Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Summary

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una superfamiglia di peptidomimetici che includono ma non sono limitate a peptidi, peptoids e peptidi N-metilato. Qui si descrive un metodo sintetico che combina split-e-pool e le strategie sub-monomeri per sintetizzare un one-tallone biblioteca un composto di PTA.

Abstract

Peptidomimetici sono grandi fonti di leganti proteici. La natura oligomerica di questi composti in grado di accedere a grandi librerie sintetiche su fase solida utilizzando la chimica combinatoriale. Una delle classi più ben studiati di peptidomimetici è peptoids. Peptoids sono facili da sintetizzare e hanno dimostrato di essere resistente alla proteolisi e cellula-permeabile. Negli ultimi dieci anni, molte leganti proteici utili sono stati identificati attraverso lo screening di librerie peptoid. Tuttavia, la maggior parte dei ligandi identificati dalle biblioteche peptoid non vengono visualizzati alta affinità, con rare eccezioni. Ciò può essere dovuto, in parte, alla mancanza di centri chirali e vincoli conformazionali nelle molecole peptoid. Recentemente, abbiamo descritto una nuova via sintetica per accedere peptidi ammidi terziarie (PTA). PTA sono una superfamiglia di peptidomimetici che includono ma non sono limitate a, peptidi peptoids e peptidi N-metilati. Con catene laterali su entrambi α-carbonio e atomi di azoto catena principale,la conformazione di queste molecole sono notevolmente limitata dalla impedimento sterico e allilico 1,3 ceppo. (Figura 1) Il nostro studio suggerisce che queste molecole PTA sono altamente strutturate in soluzione e possono essere utilizzati per identificare ligandi proteici. Crediamo che queste molecole possono essere una futura fonte di ligandi ad alta affinità della proteina. Qui si descrive il metodo di sintesi che unisce la potenza di entrambi split-e-pool e le strategie sub-monomeri per sintetizzare un campione unico tallone di un composto (OBOC) biblioteca di PTA.

Introduction

Peptidomimetici sono composti che imitano la struttura di peptidi naturali. Essi sono progettati per mantenere la bioattività mentre superare alcuni dei problemi associati con peptidi naturali, tra cui la permeabilità cellulare e stabilità contro proteolisi ^1-3. A causa della natura oligomerica di questi composti, grandi librerie sintetiche possono essere facilmente accessibili attraverso vie sintetiche monomeriche o sub-monomerici ^4-7. Una delle classi più studiati di peptidomimetici è peptoids. Peptoids sono oligomeri di glicine N-alchilati, che possono essere sintetizzati facilmente usando una strategia sub-monomero ^{8, 9.} Molti ligandi di proteine ​​utili sono stati identificati con successo da screening di librerie di grandi dimensioni peptoid sintetico contro bersagli proteici ^{1, 10-14.} Tuttavia, "hits" individuati dalle biblioteche peptoid raramente archivio un'elevata affinità verso gli obiettivi della proteina ^1,10-14,22. One major differenza tra peptoids e peptidi naturali è che la maggior parte dei peptoids generalmente non hanno la capacità di formare strutture secondarie a causa della mancanza di centri chirali e vincoli conformazionali. Per risolvere questo problema, strategie multiple sono state sviluppate negli ultimi dieci anni, in gran parte incentrata sulla modifica delle catene laterali presenti sulle principali atomi di azoto catena ^15-22. Recentemente, abbiamo sviluppato una nuova via sintetica per introdurre catene laterali di aminoacidi naturali su una dorsale peptoid per creare peptidi ammidi terziarie ^23.

