L'outcome primario negli studi clinici per le malattie neuromuscolari è generalmente migliorata la funzione muscolare. Pertanto, valutando l'effetto di potenziali composti terapeutici sulla performance muscolare pre clinicamente in modelli murini è di grande importanza. Siamo qui descriviamo diversi test funzionali per affrontare questo.
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è un muscolo grave e progressivo deperimento disturbo per il quale nessuna cura disponibile. Tuttavia, diversi potenziali composti farmaceutici e approcci di terapia genica hanno progredito nei test clinici. Con il miglioramento della funzione muscolare è il punto finale più importante in questi studi, molta enfasi è stata posta sulla creazione di affidabile, riproducibile, e facile da eseguire test funzionali di controllare la validità clinicamente valutare la funzione muscolare, la forza, la condizione e il coordinamento nel mdx modello murino di DMD. Entrambi i test invasivi e non invasivi sono disponibili. I test che non esacerbare la malattia possono essere utilizzati per determinare la storia naturale della malattia e gli effetti degli interventi terapeutici (ad es. Prova la forza di presa degli arti anteriori, due differenti prove sospese utilizzando sia un filo o una griglia e rotarod esecuzione). In alternativa, costretto treadmill in esecuzione può essere utilizzato per migliorare la progressione della malattia e / o valutareeffetti protettivi di interventi terapeutici sulla patologia della malattia. Siamo qui descritto come eseguire questi test funzionali più comunemente utilizzati in modo affidabile e riproducibile. L'utilizzo di questi protocolli basati su procedure operative standard permette il confronto dei dati tra diversi laboratori.
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è il disturbo neuromuscolare più comune che colpisce 1/5.000 neonati maschi. Questa malattia atrofia muscolare grave e progressiva è causata da mutazioni nel gene DMD che interrompono la fase di lettura aperta e impediscono la sintesi della proteina distrofina funzionale. Le fibre muscolari prive di distrofina sono vulnerabili ad esercitare danno indotto. Una volta esaurito capacità rigenerativa del muscolo, e causa di infiammazione cronica del muscolo danneggiato, fibre vengono sostituite da tessuto connettivo e grasso, successivamente, portando ad una perdita di funzione. Generalmente, i pazienti DMD perdono deambulazione degli arti inferiori all'inizio del secondo decennio. Più tardi, anche i muscoli delle braccia e del cingolo scapolare sono colpiti e pazienti spesso sviluppano scoliosi toraco-lombare a causa di indebolimento asimmetrica dei muscoli che sostengono la colonna vertebrale. Ventilazione assistita è generalmente richiesto nella tarda adolescenza o vent'anni. Respiratorie e insufficienza cardiaca piomboa morte nella terza o quarta decade 1.
Sebbene il gene-malattia è stato scoperto oltre 25 anni fa 2, non esiste una cura disponibile per la DMD. Tuttavia, una migliore assistenza sanitaria e l'uso di corticosteroidi hanno aumentato l'aspettativa di vita nel mondo occidentale 3. Con l'uso di modelli animali come il topo mdx, importanti passi avanti nella scoperta di potenziali strategie terapeutiche sono state fatte. Il topo mdx è il modello di topo DMD più comunemente usato. Esso ha una mutazione puntiforme nell'esone 23 della DMD gene murino e di conseguenza manca distrofina 4. Negli ultimi due anni, molte strategie proposte sono progredite in studi clinici 5-9. In questi studi, il miglioramento della funzione muscolare è l'endpoint primario, sottolineando l'importanza di testare i benefici dei composti sulla funzione muscolare nei topi durante la fase clinica preliminare di test.
Come DMDpazienti, anche le fibre muscolari negative distrofina di topi mdx sono vulnerabili ad esercitare danni indotti e la loro funzione muscolare è compromessa rispetto a C57BL/10ScSnJ wild type topi. Questo deterioramento può essere valutata con una serie di test funzionali. Alcuni di questi test sono invasivi e non interferiscono con la patologia muscolare (ad es forelimb forza di presa, prove appesi e rotarod esecuzione). Pertanto possono essere utilizzati per monitorare la storia naturale della malattia o determinare gli effetti dei composti sulla progressione della malattia. Per ottenere una immagine in profondità l'influenza dei composti sulla funzione muscolare nel topo mdx, un regime test funzionale che non interferisce con la progressione della malattia consiste in tutti questi test può essere utilizzato 10.
