Articolo metodologico

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

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DOI:

10.3791/51302

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10 giugno 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Abstract

Il microambiente meccanico ha dimostrato di agire come un regolatore cruciale del comportamento di crescita tumorale e di segnalazione, che è a sua rinnovato e modificato come parte di una serie di complesse interazioni bidirezionale mechanosensitive. Mentre lo sviluppo di biologicamente rilevanti modelli tumorali 3D hanno facilitato studi meccanicistici sull'impatto della reologia matrice sulla crescita del tumore, il problema inverso dei cambiamenti di mappatura dell'ambiente meccanica indotta da tumori rimane difficile. Qui, descriviamo l'attuazione di particella inseguimento microrheology (PTM) in combinazione con i modelli 3D di cancro pancreatico come parte di un approccio efficaci e validi per monitorare longitudinalmente cambiamenti fisici nel microambiente tumorale, in situ. La metodologia qui descritta integra un sistema di preparazione di modelli in vitro 3D incorporato in un modello di matrice extracellulare (ECM) scaffold di collagene di tipo I con sonde fluorescente distribuiti uniformemente per Po-zione e tempo-dipendenti misurazioni microrheology in tutto il campione. tumori in vitro sono placcati e sondate in condizioni parallele utilizzando lastrine pozzetti. Basandosi su metodi stabiliti, i video dei movimenti della sonda traccianti vengono trasformati tramite il Relation Generalized Stokes Einstein (GSER) per segnalare il complesso dipendente dalla frequenza viscoelastica modulo di taglio, G * (ω). Poiché questo approccio è l'imaging-based, caratterizzazione meccanica è anche mappato su grandi campi spazio-luce trasmessa per segnalare contemporaneamente i cambiamenti qualitativi in ​​termini di dimensioni e fenotipo tumorale 3D. Risultati rappresentativi mostrano contrastanti risposta meccanica in sottoregioni associati localizzata degradazione della matrice invasione indotta e calibrazione del sistema, dati di convalida sono presentati. Esiti indesiderati da errori sperimentali comuni e la risoluzione dei problemi di questi problemi sono anche presentati. Il formato da 96 pozzetti placcatura cultura 3D realizzato in questo protocollo è conducive alla correlazione delle misure microrheology con test di screening terapeutici o imaging molecolare per acquisire nuove intuizioni impatto dei trattamenti o stimoli biochimici sul microambiente meccanico.

Introduzione

E 'chiaro da una crescente evidenza nella letteratura che le cellule tumorali, come con le cellule epiteliali di mammifero non maligne, sono molto sensibili alle proprietà meccaniche e biofisiche della matrice extracellulare circostante (ECM) e altri componenti del microambiente 1-9. Studi meccanicistici eleganti hanno fornito informazioni sul ruolo di rigidità extracellulare come partner segnalazione meccanosensibili complesso che regola il comportamento crescita maligna e la morfogenesi 2,3,10,11. Questo lavoro è stato facilitato in particolare dallo sviluppo del 3D in modelli tumorali in vitro che ripristinano biologicamente architettura dei tessuti rilevante e possono essere coltivate in materiali impalcatura con la meccanica accordabili e ripreso da microscopia ottica 12-19. Tuttavia, l'altro lato di questa finestra mechanoregulatory tra tumore e microambiente, attraverso il quale le cellule tumorali a sua volta modificare la reologia del loro ambiente, rimane alquantopiù difficile da studiare. Ad esempio, durante i processi di invasione, cellule alla periferia di un tumore possono subire la transizione epitelio mesenchimale (EMT) e aumentare l'espressione delle metalloproteasi della matrice (MMPs) che causano degradazione locale di ECM 20-22, che a sua volta influenza il comportamento di crescita di meccanosensibili altre cellule tumorali prossimali. Attraverso una serie di processi biochimici, cellule tumorali continuamente comporre la rigidità locale del loro ambiente su e giù secondo processi differenti in momenti diversi. La metodologia qui descritta è motivata dalla necessità di strumenti analitici che segnalano variazioni locali nella rigidità e la conformità della ECM durante la crescita, che possono essere integrati con i modelli tumorali in 3D e correlati longitudinalmente con i cambiamenti biochimici e fenotipiche senza terminare la cultura.