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una famiglia di super-peptidomimetici che includono ma non sono limitate a peptidi (R ₂ = H), peptoids (R ₁ = H) e peptidi N-metilato (R ₁ ≠ H, R ₂ = Me) . (Vedi figura 1) La via sintetica impiega aminoacidi naturali come fonte di chiralità e catene laterali sul45;-carbonio, e ammine primarie disponibili in commercio per fornire N-sostituzioni. Pertanto, uno spazio chimico più grande di quello di peptidi semplici, peptoids o peptidi N-metilato può essere esplorato. Spettri di dicroismo circolare hanno dimostrato che le molecole del PTA sono altamente strutturati in soluzione. Caratterizzazione di uno dei complessi PTA-proteina mostra chiaramente che i vincoli conformazionali di PTA sono richiesti per il legame. Recentemente, abbiamo anche scoperto che alcune delle molecole PTA possiedono una migliore permeabilità cellulare rispetto ai loro omologhi peptoid e peptidi. Noi crediamo che queste librerie PTA possono essere una buona fonte di ligandi ad alta affinità per le proteine ​​target. In questo articolo, discuteremo la sintesi di un campione unico tallone di un composto (OBOC) biblioteca PTA in dettaglio insieme ad alcune condizioni migliori per l'accoppiamento e la scissione di questi composti.

Protocol

1. Nozioni di base di Split-e-pool sintesi

Al fine di generare in modo efficiente un gran numero di composti in fase solida, sintesi split-e-pool è spesso impiegato come strategia generale. Come mostrato in Figura 4, tentagel perle sono prima divisa in tre porzioni. Ciascuna porzione viene fatto reagire con un reagente diverso, generando il primo residuo su perline. Dopo la prima reazione, tutte e tre le porzioni sono raggruppate, mescolati, e poi nuovamente suddivise in tre porzioni. Ciascuna porzione verrà nuovamente reagire con un reagente diverso, generando il secondo residuo su perline. Dopo due passi split-and-piscina, vengono generati nove composti.

In sintesi sub-monomero, perle vengono dapprima suddivise in diverse porzioni di reagire con differenti acidi bromo in presenza del reagente di accoppiamento. Dopo il lavaggio con il solvente, tutte le sfere verranno raggruppate e misti, poi di nuovo diviso in più porzioni di reagire con diversiammine primarie. Dopo amminazione, tutte le perle vengono raggruppate e lavate accuratamente, completando un monomero completo su ciascuna sfera. Questo processo può essere ripetuto fino al raggiungimento diversità desideri.

2. Preparazione di acido Bromuro da parte della Natural Aminoacidi

In sintesi sub-monomero, la sintesi di ogni monomero è diviso in due fasi distinte:. 1 accoppiamento di bromuro e acido 2 amminazione con ammine primarie (Figura 2).. Per sintetizzare un peptide ammide terziaria, bromuri acidi chirali con catene laterali sul carbonio alfa saranno preparate da amminoacidi naturali. Qui si descrive il metodo di trasformazione di un amminoacido naturale nel corrispondente acido bromuro con alta fedeltà stereo. Usiamo alanina come esempio; altri aminoacidi inclusi serina, treonina, acido aspartico, acido glutammico, asparagina, glutammina, glicina, valina, isoleucina, fenilalanina possono anche essere trasformati in acidi bromo sotto conditio similens. Si noti che alcuni degli amminoacidi con gruppi funzionali come fenolo, guanidina e ammina devono essere protetti prima della trasformazione. La configurazione di reazione è mostrato in Figura 3.

Precauzioni di sicurezza: Per occorrono le seguenti reazioni che coinvolgono HBr, NaNO ₂ e di altri prodotti chimici corrosivi e / o tossici, adeguati dispositivi di sicurezza come occhiali protettivi, camice da laboratorio e guanti resistenti alle sostanze chimiche. Tutte le reazioni devono essere eseguite sotto cappa dal chimico esperto.

