Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.
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Articolo metodologico
Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il microambiente meccanico ha dimostrato di agire come un regolatore cruciale del comportamento di crescita tumorale e di segnalazione, che è a sua rinnovato e modificato come parte di una serie di complesse interazioni bidirezionale mechanosensitive. Mentre lo sviluppo di biologicamente rilevanti modelli tumorali 3D hanno facilitato studi meccanicistici sull'impatto della reologia matrice sulla crescita del tumore, il problema inverso dei cambiamenti di mappatura dell'ambiente meccanica indotta da tumori rimane difficile. Qui, descriviamo l'attuazione di particella inseguimento microrheology (PTM) in combinazione con i modelli 3D di cancro pancreatico come parte di un approccio efficaci e validi per monitorare longitudinalmente cambiamenti fisici nel microambiente tumorale, in situ. La metodologia qui descritta integra un sistema di preparazione di modelli in vitro 3D incorporato in un modello di matrice extracellulare (ECM) scaffold di collagene di tipo I con sonde fluorescente distribuiti uniformemente per Po-zione e tempo-dipendenti misurazioni microrheology in tutto il campione. tumori in vitro sono placcati e sondate in condizioni parallele utilizzando lastrine pozzetti. Basandosi su metodi stabiliti, i video dei movimenti della sonda traccianti vengono trasformati tramite il Relation Generalized Stokes Einstein (GSER) per segnalare il complesso dipendente dalla frequenza viscoelastica modulo di taglio, G * (ω). Poiché questo approccio è l'imaging-based, caratterizzazione meccanica è anche mappato su grandi campi spazio-luce trasmessa per segnalare contemporaneamente i cambiamenti qualitativi in termini di dimensioni e fenotipo tumorale 3D. Risultati rappresentativi mostrano contrastanti risposta meccanica in sottoregioni associati localizzata degradazione della matrice invasione indotta e calibrazione del sistema, dati di convalida sono presentati. Esiti indesiderati da errori sperimentali comuni e la risoluzione dei problemi di questi problemi sono anche presentati. Il formato da 96 pozzetti placcatura cultura 3D realizzato in questo protocollo è conducive alla correlazione delle misure microrheology con test di screening terapeutici o imaging molecolare per acquisire nuove intuizioni impatto dei trattamenti o stimoli biochimici sul microambiente meccanico.
Introduzione
E 'chiaro da una crescente evidenza nella letteratura che le cellule tumorali, come con le cellule epiteliali di mammifero non maligne, sono molto sensibili alle proprietà meccaniche e biofisiche della matrice extracellulare circostante (ECM) e altri componenti del microambiente 1-9. Studi meccanicistici eleganti hanno fornito informazioni sul ruolo di rigidità extracellulare come partner segnalazione meccanosensibili complesso che regola il comportamento crescita maligna e la morfogenesi 2,3,10,11. Questo lavoro è stato facilitato in particolare dallo sviluppo del 3D in modelli tumorali in vitro che ripristinano biologicam....
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Protocollo
1. Spheroids Culturing tumorali
- Miscelare 10 ml di acqua di grado coltura cellulare con 0,1 g di agarosio per ottenere una soluzione di agarosio all'1%.
- Soluzione di agarosio calore sopra 70 ° C (circa 14 secondi in un forno a microonde standard o mediante una piastra riscaldante) prima aliquotando 40 ml di soluzione di agarosio in un pozzo su una piastra a 96 pozzetti.
- Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 ora mentre la raccolta delle cellule usando tecniche standard.
- Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule in sospensione.
- Diluire sospensione cellulare a 1000 cellule / ml e ag....
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Risultati
Per verificare la validità di G * (ω) misurazioni in posizioni localizzate all'interno di un complesso microambiente modello di tumore, sono stati condotti due esperimenti di validazione iniziali. In primo luogo, abbiamo cercato di validare le nostre misure contro il "gold standard" della massa oscillante taglio reometria. Abbiamo preparato campioni identici di matrice di collagene (senza cellule) ad una concentrazione di 1,0 mg / ml di collagene. Questi campioni sono stati sondati con un reometro.......
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Discussione
In questo protocollo si introduce una strategia robusta e ampiamente applicabile per longitudinalmente rilevamento delle modifiche locali in ECM rigidità nei modelli tumorali 3D. Prevediamo che questa metodologia possa essere adottato da biologi cancro e biofisici interessati nel comportamento meccanosensibili implicati nel rimodellamento della matrice durante la crescita del tumore e dei processi di invasione. Quantificazione precisa di matrice cinetica di degradazione possa essere particolarmente utile a coloro che st.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo la condivisione open-source di MATLAB codice particella di monitoraggio fornito da Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), insieme al codice precedente IDL e ampia documentazione fornita da John C. Crocker e Eric R. settimane. Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento dal National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagene bovino di tipo 1 | BD Biosciences, San Jose, CA | 354231 | |
| PANC-1 | American Type Cell Culture, Manassas, VA | CRL1469 | o altro tipo di cellula appropriato |
| Microsfere fluorescenti | Technologies, Carlsbad, CA | 906906 | |
| Matrigel | BD Biosciences, Bedford, MA | 354230 | |
| Agarose | Fisher Bioreagenti, Waltham, MA | C12H18O9 | |
| NaOH | Fisher Bioreagenti, Waltham, MA | NC0480985 | |
| Piastre di imaging a 96 pozzetti | Corning Inc., Corning, NY | 3904 | |
| DMEM | Hyclone, Waltham, MA | SH30243.01 | o terreni di coltura cellulare appropriati |
| Zeiss AxioObsever Microscopio | Zeiss, Oberkochen, Germania | include una telecamera ad alta velocità e software di imaging | |
| Software MATLAB | The Mathworks, Natick, MA |
Riferimenti
- Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force jo....
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Ristampe e permessi