Alla ricerca di una tecnica appropriata per l'attuazione in questo contesto, microrheology particella-tracking (PTM) emerge come un candidato forte.Questo metodo, sperimentato originariamente da Mason e Weitz 23,24, utilizza il movimento delle sonde traccianti incorporati in un fluido complesso per segnalare il modulo complesso dipendente dalla frequenza viscoelastico taglio, G * (ω) su scale micron. Questo approccio generale è stato sviluppato con diverse variazioni adatti per diverse applicazioni in morbidi Materia Condensata, colloidi, biofisica e fisica dei polimeri 25-31. PTM presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi, poiché letture di viscoelasticità locale sono ottenute dalla non distruttiva immagini video di sonde traccianti biochimicamente inattivi che sono incorporati al momento della preparazione cultura e rimangono sul posto per periodi prolungati di crescita. Questo è in contrasto con misure standard oro con un taglio oscillante rinfusa reometro, che richiede necessariamente la cessazione della cultura e riporta la reologia macroscopico massa del campione piuttosto che misurazioni di punti all'interno del complesso microenvir tumore 3Dbiente. Infatti numerosi studi hanno dimostrato l'utilità di interpretazione delle misure di movimenti sonda tracciante ao vicino cellule tumorali o non tumorali per misurare deformazioni associati migrazione cellulare 32, stress meccanico indotto da uno sferoide espansione 33, reologia intracellulare 34,35, e per mappare sollecitazioni meccaniche nei tessuti ingegnerizzati 36, e della relazione tra dimensione dei pori e la velocità dell'invasione 37. Altre tecniche adatte per microrheology, quali microscopia a forza atomica (AFM) possono essere realizzate, ma soprattutto per sondare punti alla superficie del campione, oppure possono rappresentare coltura problemi di sterilità che complicano misurazioni longitudinali 38.

Qui, descriviamo un protocollo completo che comprende metodi per la crescita di sferoidi tumorali 3D adatti per il trasferimento in ECM con sonde fluorescenti embedded per il video di particelle di tracciamento e di analisi per la mappatura attendibile spazialecambiamenti nella microrheology nel tempo nella cultura. Nel presente di attuazione, modelli tumorali 3D sono coltivate in formato più pozzetti con vista verso l'incorporazione di misure microrheology con altri metodi tradizionali (ad esempio, citotossicità), che questo formato è favorevole al. In questa illustrazione rappresentativo di questa metodologia che coltura in vitro sferoidi 3D in Uso PANC-1 le cellule, una linea cellulare di cancro del pancreas stabilito noto per formare sferoidi 39, ma tutte le misurazioni qui descritti sono largamente applicabile per studiare di tumori solidi utilizzando una varietà di linee cellulari adatto per la cultura 3D. Poiché si basa Imaging-questo metodo intrinsecamente è ideale per la co-registrazione dei dati microrheology ad alta risoluzione con grandi campi a luce trasmessa di vista che segnalano cambiamenti nella crescita delle cellule, la migrazione e fenotipo. L'attuazione del PTM integrato con microscopia ottica trasmessa in questo modo assume un posizionamento riproducibile dei wh palco microscopioich è in genere disponibile sul motorizzati commerciale epifluorescenza widefield microscopi biologici. Il protocollo messo a punto sotto può essere realizzata con qualsiasi fluorescenza automatizzato microscopio biologico ragionevolmente attrezzata. Questo è un metodo ad alta intensità di dati intrinsecamente, che richiede l'acquisizione di gigabyte di dati microscopia video digitale per l'elaborazione offline.