1. Aggiungere 370 ml di acqua in 630 ml di soluzione di HBr 48% per preparare un 1 L, soluzione HBr 30%. Aggiungere 500 ml di glicole etilenico in un contenitore bagno 1 L; aggiungere ghiaccio secco per mantenere la temperatura a -10 ° C. Attenzione: soluzione di HBr 48% è fortemente acido e corrosivo, maneggiare con cura. Leggere la scheda di sicurezza prima dell'uso.
2. Aggiungere D-alanina (8,9 g, 0,1 mol) e KBr (11,9 g, 0,1 mol) per un ml a tre colli pallone a fondo tondo 250 con un bastoncino magnetico. Aggiungere 100 ml, e il HBr 30% preparato in tegli passaggio precedente. Mettere il pallone nel bagno glicole etilenico preparato al punto 2.1 e mantenere la temperatura a -10 ° C. Bubble argon attraverso un lungo ago dal fondo del pallone per 10 minuti, come mostrato in Figura 3. Agitare la soluzione con l'ancoretta magnetica a 300 rpm.
3. Sciogliere NaNO ₂ (8,28 g, 0,12 mol) in un becher da 100 ml con 20 ml di acqua. Aggiungere la soluzione nel imbuto gocciolatore con compensatore di pressione e sigillare l'imbuto gocciolatore con un setto. Lentamente accendere la valvola l'imbuto a rubinetto e lasciare che la soluzione NaNO ₂ goccia nel pallone. Controllare la valvola per regolare il tasso di gocciolamento per circa 2 gocce al sec. Mantenere l'agitazione a 300 rpm e mantenere il gorgogliare argon dal fondo del pallone. Il pallone deve essere tenuto in etilene glicole bagno a -10 ° C fino a quando viene aggiunto tutto NaNO _2. Attenzione: questo passaggio genera calore e gas durante l'aggiunta di nano ₂ soluzione. Tasso di gocciolamento deve essere attentamente conlata e l'intero sistema dovrebbe essere aperto attraverso l'uscita argon.
4. Continuate a mescolare per ulteriori 3 ore e lasciare che la temperatura scaldare da -10 ° C a temperatura ambiente. La soluzione risultante deve essere chiaro a giallo chiaro; se il colore è troppo scuro, applicare il vuoto per rimuovere gli ossidi di azoto in eccesso e possibile Br ₂ generato durante la reazione.
5. Estrarre il prodotto dalla soluzione con 3x 35 ml di etere etilico usando un imbuto estrazione. Unire la fase organica e lavarlo con salamoia satura. La fase organica può essere lavato con una piccola quantità di _NaHCO3 prima del lavaggio con soluzione salina per rimuovere il colore se è buio. Essiccare la fase organica su Na ₂ SO ₄ per 6 ore.
6. Filtrare il Na ₂ SO ₄ e si evapora il solvente sotto vuoto, prodotto grezzo deve ottenersi chiaro olio giallo pallido. Prodotto grezzo può essere ulteriormente purificato per distillazione a 115 ° C, 3 mm Hg, o dacolonna di silice con 3:1 esano: acetato di etile.
7. Prodotto puro è ottenuto come olio limpido, 6,6 g (resa 74%), densità = 1,69 g / ml, [α] D20 = +24 ° (metanolo), ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃₎ δ 4.41 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H). Nel caso di (S)-2-bromopropanoic acido _d-4 (d preparato da _{4-L-alanina),} prodotto puro è ottenuto come olio limpido, resa 78%, densità = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (metanolo). ¹ H NMR, nessun segnale significativo H viene osservata. ESI-MS ^- [M-1] ^- = 155,1 (previsto 154,97). Per (S)-4-metilpentanoico-2-bromo acido (preparato da L-leucina utilizzando la stessa procedura) prodotto puro viene ottenuto come olio limpido, resa 89%, [α] D20 = +37 ° (metanolo), ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃₎ δ 4.30 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10.8, 3.9 Hz, 2H), 1.81 (tt, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 0.96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). Nel caso di (S)-2-bromo-3-pheacido nylpropanoic (preparato da L-fenilalanina utilizzando la stessa procedura) prodotto puro viene ottenuto come olio giallo pallido, resa 72%, [α] D20 = +17 ° (metanolo), ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃₎ δ 7.38 - 7.19 (m, 5H), 4.42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3.47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H).

3. Etichettatura isotopica di alanina transaminasi Utilizzo

In sintesi biblioteca combinatoria, in particolare nella sintesi split-e-pool di un composto biblioteche (OBOC) un tallone, la quantità di composto che può essere ottenuto da ciascun tallone è relativamente piccola. (In genere 1 pmol a 10 nmol). Inoltre, la spettrometria di massa è ampiamente usato per l'identificazione e la caratterizzazione del composto finale grazie alla sua elevata sensibilità. Per poter utilizzare spettrometria di massa per determinare la stereochimica assoluta presso i centri chirali dei prodotti finali PTA, enantiomeri acido bromo dovrebbero essere isotopically etichettati prima dell'uso. Qui si descrive il metodo di utilizzo di transaminasi e D ₂ O all'etichetta L-alanina.

