mg / kg, xilazina 12 mg / kg di peso corporeo) utilizzando una procedura IACUC approvato. Nota: durata dell'effetto può essere prorogato di un'ulteriore dose di ketamina / xylazina.
2. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dalla mancanza di risposte ai piedi e / o pizzichi di coda. (Facoltativo) Quando il mouse è anestetizzato, garantire una maschera a gas isoflurano sopra il naso con nastro adesivo. Regolare il livello di isoflurano per garantire l'animale è completamente sedato.
3. Agganciare il cuoio capelluto con un trimmer elettrico o piccole forbici. Rimuovere i frammenti di capelli e sterilizzare la pelle esposta con il 70% di alcol tampone. Applicare il gel lacrima per prevenire la disidratazione della cornea.

3. Microfracture Injury

1. Dopo aver verificato che l'animale è completamente sedato, effettuare una singola incisione a forma di L inverso per aprire la pelle del cuoio capelluto. Brevemente, fare una prima incisione trasversale (meno di 1 cm) starting da un orecchio all'altro orecchio. Girare ~ 60 ° e continuare a incidere verso il naso fino a ~ 2-3 mm di distanza dal naso. Nota: Questa incisione minimizza la formazione di tessuto cicatriziale sopra l'area da acquisire.
2. Separare i lembi cutanei tirando verso i lati con una pinza. Entrambe le ossa frontali e l'intersezione di suture sagittali e coronali dovrebbero essere chiaramente esposti.
3. Pulire la superficie aperta dal lavaggio con PBS sterile e pulitura gentile con garza sterile o tamponi di cotone fino a quando tutti i peli residui sono eliminati.
4. Per generare microfratture sulla volta cranica, tenere la testa mouse con una mano e un ago G 30 con un'altra mano. Fare un micro-foratura (~ 0,2 millimetri ferita con diametro
5. Passare a un ago più grande (20 o 25 G) e allargare il foro di puntura ruotando l'ago (~ diametro di 0,5 mm).
6. Ripetere passo 3,3-3,5 per generare seconda foratura dell'osso frontale controlaterale.
7. Pulire le macchie feriti per la caduta continua della PBS fino a quando l'emorragia si ferma.
   Nota: Bleeding su siti di frattura interferirà con immagini appropriate e indurre la formazione di cicatrici.
8. Applicare una goccia di soluzione salina fisiologica sterile o 2% Methocel sul cranio per evitare l'essiccamento. Nota: Non lasciare che la superficie del cranio asciugare, che consentirà di ridurre la nitidezza delle immagini. E 'importante utilizzare una quantità sufficiente di gel o soluzione salina per coprire l'area.

4. Imaging intravitale

1. (Facoltativo) Prima di imaging, alcuni topi sono iniettati con un colorante vascolare per visualizzare i vasi sanguigni. Iniettare retro-orbitale con 20 ml di Qtracker non mirati 705 (2 mM soluzione in 50 mM tampone borato) diluito in 80 ml di PBS. Utilizzare una siringa da insulina per minimizzare lo spreco di reagente. Se il segnale non è sufficientemente brillante, importi supplementari potrebbero essere necessarie.
2. Accendere lo scanner. Nota: A scanner laser a base poligonale, permette simultanea multi-canale di acquisizione di immagini a tasso video (30 fotogrammi al secondo). Scanning rate video è molto importante per l'imaging animale vivo.
3. Accendere il laser multi-fotone (femto-secondo titanio: zaffiro laser). Impostare la lunghezza d'onda di 880 nm e regolare la potenza per l'imaging seconda generazione armonica (440 nm) dell'osso. Per la GFP e tdTomato di eccitazione, accendere la 491 nm e 561 nm laser a stato solido.
4. Accendere il PMT (tubo fotomoltiplicatore) rivelatori per ogni segnale (un ± 20 nm filtro passa-banda 435 per la seconda generazione di armoniche, un ± 19 nm filtro passa-banda 528 per GFP, e 590 ± 20 per tdTomato.) (Opzionale) Utilizzare un 638 nm laser elio-neon e un PMT con un ± 27,5 nm filtro passa-banda 695 per rilevare Qtracker 705 segnale.
5. Placposta l'animale su un palco microscopio motorizzato XYZ-asse. Mantenere il mouse nella posizione più comoda con un rilievo di riscaldamento elettrico per aiutare a mantenere la temperatura corporea (questo riduce il rischio di perdita animale). Utilizzare nastro per tenere il mouse per minimizzare i movimenti durante l'imaging e mantenere l'area creata l'immagine più orizzontale possibile.
6. Applicare una goccia di caldo 2% gel di metilcellulosa o di soluzione salina fisiologica sul cranio per evitare l'essiccamento. Mettere un vetro di copertura sulla zona di imaging. Utilizzare una lente di ingrandimento basso (30x obiettivo di acqua-immersione con 0.9 NA) per la scansione del calvaria.
7. Utilizzando il controller XYZ-asse, trova la superficie di calvaria rilevando il segnale SHG da ossa e identificare una posizione limite fondamentale, come l'intersezione tra le suture sagittali e coronali suture. Acquisire un'immagine e registrare le coordinate XYZ.
8. Continuare a cercare la posizione della lesione osservando segnali SHG e fluorescenza.
9. Quando i siti di pregiudizio o della regione of interesse si trovano, acquisire un'immagine della migliore piano focale contenente segnali di fluorescenza SHG e dalle cellule di interesse. Coordina Salva XYZ e la distanza all'intersezione delle suture sagittali e coronali per definire la loro posizione precisa per i prossimi turni di imaging.
10. Per ritirare strutture 3D cellulari e ossa di lesioni frattura, registrare immagini di Z-stack (2-5 intervallo micron) con ~ 100 micron di profondità dalla superficie ossea endostale. Dopo il completamento della rappresentazione di un lato della lesione, ripetere processo di imaging per siti pregiudizio prossimi.