Nella seguente protocollo, protocollo 1 riguarda la preparazione iniziale di sferoidi tumorali che viene descritto qui utilizzando overlay su agarosio ma potrebbero essere sostituiti con una varietà di altri metodi come appendere goccia 40, o coltura rotante 41 tecniche. Protocollo 2 descrive il processo di inserimento sferoidi in un'impalcatura di collagene però in alternativa, in vitro tumori 3D in potessero essere coltivate da incapsulamento o incorporamento di cellule risospese in ECM 12,15, piuttosto che singoli sferoidi non aderenti pre-formate. Protocolli successivi descrivono le procedure per OOME OTTENERE misurazioni microrheology risolta in tempo per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati di microscopia video, rispettivamente. Il trattamento dei dati è descritta utilizzando MATLAB, facendo uso di routine open source per PTM costruita su algoritmi originariamente descritti da Crocker e Grier 42, che sono anche stati ampiamente sviluppati per piattaforme software differenti (vedi http://www.physics.emory.edu/ ~ settimane / idl /).

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Protocollo

1. Spheroids Culturing tumorali

  1. Miscelare 10 ml di acqua di grado coltura cellulare con 0,1 g di agarosio per ottenere una soluzione di agarosio all'1%.
  2. Soluzione di agarosio calore sopra 70 ° C (circa 14 secondi in un forno a microonde standard o mediante una piastra riscaldante) prima aliquotando 40 ml di soluzione di agarosio in un pozzo su una piastra a 96 pozzetti.
  3. Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 ora mentre la raccolta delle cellule usando tecniche standard.
  4. Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule in sospensione.
  5. Diluire sospensione cellulare a 1000 cellule / ml e aggiungere 100 ml di tale diluizione al pozzetto contenente il letto di agarosio guarito.
  6. Porre il campione in un agitatore durante la notte in un incubatore a 37 ° 5% di CO 2 C e.
  7. Rimuovere il campione dal shaker e aggiungere 100 ml di coltura cellulare multimediale.
  8. Incubare sferoidi fino al raggiungimento del diametro desiderato. Ad esempio, dopo 9 giorni, una spheroid saranno circa 450 micron di diametro. Durante questo tempo, mezzi di crescita fresco può essere aggiunto ai pozzetti ma l'aspirazione deve essere evitata poiché questo provocherà rimozione dello sferoide.