In alternativa, costretto treadmill in esecuzione può essere usato per esacerbare intenzionalmente la progressione della malattia e testare le capacità protettive di composti 11. Il tapis roulant può anche essereutilizzato come misura di esito in cui tempo di funzionamento fino ad esaurimento viene misurata 12, o come strumento per fatica topi mdx modo che essi svolgono meno bene in un test funzionale successiva garantire grandi differenze di prestazioni tra i gruppi di trattamento 13. Quando si sceglie test funzionali, il loro effetto sulla progressione della malattia deve essere tenuto presente soprattutto quando il test topi distrofici come il topo mdx 14.
Siamo qui descriviamo in dettaglio come eseguire i test funzionali più comunemente utilizzati in modo affidabile e riproducibile sulla base disponibili procedure operative standard della rete TREAT-NMD. Clicca qui per visitare TREAT-NMD .
Gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal comitato etico degli animali (DEC) del Leiden University Medical Center (LUMC). I topi sono stati allevati dalla struttura animale della LUMC e tenuti in gabbie a ventilazione individuale con 12 cicli Dark Light hr. Avevano ad libitum accesso ad acqua e cibo standard.
Quando si esegue uno dei test funzionali di seguito descritte, le condizioni sperimentali devono essere rigorosamente controllato per ridurre le variazioni. Preferibilmente, età e sesso topi corrispondenti devono essere utilizzati, come le prestazioni differisce tra età e generi. I topi che appartengono alla stessa cucciolata dovrebbero essere randomizzati sui gruppi sperimentali. Gli animali devono essere testati dallo stesso operatore, che è cieco ai gruppi sperimentali. Le prove devono essere eseguite alla stessa ora del giorno e della settimana, stessa stanza per pareggiare gli odori, rumori, ecc 14 grandi variazioni tra i singoli topi e punti di tempo può essere osservato per tuttiprove funzionali, quindi / dovrebbero essere usati gruppo sperimentale 6-8 topi. Risultati delle prove funzionali può anche variare ampiamente tra i diversi ceppi di tipo selvaggio inbred. Pertanto, topi wild type sperimentali e di controllo devono sempre sono corrispondenti sfondi (in caso di topi mdx utilizzare il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico). Tutti i dati qui descritti sono stati ottenuti con il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico, che ci riferiamo tipo selvatico da qui in avanti. I test qui descritti possono essere utilizzati longitudinalmente da almeno 1-19 mesi di età nei topi mdx tipo e selvatici. Le prove non devono essere ripetuti più di una volta alla settimana per evitare che i topi da perdere interesse e la disponibilità a eseguire l'operazione.
1. Forelimb Grip Forza di prova
Utilizzare il test forelimb forza di presa per misurare la forza delle arti anteriori. Il test si basa sulla tendenza di un mouse per afferrare istintivamente una griglia volta sospeso per la coda 15, e adapted da DMD_M2.2.001.pdf .
2. Test Hanging
Con i test pensili, equilibrio, coordinazione e condizione muscolare può essere valutata. Questi test si basano sulla conoscenza che i topi sono desiderosi di restare appeso a un filo o una griglia fino ad esaurimento 16. Ci sono due test pensili distintive che all'inizio della prova siasolo i due arti anteriori o quattro arti sono utilizzati, usando rispettivamente un filo o griglia. La prova appeso con il filo e la griglia sono il metodo di tempo sospeso più lungo adattato da DMD_M.2.1.004.pdf e DMD_M.2.1.005.pdf rispettivamente. Un limite appeso fisso viene utilizzato di 600 sec. La maggior parte dei topi wild type può appendere per 600 secondi, mentre i topi distrofici non può. Per ridurre il trascorrere del tempo l'esecuzione di questa prova, un tempo massimo di impiccagione è stato messo in atto. I topi che cadono fuori il filo o la griglia prima di allora sono date fino a due tentativi. Questo viene fatto per riassicurare che i topi sono davvero in grado di appendere e non cadono a causa di goffaggine.
3. Gara podistica rotarod
Con la forza muscolare prova rotarod, coordinazione, equilibrio, e la condizione può essere determinato 17.
