RNA polimerasi II sintetizza un RNA precursore che si estende oltre l'estremità 3 'del mRNA maturo. La fine del RNA maturo viene generato cotranscriptionally, in un sito dettata da sequenze di RNA, tramite l'attività di endonucleasi del complesso scissione. Qui, dettaglio il metodo per studiare le reazioni di dissociazione in vitro.
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Articolo metodologico
Analisi delle reazioni RNA di trasformazione che utilizzano cellulari Sistemi gratis: 3 'Fine Decolleté di pre-mRNA Substrati
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'estremità 3 'degli mRNA di mammifero non è formata da improvvisa di trascrizione di RNA polimerasi II (RNPII). Invece, RNPII sintetizza mRNA precursore oltre la fine degli RNA maturi, e un processo attivo di attività endonucleasica è richiesto in un luogo specifico. Clivaggio del precursore dell'RNA avviene normalmente 10-30 nt a valle del sito poliA consenso (AAUAAA) dopo i dinucleotidi CA. Proteine del complesso clivaggio, un complesso proteico multifattoriale di circa 800 kDa, realizzare questa attività nucleasi specifica. Sequenze di RNA specifici a monte ea valle del sito poliA controllano il reclutamento del complesso scissione. Subito dopo la scissione, pre-mRNA sono poliadenilato dalla polimerasi poliA (PAP) per la produzione di maturare messaggi RNA stabili.
Lavorazione di estremità 3 'di un trascritto di RNA può essere studiata utilizzando estratti nucleari cellulari con specifici substrati di RNA radioattivi. In somma, una lunga 32 </ Sup> P-marcato uncleaved precursore RNA viene incubata con estratti nucleari in vitro, e clivaggio viene valutata mediante gel elettroforesi e autoradiografia. Quando si verifica la corretta scissione, un corto 5 'spaccati prodotto viene rilevato e quantificato. Qui, descriviamo il saggio di clivaggio in dettaglio utilizzando, ad esempio, l'elaborazione 3 'estremità di HIV-1 mRNA.
Introduzione
La biosintesi della maggior parte degli RNA maturi messaggio eucarioti (mRNA) richiede diverse modificazioni post-trascrizionali, quali capping, splicing e di poliadenilazione. Queste modifiche sono generalmente accoppiati per garantire la corretta elaborazione 1 e fortemente aumentare la stabilità del mRNA.
Il 3 'formazione dell'estremità di mammiferi pre-mRNA è generato da taglio endonucleolitico dell'RNA nascente seguita da aggiunta di residui adenilato al 5' spaccati prodotto da poli (A) polimerasi (PAP) 2-4. Nei mammiferi, clivaggio viene realizzato un complesso proteico multicomponente, di circa....
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Protocollo
1. Adeguamento delle cellule aderenti in sospeso
(Questo passaggio è facoltativo. Cellule in sospensione in generale rendere migliori estratti nucleari, tuttavia cellule cresciute in piastre possono anche essere utilizzati.)
- Adattare cellule aderenti per la crescita in sospensione utilizzando MEM modificata di Joklik integrato con siero 5-10% neonato vitello o di siero fetale bovino e 1% di L-glutammina: penicillina-streptomicina. Propagare cellule in fiasche ogiva con un tappo filtro a 37 ° C con 8% di CO 2.
- Quando adattamento cellule, iniziare con 100 ml in un pallone da 500 ml filatrice. Mantenere un min....
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Risultati
Risultati rappresentativi di un saggio di scissione del RNA poly (A) siti di HIV-1 (Figura 2). Possiamo osservare il substrato RNA uncleaved, che è la banda più lenta migrazione nella parte superiore del gel. Il prodotto spaccati specifico è la banda più breve frammento più intensa che corre più veloce nel gel alla dimensione prevista, ed è specificamente assente dal saggio di clivaggio della (A) controllo mutpoly che contiene una mutazione puntiforme nella sequenza poly (mutPolyA) RNA substrato. Posson.......
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Discussione
Il pre-mRNA 3 'di reazione in vitro scissione, effettuate negli estratti nucleari di cellule HeLa o con fattori di scissione frazionati da questi estratti, ha permesso l'identificazione dei fattori scissione core e loro principali complessi 16-21. Molte altre proteine associate a questi fattori sono stati recentemente identificati 22, e la reazione in vitro possono continuare a far luce su come queste proteine contribuiscono alla reazione. Forse perché la reazione .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
SV è grata per il sostegno finanziario dal NIH K22AI077353 e la Fondazione Landenberger. KR ringrazia finanziamenti del NIH (5SC1GM083754).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pallone Celstir da 1 L | Wheaton | 356884 | Diverse dimensioni disponibili |
| Agitatore a bassa velocità a 4 posizioni | VWR | 12621-076 | |
| Centrifuga a secchiello oscillante | Coltro | Allegra x-15R con rotore SX4500 | |
| Ultracentrifuga | Coltro | Beckman Optima L-100 XP Ultra con rotore SW41 | |
| Centrifuga da tavolo 5417R | Eppendorf | Incubatore Thermomixer Refrigerato | |
| Eppendorf | |||
| 250 ml provette coniche | Corning | 430776 | |
| 50 ml provette coniche | BD | Falcon 352098 | |
| Provette da centrifuga ultratrasparenti | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modificato MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Siero fetale bovino | Atlas | F-0500-A | L-glut |
| :pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Cloruro di magnesio | Fisher | BP214-500 | |
| Cloruro di potassio | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glicerolo | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M soluzione di cloruro di sodio | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0,5 M soluzione | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Solfato di ammonio | Fisher | A702-500 | |
| Compresse da cocktail complete per inibitori della proteasi senza EDTA | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Kit di cassette per dialisi | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7.000 0,5 ml-3 ml |
| 15 ml Set di macinatori per tessuti Dounce | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Diverse dimensioni disponibili |
| Espandi kit PCR ad alta fedeltà | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM per nucleotide |
| Kit MaxiScript SP6/T7 | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μ Ci | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel tampone di carico II | Ambion | 8546G | |
| DEPC acqua trattata | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Persolfato di ammonio | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Acetato di ammonio | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrilammide:bis-acrilammide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glicogeno | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% etanolo assoluto 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Fenolo acido: cloroformio | Ambion | 9720 | Per RNA |
| Fluido di scintilazione | Fisher | SX18-4 | |
| Inibitore della RNASI | Promega | N261B | |
| Alcool polivinilico- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatina fosfato | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinasi K | Fisher | BP1700-100 | |
| Unità di sequenziamento regolabile | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Clip per raccoglitori | Deposito ufficio | 838-056 | |
| Lastre di vetro 20 cm x 42 cm | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| Piastre di vetro 20 cm x 22 cm | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| Piastre di raffreddamento in alluminio 20 cm x 42 cm | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| Distanziatori 0,4 mm x 22 cm | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| Distanziatori 0,4 mm x 42 cm | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| Pettine a 8 pozzetti | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| Pettine a 16 pozzetti | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 |
| EA Pettine a 32 pozzetti | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | o SGR-0101 per flacone singolo |
| Punte di caricamento del gel | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μ l |
| Sequenziamento PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5.000 V/500 mA/400 W |
| Essiccatore per gel Modello 583 | Bio-Rad | Modello 583 | |
| Pompa a vuoto Hydrotech per essiccatore di gel | Bio-Rad | ||
| Glogos II Marcatori fosforescenti | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Cassetta per autoradiografia | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 dimensioni disponibili |
Riferimenti
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
- Colgan, D. F., Manley, J. L.....
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Ristampe e permessi