2. Preparazione Spheroids tumorali 3D incorporati in ECM

  1. Preparare una stazione di lavoro con materiali necessari all'interno di una cappa a flusso laminare.
  2. Preparare una miscela diluita di 1 micron di diametro sonde traccianti fluorescenti carbossilato modificato con l'aggiunta di sonde 2 parti di riserva (2% solidi) a 25 parti di acqua sterile.
  3. Rimuovere una bottiglia di 3,1 mg / ml di collagene bovino dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio.
  4. Aliquota 125 ml di collagene in un vuoto flaconcino da 2 ml.
  5. Aggiungere 50 ml di soluzione della sonda tracciante diluito al flaconcino contenente il collagene e vortice brevemente per distribuire le sonde.
  6. Aggiungere 235 ml di appropriati mezzi di coltura cellulare contenente rosso fenolo (che diventa giallo) per un volume totale di 410 ml e vortex brevemente prima di togliere 205 ml (metà del volume totale) e l'immissione in un nuovo flaconcino da 2 ml. Vial 1 conterrà sferoide tumore e Vial 2 sarà un misto di controllo.
  7. Aggiungi ~ 2 ml di 1 M NaOH al flaconcino 1 per portare nuovamente la soluzione a pH neutro (terreni di coltura contenente rosso fenolo dovrebbe tornare al rosso). Si noti che questo causerà la miscela per iniziare curare se non è tenuta in ghiaccio. Vortex brevemente per mescolare, per poi tornare a cremagliera ghiaccio immediatamente.
    NOTA: Il sferoide è appena visibile ad occhio nudo, dopo 9 giorni di cultura e la sua rimozione dal letto agarosio è un compito delicato. L'uso di un microscopio dissezione può essere utile per alcuni utenti. Mantenendo l'integrità dello sferoide durante il trasferimento è fondamentale.
  8. Usando una pipetta a bocca larga, rimuovere delicatamente 40 ml di supporto dal pozzetto contenente il sferoide tumore. Conservare questo 40 microlitri mentre conduceva il passo successivo.
  9. Controllare il bene per vedere se sferoideè stato rimosso nel passaggio precedente. Se fosse, aggiungere 40 microlitri contenenti sferoide a Fiala 1. Caso contrario, posizionare i 40 microlitri di nuovo nel bene e ripetere il passaggio precedente.
  10. Mescolare delicatamente Vial 1 (non rischiare vortex, può danneggiare la sferoide) prima di trasferire il composto in 60 porzioni microlitri in tre pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Ispezionare ciascun pozzetto con un microscopio dopo l'aggiunta di miscela per determinare quale contiene ben sferoide.
  11. Aggiungere 2 microlitri ~ 1 M NaOH e 40 ml di coltura cellulare multimediale a fiala 2 e vortex prima aliquotting 60 ml di questa miscela in un pozzo vuoto nella piastra a 96 pozzetti e l'etichettatura come controllo.
  12. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per la cura per almeno 1 ora.

3. Costruire Rete di Punti di campionamento e di prendere un video in ogni punto

  1. Trasferire la piastra campione dal incubatrice al palco microscopio. Lasciare 10 minuti per il campione EQUILibrate con la temperatura ambiente se una fase riscaldata non è disponibile.
  2. Osservare il campione con bassi lenti dell'obiettivo alimentati per assicurarsi che sia integro e pronto per l'imaging. Determinare la posizione del tumore all'interno del pozzo.
  3. Decidere quanti punti di campionamento per prendere. Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto, distribuiti in anelli concentrici intorno alla sferoide produrranno risultati sufficientemente dettagliati.
  4. Spostare il palco per ciascuna posizione desiderata e utilizzare il microscopio interfacciamento software per registrare le coordinate xey (o le coordinate registrare manualmente se interfacciare il software non è disponibile).
  5. Passare il microscopio per una lente obiettivo alta potenza (tipicamente 100X), e selezionare il cubo filtro appropriato per la lunghezza d'onda di eccitazione delle sonde traccianti. Utilizzare l'elenco dei punti creati nel passaggio 3.4 per passare al primo punto nella griglia.
  6. Regolare il fuoco per trovare il fondo del pozzo, poi passare a trovare un campo di vista (FOV) contenente vari trac a fuocoer sonde.
  7. Osservare l'istogramma intensità e regolare l'intensità di esposizione e il tempo per dare possibile la più ampia gamma dinamica, garantendo nel contempo che l'immagine non diventa satura.
  8. Ottenere una sequenza video con un frame rate di 20-30 msec per fotogramma (circa 800 fotogrammi o 16-24 sec di lunghezza si raccomanda di fornire statistiche sufficienti per robusto calcolo MSD bilanciato con la necessità di ridurre al minimo il tempo di acquisizione in ogni punto della griglia spaziale) e salvare con una apposita convenzione. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o un tavolo.
  9. Ripetere i passaggi 3,6-3,9 per ogni punto campione nella griglia.
  10. Ripetere i passaggi 3,3-3,10 per ogni bene per l'esperimento.