1. Sciogliere L-alanina (300 mg, 3,36 mmol) con 10 ml di D ₂ O in un tubo in polietilene 50 ml. Aggiungere α-chetoglutarato (10 mg, 0,068 mmol) come co-substrato. Riscaldare il tubo a 37 ° C e regolare la pD a 8,5-8,7 usando un soution 1 M INCD. Nota: PD è determinata dalla strisce reattive pH. Tradizionale electro pH-metro equipaggiato con elettrodo di vetro selettivo per H ⁺ può dare errata lettura per D ^+.
2. Aggiungi alanina transaminasi (0,1 mg, EC 2.6.1.2 dal cuore di maiale, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) al PD 8,5-8,7, 37 ° C la soluzione preparata dal passo precedente. Mettere il tubo a 37 ° C incubatore e incubare durante la notte con lieve agitazione, da 10 a 30 rpm è preferito.
3. Dopo incubazione durante la notte, prendere 0,5 ml di soluzione D ₂ O e verificare lo stato di avanzamento di reazione da ¹ H-NMR. Tutti i segnali di un protonelanine, δ 3.76 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 1.46 (d, J = 7.3 Hz, 3H), ¹ H NMR 400 MHz, dovrebbe essere notevolmente soppressa a causa di deuterazione. Più del 98% del protone deve essere invertita deuterio come descritto in precedenza ^23. Nota: D ₂ O può essere parzialmente recuperato per distillazione se la reazione viene eseguita su larga scala (> 200 ml D ₂ O). Normalmente, il 60% al 80% di D ₂ O può essere distillato dalla soluzione.
4. Congelare la soluzione sopra con azoto liquido e liofilizzare usando un liofilizzatore avere polvere L-alanina deuterato bianco.

4. Sintesi di peptoid Linker Regione

La regione linker non è necessaria per la sintesi biblioteca PTA. Tuttavia, al fine di evitare l'alto sfondo nel rapporto inferiore peso molecolare (100-600) di spettroscopia di massa MALDI e per migliorare la ionizzazione dei composti, viene spesso usato un linker peptoid con più residui polari. Questo peptoid linker può essere sintetizzato attraverso la procedura di sintesi peptoid standard. Qui si sintetizzare un pentamero di N-metossietile glicina come linker (come mostrato in Figura 5).

1. Swell 90 micron Tentagel perle con linker RAM (1 g, 0,27 mmol / g) in 10 ml di DMF per 3 ore in un reattore siringa da 12 ml con lieve agitazione.
2. Scaricare l'DMF dal reattore e aggiungere 10 ml 20% di soluzione di piperidina DMF per deproteggere il gruppo Fmoc dal linker Rink amide. Agitare le perline con soluzione di piperidina 20% per 30 min. Lavare con DMF 5x per rimuovere tutti piperidina.
3. Prendete un paio di perle fuori dalla siringa e testarlo con il test cloranile. Beads devono girare marrone scuro (test cloranile positivo per ammina primaria) se Fmoc viene deprotetto con successo.
4. Preparare le seguenti soluzioni: 1., 20 ml di soluzione di acido 2 M / DMF bromoacetico; 2 20 ml, soluzione 2 M DIC / DMF.; 3. Da 10 ml, 1 M methoxylethylamine soluzione / DMF.
5. Aggiungere 5 ml di soluzione 2 M di acido bromoacetico / DMF perle perline, agitare delicatamente. Aggiungere quindi 5 ml di soluzione 2 M DIC / DMF ai talloni; sigillare la siringa con lo stantuffo e metterlo sul shaker. Agitare per 10 min.
6. Lavare le perline con DMF accuratamente. Aggiungere 2 ml di soluzione 1 M methoxyethylamine / DMF preparati dal punto 4.4 ai talloni. Sigillare la siringa con lo stantuffo e agitare l'agitatore per 30 min.
7. Lavare le perline con DMF 5x. Controlla un paio di perle con la prova cloranile, se positivi (perline diventano blu), quindi continuare con il passaggio successivo. In caso contrario, ripetere il punto 4.6.
8. Ripetere i passaggi 4,5-4,7, 4x per completare la pentamero.

