Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine ​​per Nerve Tissue Regeneration

Summary

Sviluppo di proteine ​​di fusione biotinylatable ha molte potenziali applicazioni in diversi campi di ricerca. Ingegneria proteina ricombinante è una procedura dritto in avanti che è costo-efficace, che fornisce alte rese di proteine ​​personalizzati.

Abstract

Ingegneria proteica ricombinante ha utilizzato Escherichia coli (E. coli) sistemi di espressione per quasi 4 decenni, e oggi E. coli è ancora dell'organismo ospite più utilizzato. La flessibilità del sistema consente l'aggiunta di frazioni come per esempio un tag biotina (per interazioni streptavidina) e proteine ​​funzionali più grandi come proteina fluorescente verde o ciliegio proteina rosso. Inoltre, l'integrazione di amminoacidi innaturali come chelanti di ioni metallici, gruppi funzionali reattivi univoco, sonde spettroscopiche, e molecole che impartiscono modificazioni post-traduzionali ha permesso una migliore manipolazione delle proprietà proteiche e funzionalità. Di conseguenza questa tecnica crea proteine ​​di fusione personalizzabili che offrono utilità significativa per vari campi di ricerca. Più specificamente, la sequenza proteica biotinylatable è stato incorporato in molte proteine ​​bersaglio a causa della elevata interazione affinità tra biotina con avidina e streptavidina. Questa aggiunta ha aiutato a migliorare la rilevazione e purificazione di proteine ​​nella categoria oltre ad aprire la strada ad applicazioni secondarie, come l'ordinamento delle cellule. Così, molecole di biotina marcata mostrano una crescente influenza e diffusa nei campi bioindustriale e biomedica. Ai fini della nostra ricerca abbiamo ingegnerizzato proteine ​​di fusione biotinilato ricombinanti contenenti il ​​fattore di crescita nervoso (NGF) e semaphorin3A (Sema3A) regioni funzionali. Abbiamo precedentemente riportato come queste proteine ​​di fusione biotinilato, insieme ad altre sequenze proteiche attive, possono essere legati a biomateriali per l'ingegneria tissutale e scopi rigenerativi. Questo protocollo delinea le basi delle proteine ​​ingegneria biotinylatable alla scala milligrammo, utilizzando un T7 lac inducibile vettoriale e E. padroni di espressione coli, a partire da trasformazione di scale-up e di purificazione.

Introduction

Proteine ​​coprono una vasta gamma di biomolecole che sono responsabili di molte funzioni biologiche, portando in definitiva a formazione di tessuto corretto e organizzazione. Queste molecole iniziano migliaia di vie di segnalazione che controllano up-regulation e / o down-regolazione dei geni e delle altre proteine, mantenendo l'equilibrio all'interno del corpo umano. Rottura di una singola proteina colpisce tutta questa rete di segnali, che può portare alla comparsa di disturbi o malattie devastanti. Ingegneria singole proteine ​​in laboratorio offre una soluzione per la lotta contro questi effetti collaterali e offre un'alternativa ai farmaci a piccole....

Protocol

1. Progettazione di proteina bersaglio

1. Utilizzo del Centro Nazionale per il sito web Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ottenere una sequenza ammino per la proteina bersaglio, tenendo conto delle specie di interesse e le eventuali varianti di splicing. Selezionare la sequenza amminoacidica corrispondente alla zona attiva di interesse della proteina.
   Nota: Per Sema3A, aminoacidi 21-747 sono stati scelti. Una proteina di fusione è stato progettato con NGF in cui la sequenza di barstar, aminoacidi 1-90, è stato aggiunto al NGF aminoacidi 122-241.
2. Per l'N-terminale aggiungono le sequenze seguenti: 6X-....

Results

Cloning and Test Expression

Quando placcatura viene eseguita correttamente, singole colonie isolate dovrebbero costituire per aumentare le possibilità di spennare clonale trasformati batteri cellule (Figura 2A). Tuttavia, se troppe cellule vengono piastrate, piastre vengono incubate troppo tempo a 37 ° C o trasformazione è discutibile, le colonie possono coprire la piastra di agar o formare grandi aggregati di cellule (figure 2b e 2c.......

Discussion

Ingegneria proteina ricombinante è una tecnica molto potente che abbraccia molte discipline. Si è costo-efficace, regolabile e una procedura relativamente semplice, consentendo la produzione di alte rese di proteine ​​personalizzati. È importante notare che la progettazione ed esprimere proteine ​​bersaglio non è sempre semplice. Espressione basale e la stabilità della proteina ricombinante dipendono da specifiche scelte di vettore, E. coli cellulari, peptide tag aggiunte e parametri colturali. Il nostro criter.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Ditio-DL-treitolo, DTT, 99,5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Idrossietilmercaptano β-Mercaptoetanolo	Chem-Impex International	642	250 ml
Acido acetico, glaciale	EMD	AX0073-9	2,5 L
Agar		Bioshop AGR001.500	500 g
Ampicillina sale sodico	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antischiuma 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µ g
BL21(DE3) Cellule Competenti	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
reagente Bradford	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel di filtrazione standard	Bio-Rad	151-1901	6 fiale
Glicerolo	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidina idrodioride amioformamidina cloridrato	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resina	Thermo Scientific	88222	100 ml
Acido cloridrico	EMD	HX0603-3	2,5 L
Imidazolo	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
tampone campione Laemmli	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sale sodico, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Brodo	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Host di clonazione
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	confezione da 10
Cloruro di potassio	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µ g
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Idrossido di sodio	Fisher	Scientific S318-500	500 g
Fosfato di sodio diabasico	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Fosfato di sodio monobasico	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Brodo	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetraciclina cloridrato	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Triptone, pancreatico	EMD	1.07213.1000	1 kg
Estratto di lievito, EMD granulato		1.03753.0500	500 g
Ä KTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Include kit e accessori
Agitatore orbitale da banco	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	L'enzima viene fornito con tamponi di reazione e soluzione di biotina
Cassetta per dialisi	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Tubo per	dialisiSpectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: valvola di deviazione del flusso da 25.000 e 50.000
FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Kit di analisi per la quantificazione della biotina	Invitrogen	1094598
Frac-950 Rack per provette, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Collettore di frazioni Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Include kit e accessori
Termostato/Termostato/Refrigerato	VWR	13271-102	Modello 1156D
Forno di riscaldamento Serie FD	Legante		Modello FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Fuori produzione - Prodotto di ricambio: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuga	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotore	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotore	Beckman Coulter	969329	Include bottiglie di poliporpilene da 1 litro
JS 5.3 Rotore	Beckman Coulter	368690
Cappa a flusso laminare	Themo Scientific	1849 Forma 1800	Series Clean
Bench Lettore di micropiastre	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4 gel verticale sistema di elettroforesi
Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricati	Bio-Rad	456-9036	Qualsiasi kDa, pettine a 15 pozzetti
Ni-NTA Colonna	Bio-Rad	737-2512	49 ml  volume ECONO-Column
Plasmidi Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Alimentatore	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Tubi in polipropilene copolimero a fondo tondo	VWR	3119-0050	50 ml  tubi per rotore JA 25.50
Concentratori Spin-X UF	Corning	431488, 431483	20 e 6 ml; MWCO: 10.000 Da
Servizio di subclonaggio	GenScript USA Inc.		per servizi proteici
	Cole-Parmer	18910445A Modello	CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Modello G560