4. Analisi Video dati per calcolare le proprietà reologiche in ogni punto del campione

  1. Copiare tutti i dati video a una cartella di analisi (possibilmente su un computer diverso).
  2. Importazione di dati immagine in MATLAB o altri software di analisi.
    NOTE: Ampia documentazione riguardante la serie di MATLAB particelle routine di rilevamento adottato qui è disponibile a http://people.umass.edu/kilfoil . Si raccomanda l'uso di una funzione telefonica personalizzata per automatizzare l'elaborazione di più file in posizioni diverse.
  3. Calibrare il software analizzando diversi fotogrammi del video per determinare adeguatamente selezione e rifiuto parametri (dimensioni, passa-banda, ecc) per individuare posizioni centrali della sonda. Sfondo esteso per questi passaggi cruciali è descritto da Crocker e Grier.
  4. Utilizzare il software per determinare automaticamente ogni posizione della sonda per tutti i fotogrammi e quindi collegare queste posizioni in traiettorie.
  5. Utilizzare i dati di traiettoria per calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD) in funzione del tempo di ritardo, avendo cura di applicare il fattore di calibrazione spaziale appropriata (micron per pixel) per la lente obiettivo specifico, ogni pixel binning, ecc (normalmente effettuatenel meta-dati).
  6. Calcola G * (utilizzando il generalizzato relazione di Stokes-Einstein presi in considerazione i limiti di applicabilità di GSER per un particolare campione 24,28,43. In alternativa, gli utenti potrebbero voler interpretare le proprietà ECM direttamente da MSD, semplicemente confrontando legge di potenza di scala, plateau valori, indici di eterogeneità o di altri parametri.
  7. Ripetere i passaggi da 4.2 tramite 4.6 per ogni FOV nell'esperimento.
  8. Co-registrati i dati di posizione dal punto 3.4 con modulii viscoelastico ad una particolare frequenza di interesse. A seconda del produttore del microscopio utilizzato, questo passo può essere facilitato da una routine personalizzata che legge i metadati microscopio o posizione dati possono essere tabulati manualmente.
  9. Utilizzare le funzioni di interpolazione 3D per generare una reologia mappa spaziale della ECM.

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Risultati

Per verificare la validità di G * (ω) misurazioni in posizioni localizzate all'interno di un complesso microambiente modello di tumore, sono stati condotti due esperimenti di validazione iniziali. In primo luogo, abbiamo cercato di validare le nostre misure contro il "gold standard" della massa oscillante taglio reometria. Abbiamo preparato campioni identici di matrice di collagene (senza cellule) ad una concentrazione di 1,0 mg / ml di collagene. Questi campioni sono stati sondati con un reometro...

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Discussione

In questo protocollo si introduce una strategia robusta e ampiamente applicabile per longitudinalmente rilevamento delle modifiche locali in ECM rigidità nei modelli tumorali 3D. Prevediamo che questa metodologia possa essere adottato da biologi cancro e biofisici interessati nel comportamento meccanosensibili implicati nel rimodellamento della matrice durante la crescita del tumore e dei processi di invasione. Quantificazione precisa di matrice cinetica di degradazione possa essere particolarmente utile a coloro che st...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo la condivisione open-source di MATLAB codice particella di monitoraggio fornito da Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), insieme al codice precedente IDL e ampia documentazione fornita da John C. Crocker e Eric R. settimane. Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento dal National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagene bovino di tipo 1BD Biosciences, San Jose, CA354231
PANC-1American Type Cell Culture, Manassas, VACRL1469o altro tipo di cellula appropriato
Microsfere fluorescentiTechnologies, Carlsbad, CA906906
MatrigelBD Biosciences, Bedford, MA354230
AgaroseFisher Bioreagenti, Waltham, MAC12H18O9
NaOHFisher Bioreagenti, Waltham, MANC0480985
Piastre di imaging a 96 pozzettiCorning Inc., Corning, NY3904
DMEMHyclone, Waltham, MASH30243.01o terreni di coltura cellulare appropriati
Zeiss AxioObsever MicroscopioZeiss, Oberkochen, Germaniainclude una telecamera ad alta velocità e software di imaging
Software MATLABThe Mathworks, Natick, MA
Life

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