. 5 Split-e-pool Sintesi di PTA Biblioteca con (R) - e (S)-2-bromopropionico Acidi

Qui si descrive la sintesi di una piccola biblioteca PTA con una diversità teorica di 9.261 composti utilizzando la 1 g di perle dal punto 4.8. Si noti che un tentagel tallone 90 micron contiene circa 2,9 milioni di perline per grammo; quindi la ridondanza dila biblioteca sarà di 2,9 x 10 ^6/9261 = 312 copie. Useremo acido bromoacetico, (R)-2-bromopropanoic e isotopica etichettati (S)-2-bromopropanoic acid-d ₄ come gli acidi, e 7 diverse ammine (A1 ~ A7, vedi Figura 5 per dettagli) per amminazione. Reattori siringa e un collettore a vuoto saranno utilizzati per eseguire la sintesi.

1. Aggiungere 10 ml di 01:01 DCM: DMF alla siringa dal punto 4.8; usare una pipetta 1000 ml con un puntale troncato a dividere tutti i 1 g perline equamente in tre reattori siringa da 5 ml. Etichettarli come B (acido bromoacetico), R ((R)-2-bromopropanoic) e S ((S)-2-bromopropanoic acido _d-4). Lavare tutte le 3 siringhe con DCM 3x, e lavare siringhe etichettati con R e S con THF anidro 3x, lavare la siringa marcato con B con DMF 3x.
2. Siringa R e S. Accoppiamento BTC di acido bromopropanoic.
   1. Preparare una soluzione BTC / THF fresca. Aggiungere unpproximately 200 mg di BTC nel flaconcino in una cappa aspirante, sigillare con il tappo. Pesare la quantità di BTC nel flacone. Calcolare la quantità di solvente necessaria e aggiungere THF anidro nella fiala per fare un / ml soluzione BTC / THF 20 mg.
   2. Preparare la / miscela di BTC acidi bromo. Aggiungere (R)-2-acido bromopropanoic (89 ml, 0,95 mmoli) e (S)-2-bromopropanoic acido _d-4 (89 microlitri, 0,95 mmol) in due piccole fiale separatamente. Per ogni flacone, aggiungere 5 ml di soluzione di 20 mg / ml BTC / THF sopra. Sigillare i due fiale e metterli in freezer a -20 ° C per 20 min.
   3. Aggiungere 1,125 ml, 02:01 THF / DIPEA (750 ml THF, 375 microlitri DIPEA, 2.2 mmol) per siringa R e S separatamente. Mescolare le perline con la punta della pipetta. Lasciate riposare per 5 minuti.
   4. Prendere i due raffreddata acidi bromo / miscele BTC dal punto 5.2.2, aggiungere 2,4,6-Trimethylpyridine (356 ml, 2.7 mmol) per ciascuna flaconcini. Precipitati bianchi formeranno immediatamente. Applicare direttamente la sospensione corrispondenteper le perline basificata (siringa R e S nel passaggio 5.2.3) il più presto possibile e poi metterli su un agitatore per scuotere sotto 120 rpm per 2 ore.
      Nota: La soluzione nei reattori siringa dovrebbe essere una sospensione giallastra pallida durante tutto il corso della reazione. Un colore più scuro è indice di eccessivo calore rilasciato durante l'aggiunta iniziale della soluzione di cloruro acido. Questo può essere risolto da un ulteriore raffreddamento o diluire l'/ miscela di BTC acidi bromo.
3. Siringa B. Accoppiamento acido bromoacetico con DIC
   1. Preparare un fresco 20 ml, soluzione 2 M di acido bromoacetico / DMF. Preparare un 20 ml, soluzione 2 M DIC / DMF.
   2. Aggiungere 2 ml di soluzione di acido 2 M / DMF bromoacetico a siringa B, agitare delicatamente. Aggiungere 2 ml di soluzione 2 M DIC / DMF a siringa B, agitare delicatamente.
   3. Mettere la siringa B sullo stesso shaker come siringa R e S , Agitare per 2 ore. Si noti che la reazione di accoppiamento di acido bromoacetico / DIC avviene entro 30 min; tempo di reazione prolungato è per la comodità di sintesi split-e-pool.
4. Dopo 2 ore, prendere la siringa R, S e B da shaker. Lavare accuratamente tutte le tre siringhe con DCM 5x. Lavare quindi con DMF 5x. Si noti che la siringa R e S non possono essere lavati con DMF prima di essere lavato con DCM o THF prima.