4. Esercizio Treadmill
Iltapis roulant può essere utilizzato in tre modi come strumento nella ricerca clinica pre. In primo luogo, costretto tapis roulant in esecuzione può essere utilizzato per aggravare la patologia della malattia, come descritto in questo protocollo (vedi anche: DMD_M2.1.001.pdf ). In secondo luogo, la capacità di funzionamento massima di topi e gli effetti dei trattamenti su questo può essere valutata (Vedere per il metodo per consentire topi funzionano fino all'esaurimento DMD_M.2.1.003.pdf ). Infine, tapis roulant in esecuzione può essere utilizzato prima per un altro test funzionale di esaurire il mouse in modo che si comporta meno bene nella seconda prova 13. Ciò avviene esercitando topi due o tre volte alla settimana come descritto di seguito, direttamente seguito da una delle prove funzionali descritte protocollo 1-3.
I test funzionali presentati qui sono riproducibili, facili da eseguire e applicabile al wild type e topi distrofici indipendentemente dalla loro età. I test forniscono strumenti utili per la validità clinicamente valutare la funzione muscolare, la forza, la condizione e il coordinamento. Quando si testano gli effetti di un composto sulla storia naturale della malattia, i test non invasivi descritte qui (forza di presa forelimb, entrambe le prove pensili e il test rotarod) può essere ben combinati in un regime di prova funzionale in cui questi test vengono eseguiti in giorni consecutivi . Questi protocolli non sono dannose per topi mdx e possono essere utilizzati in modo longitudinale 10. Va tenuto presente che i risultati di ciascuna di queste prove sono generati da differenti o in parte sovrapposti gruppi muscolari invece di un singolo muscolo. Pertanto, utilizzando una combinazione di test multipli è consigliato avere un quadro più completo e quindi una migliore comprensione della funzionalità della esperienzagruppi mentali. In alternativa, i miglioramenti funzionali di un unico muscolo possono essere valutati sulla base delle misure di fisiologia muscolare 20.
Come test comportamentali, anche i test funzionali in grado di dimostrare ampia variazione tra diversi tipi di mouse, o all'interno di un topo tra valutazioni diverse. Per ridurre la variazione, tutte le prove devono essere eseguite dallo stesso sperimentatore che ha familiarità con i topi. Variabili esterne come odori e suoni nella stanza, ora del giorno e il giorno della settimana in cui viene eseguito il test dovrebbero essere tenuti il più possibile costante. I topi dovrebbero essere di genere e di età corrispondente. Quando si utilizza tapis roulant esacerbare la progressione della malattia, è indispensabile utilizzare un protocollo standardizzato in cui tutti i parametri di funzionamento (durata, velocità e pendenza) vengono mantenute costanti nel tempo per tutti i gruppi sperimentali, in modo che tutti i topi sono ugualmente trattati. Sebbene la maggioranza dei topi sono pronti a partecipare ai test funzionali e la maggior parte degli animali mostrano altalivelli di disponibilità, alcuni topi (principalmente forte topi wild type) di tanto in tanto evitare di eseguire il comportamento di test e spettacolo evasione. Se questo comportamento non è corretto per, i falsi si potrebbero trarre conclusioni 21. Fortunatamente, questi tipi di comportamento sono osservati solo occasionalmente e possono essere corretti per posizionando il mouse avanti sul filo, griglia o rotarod, o tirando un'altra volta sul misuratore forza di presa.
Miglioramenti in una prova funzionale (ad esempio appesi test di valutazione della funzione muscolare) non necessariamente devono collaborare verifica con i miglioramenti in un altro test (forelimb forza di presa valutare sola forza muscolare). Nei topi mdx, miglioramenti nella funzione muscolare possono distinguere prima che in forza muscolare. Questo è visto anche in pazienti DMD che partecipano a studi clinici dove i miglioramenti clinicamente significativi nel test del cammino di 6 minuti non cooccur con miglioramenti nella forza muscolare 6,7. Tuttavia, questo puòin parte dipendono dal meccanismo di funzionamento del composto testato ed è possibile che altri composti migliorare la forza e non funzione. Pertanto, i risultati dei test dovrebbero essere interpretati con il meccanismo d'azione del composto in mente.
The authors have nothing to disclose.
Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |