Articolo metodologico

Sequenziale In vivo Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

DOI:

10.3791/51289

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23 maggio 2014

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1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Stem Cell Institute, 2Wellman Center for Photomedicine and Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

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La misurazione quantitativa della funzione progenitrici del midollo in guarigione della frattura richiede una tecnologia di imaging seriale ad alta risoluzione. Qui, sono ottenute utilizzando protocolli per microscopia intravitale e inseguimento osteo-lineage sequenzialmente immagine e quantificare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali endogene osteogenico / progenitrici nel processo di riparazione di fratture ossee.

Abstract

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Bone gira continuamente ed è altamente rigenerante seguendo lesioni. Cellule staminali / progenitrici osteogenici sono stati a lungo ipotizzato di esistere, ma in vivo dimostrazione di tali cellule è stato solo di recente raggiunto. Qui, sono forniti vivo tecniche di imaging ad investigare il ruolo delle cellule staminali / progenitrici osteogenici endogeni (OSPCs) e la loro progenie in riparazione ossea. Utilizzando cellule osteo-lineage tracing modelli e immagini intravitale di microfratture indotte in osso cranica, OSPCs può essere direttamente osservato durante i primi giorni dopo la lesione, in cui si verificano eventi critici nel processo di riparazione precoce. Siti di lesione può essere ripreso in sequenza rivelando che OSPCs trasferirsi al pregiudizio, aumentare in numero e differenziarsi in osteoblasti che formano l'osso. Questi metodi offrono un mezzo per indagare il ruolo dei regolatori molecolari delle cellule staminali-intrinseci ed estrinseci per la rigenerazione e la riparazione ossea.

Introduzione

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Malattie degenerative delle ossa e perdita di massa ossea correlata all'età portando ad un elevato rischio di fratture osteoporotiche è diventata una sfida importante nella salute pubblica 1. Manutenzione Bone è controllato da osteoblasti che formano l'osso e osteoclasti osso-riassorbimento. Difetti di cellule che formano l'osso sono una causa principale di perdita di massa ossea legata all'età e le malattie degenerative delle ossa 2,3. Mentre la vasta ricerca si è concentrata sul miglioramento della guarigione della frattura, la scoperta di farmaci affidabili per curare le malattie degenerative delle ossa e per invertire la debo....

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Protocollo

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1. Mouse e precondizionamento

Nota: Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni e tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital. Tutto l'intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito in condizioni sterili, usando materiale sterile autoclave. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-pomodoro), sono stati acquistati da Jackson Laboratories. topi osteocalcina-GFP sono stati forniti dal Dr. Henry Kronenberg. Per l'analisi....

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Risultati

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La lunga modello di frattura ossea stabilizzato è stato popolare negli studi di frattura. Tuttavia, ossa lunghe o grandi modelli frattura causare danni ai tessuti aerei e quindi hanno una limitazione nella misurazione quantitativa della funzione delle cellule dell'osso. Abbiamo sviluppato un pregiudizio minimamente invasiva (meno di 1 mm di diametro con minima o nessuna invasione nella dura madre) su ossa frontali cranica con perforazione dell'ago (Figure 1A-1C). Abbiamo scelto una vista dall'alto delle.......

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Discussione

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La regolazione delle cellule staminali scheletriche può essere di grande importanza per definire i metodi migliori per raggiungere la rigenerazione ossea. Imaging quantitativo e sequenziale a livello cellulare è stato tecnicamente difficile. Sebbene il modello frattura delle ossa lunghe topo è stato ampiamente utilizzato e adatto per studi biomeccanici 17, la sua posizione tessuti profondi, dimensione frattura irregolare, danni ai tessuti molli, e l'applicazione di fissatori stabilizzanti hanno limitato s.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Ringraziamo C. Park per la lettura del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIAMS sotto Award numero K01AR061434 e Leukemia & Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) per DP e le sovvenzioni dei National Institutes of Health a CPL e DTS Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente l'opinione ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
C57BL / 6J (H-2b)Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)000664 Iniezione di
ketamina cloridratoBionichepharma67457-001-10 Dimensione del flaconcino: 10 ml (50 mg/ml)
Soluzione sterile di xilazinaLloyd Inc.NADA# 139-236
Buprenorfina HlBEDFORD LABNDC 55390-100-10Fiale: 0,3 mg/ml, Dosi: 0,05-0,1 mg/kg
DPBS, 1XCORNING cellgro21-031-CV
Tamponi per la preparazione dell'alcol (70% alcol isopropilico)Kendall WEBCOL5110
Forbice chirurgica fineFST14568-09
Pinze extra finiFST11150-10
VICRYL*Plus SutureEthiconVCP490G
Qtracker 705 punto quantico non miratoInvitrogenQ21061
Methocel 2%OmmiVision
pIpC (Acido poliinosinico-policitidilico)   SigmaP0913-50MG100 μ l (2,5 mg/ml in PBS) per 10 g di mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast LasersSpectra Physics Dual
Calypso 491 + 532 nm DPSS laserCobolt AB
Radius-635 HeNe laserCoherent

Riferimenti

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  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L.

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