5. Pool tutte le perline di siringhe R, S e B in un reattore siringa da 12 ml. Lavare tutte le perline con DMF 5x.
6. Aggiungere 10 ml di 01:01 DCM: DMF alla siringa; usare una pipetta 1000 ml con un puntale troncato di dividere tutte le perline in modo uniforme in 7 singoli 2 ml siringhe, etichettarli come A1-A7.
7. Amminazione. Preparare 10 ml, 2 M primari soluzioni ammina / DMF per ognuno dei 7 ammine elencate nella Figura 5. Aggiungere 5 ml di each ammina alla siringa corrispondente A1-A7. Incubare tutti i 7 siringhe in un incubatore a 60 ° C con agitazione durante la notte.
8. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente tutte le perline con DMF. Prendete un paio di perle da ogni siringa e verificare con il test cloranile. Se i grani diventano di colore verde (positivo) entro 3 minuti, procedere con il passaggio successivo. In caso negativo, ripetere il punto 5.7 per le siringhe negativi.
9. Ripetere i passaggi 5,1-5,8 2x per completare il trimero. Passaggio facoltativo: dopo ogni ciclo, si consiglia di controllare la qualità di sintesi mediante spettroscopia di massa come descritto di seguito. Tutti i 9.261 composti sono ora sintetizzati in perline tentagel come biblioteca OBOC.
10. Massa spettroscopica conferma di PTA.
    PTA sono oligomeri altamente strutturati e possiedono molte caratteristiche comuni dei peptidi N-metilato. Uno dei problemi comuni di sintesi in fase solida dei peptidi N-metilato è la degradazione dell'acido durante TFA scissione. Per sopprimere degradazione dell'acido, scissione di molecole come ciclosporina dasupporto solido è spesso effettuato a bassa temperatura. Abbiamo confrontato diverse condizioni nell'incisione per scindere molecole diverse PTA dal supporto solido. Abbiamo scoperto che, in generale, a bassa temperatura e concentrazione TFA ridotta potrebbero effettivamente sopprimere la degradazione acida e fornire composti puri.
    1. Preparare 10 ml di soluzione 1:01 TFA / DCM in una provetta da 15 ml. Sigillare il tubo e metterlo in freezer a -20 ° C per 20 min.
    2. Lavare le perline che devono essere scisso con DCM 5x. Agitare le perline in DCM per 15 minuti e lavare le perline nuovo con DCM 5x.
    3. Scolare la DCM dalla siringa. Utilizzare un microscopio ottico e una pipetta con punta tronca per trasferire ogni singola perla in una piastra a 96 pozzetti, una perla per pozzetto.
    4. Coprire la piastra a 96 pozzetti con una scivolata di copertura. Inserire il piatto in un freezer a -20 ° C per 15 min.
    5. Prendere la soluzione raffreddata 01:01 TFA / DCM dal punto 5.10.1 e aggiungere 20 microlitri di ciascun pozzetto che contiene una perlina. Mettere il vetrino posteriore e put la piastra a 96 pozzetti in un agitatore a -20 ° C frigorifero.
    6. Agitare per 20 min. Prendere la piastra a 96 pozzetti fuori e staccare la polizza di copertura. Blow-asciugare il TFA / DCM da ogni pozzetto soffiando aria o argon su di esso. Se più di 10 perle sono spaccati, un speedvac può essere utilizzato per asciugare il TFA / DCM da tutta la piastra. Si noti che, a questo punto, non tutti i composti sono spaccati off le perline, ma i composti incisa dovrebbe essere più che sufficiente per eseguire l'analisi di spettrometria di massa.
    7. Aggiungere 20 microlitri 06:04 ACN: H ₂ O soluzione per sciogliere i composti clivati ​​da ogni pozzetto. Spot 0,6 ml di ciascuna soluzione di composto con 0,6 microlitri matrice CHCA MALDI sulla piastra MALDI.
    8. Utilizzare spettrometria di massa MALDI per determinare il peso molecolare e la sequenza (MS / MS) di ciascun composto.

6. Cloranil test

1. Preparare i seguenti reagenti freschi per ciascuna prova. Soluzione A: 2% cloranile (CAS: 118-75-2) in DMF. SoluzioneB: 2% acetaldeide (CAS: 75-07-0) in DMF.
2. Miscelare 100 ml di soluzione A con 100 ml di soluzione B prima della prova in una provetta da 1,5 ml; cadere le perline e agitare delicatamente. Se i grani diventano blu entro 5 minuti, indica la presenza di ammina secondaria sulla superficie delle perle. Ammine primarie danno un colore marrone scuro invece di girare blu.

Results

Qui vi mostriamo tre spettri rappresentativi MALDI da un trimero PTA con linker. Come mostrato nella Figura 6A, quando spaccati a temperatura ambiente utilizzando il 50% di soluzione di TFA / DCM, degradazione significativa si osserva. In Figura 6A, picco 593 e 484 corrispondono al linker e il trimero PTA, rispettivamente, mostrano che l'intera molecola è stato sintetizzato con successo sul tallone ma degradato durante scissione. Quando spaccati in condizioni di bassa temperatura come d...

Discussion

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una superfamiglia di oligomeri peptidomimetici. Oltre ai peptidi ben studiato, peptoids e peptidi N-metilati, una gran parte di composti all'interno di questa famiglia rimane understudied, majorly a causa della mancanza di metodo sintetico per accedere generali peptidi N-alchilati. Qui si descrive un metodo efficace per sintetizzare PTA con blocchi chirali derivati ​​da amminoacidi. In precedenza, abbiamo riportato di utilizzare un nuovo percorso sub-monomero di librerie di sintes...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6 trimetilpiridina	ACROS	161950010	CAS:108-75-8
2-morfolinoetanamina	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
Soluzione acquosa HBr al 48%	ALFA AESAR	AA14036AT	CAS:10035-10-6
Acetaldeide	Sigma-Aldrich	402788	CAS:75-07-0
Acetonitrile	Fisher	SR015AA-19PS	CAS:75-05-8
Tetraidrofurano anidro (THF)	EMD	EM-TX0277-6	CAS:109-99-9
Benzilammina	Sigma-Aldrich	185701	CAS:100-46-9
bis(triclorometil)carbonato (BTC)	ACROS	258950050	CAS:32315-10-9
Acido bromoacetico	ACROS	106570010	CAS:79-08-3
Clorano	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
Cicloesanemetilammina	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	Cambridge Isotopo	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-Alanina	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
Diclorometano (DCM)	Fisher	BJ-NS300-20	CAS:75-09-2
Dimetilformammide (DMF)	Fisher	BJ-076-4	CAS:68-12-2
Glicole etilenico	Oakwood	44710	CAS:107-21-1
Isopentilammina	Sigma-Aldrich	W321907	CAS:107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS:7758-02-3
L-Alanina	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-Metossipropilammina	Sigma-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-Metossietilammina	Sigma-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropil)-2-pirrolidinone	Sigma-Aldrich	136565	CAS:7663-77-6
N,N'-Diisopropilcarbodiimmide (DIC)	ACROS	115211000	CAS:693-13-0
N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA)	Sigma-Aldrich	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD soluzione al 40% in acqua	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
Piperidina	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS:110-89-4
Piperonilammina	Sigma-Aldrich	P49503	CAS:2620-50-0
Propilammina	Sigma-Aldrich	240958	CAS:107-10-8
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	299537	CAS:76-05-1
&alfa;-Acido ciano-4-idrossicinnamico	Sigma-Aldrich	39468	CAS:28166-41-8
&alfa;-chetoglutarato	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS:328-50-7
Resina Tentagel con linker RINK	Rapp-Polymere	S30023
Alanina transaminasi	Roche	10105589001	AKA: Glutammato-Piruvato Transaminasi (GPT)
Incubatore	New Brunswick Scientific	Innova44
NMR	Bruker	400 MHz
Spettrometro di massa MALDI	Applied Biosystems	4800 LIOFILIZZATORE BALDI-TOF/TOF
	SP Scientific	VirTis reattore
	INTAVIS	Colonna di reazione	3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Collettore per vuoto	Promega	A7231	Vac-Man