Procedure 5. POST

1. Dopo l'imaging, risciacquare sito di imaging con soluzione salina sterile per rimuovere il gel metilcellulosa dal cranio. Usando un tampone di cotone sterile, applicare una piccola quantità di tripla pomata antibiotica sulla superficie. Coprire i lembi cutanei e ri-chiudere il cuoio capelluto da sutura chirurgica. Questo può essere fatto con un filo di sutura ipoallergenico (polyglactin riassorbibile sutura) e 5-0 dimensioni ago di sutura. Attenzione: Buona tecnica di sutura minimizza la formazione di cicatrici.
2. Trattare tutti gli animali con iniezione IP di 0,05-0,1 mg / kg di buprenorfina ogni 12 ore per 48 ore dopo l'intervento. Tenere gli animali in una camera di recupero caldo fino a che riprendano conoscenza sufficiente. Dopo 3 a 5 giorni, riaprire la sutura e ripetere i passaggi di imaging intravitale per monitorare il cambiamento cellulare durante la guarigione della frattura.

Risultati

La lunga modello di frattura ossea stabilizzato è stato popolare negli studi di frattura. Tuttavia, ossa lunghe o grandi modelli frattura causare danni ai tessuti aerei e quindi hanno una limitazione nella misurazione quantitativa della funzione delle cellule dell'osso. Abbiamo sviluppato un pregiudizio minimamente invasiva (meno di 1 mm di diametro con minima o nessuna invasione nella dura madre) su ossa frontali cranica con perforazione dell'ago (Figure 1A-1C). Abbiamo scelto una vista dall'alto delle...

Discussione

La regolazione delle cellule staminali scheletriche può essere di grande importanza per definire i metodi migliori per raggiungere la rigenerazione ossea. Imaging quantitativo e sequenziale a livello cellulare è stato tecnicamente difficile. Sebbene il modello frattura delle ossa lunghe topo è stato ampiamente utilizzato e adatto per studi biomeccanici ^17, la sua posizione tessuti profondi, dimensione frattura irregolare, danni ai tessuti molli, e l'applicazione di fissatori stabilizzanti hanno limitato s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL / 6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664 Iniezione di
ketamina cloridrato	Bionichepharma	67457-001-10	Dimensione del flaconcino: 10 ml (50 mg/ml)
Soluzione sterile di xilazina	Lloyd Inc.	NADA# 139-236
Buprenorfina Hl	BEDFORD LAB	NDC 55390-100-10	Fiale: 0,3 mg/ml, Dosi: 0,05-0,1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
Tamponi per la preparazione dell'alcol (70% alcol isopropilico)	Kendall WEBCOL	5110
Forbice chirurgica fine	FST	14568-09
Pinze extra fini	FST	11150-10
VICRYL*Plus Suture	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 punto quantico non mirato	Invitrogen	Q21061
Methocel 2%	OmmiVision
pIpC (Acido poliinosinico-policitidilico)	Sigma	P0913-50MG	100 μ l (2,5 mg/ml in PBS) per 10 g di mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers	Spectra Physics Dual
Calypso 491 + 532 nm DPSS laser	Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser	Coherent