Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l'attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Synaptic N-metil-D-aspartato-recettori (NMDARs) svolgono un ruolo cruciale nella plasticità sinaptica e la sopravvivenza delle cellule di segnalazione, mentre l'attivazione di NMDARs extrasinaptica può innescare neurodegenerazione e la morte cellulare. Questi cambiamenti dipendono da / attività regolamentata espressione genica dipendente strettamente controllata e, quindi, richiedono una costante comunicazione tra sinapsi e dendriti attivati ​​e il nucleo ^7. Il MAP chinasi ERK1 / 2 sono effettori a valle di NMDARs sinaptiche segnalazione e sono coinvolti nella espressione genica NMDAR-attivazione-indotta, considerando che la segnalazione via NMDAR extrasinaptica non ha o un effetto inibitorio sulla ERK1 / 2 attività di ^8,11.

Ci sono certo numero di proteine ​​che hanno dimostrato di navetta tra dendriti distali e il nucleo. Molte di queste proteine ​​contengono un segnale di localizzazione nucleare e sono attivamente trasportati lungo microtubuli in un dineina e modo importina-dipendente al nucleo ^6,9. Interestingly, alcuni di questi messaggeri solo transito al nucleo in risposta a specifici stimoli sinaptici. Ad esempio, il trasporto retrogrado di ciclico elemento di risposta AMP binding protein 2 (CREB2) è indotta da LTD chimica, ma non LTP ^12. Stimolazione sinaptica NMDAR-dipendente localizzata guida coactivator trascrizionale CREB-regolata (CRTC1) nel nucleo, un processo di traslocazione, che è coinvolto nel lungo termine plasticità ippocampale ^4. E 'stato recentemente dimostrato che la proteina messaggero Giacobbe trasloca al nucleo dopo che entrambi, l'attivazione NMDAR sinaptica e extrasinaptica e regola gene CREB dipendente trascrizione ^5. L'origine sinaptica o extrasinaptica del segnale è codificato in una modificazione post-traslazionale di Giacobbe. Attività sinaptica induce ERK1 / 2 fosforilazione dipendente di Giacobbe a serina cruciale alla posizione 180 (pJacobS 180), che è un requisito per la successiva traslocazione al nucleo nella cultura ippocampale primaria. Inoltre, in CA1 neuroni di acuta fettine di ippocampo pJacobS 180 trasloca nel nucleo dopo Schaffer collaterale LTP ma non LTD ^1,10. pS180 Jacob porta ad un aumento dell'espressione dei geni legati plasticità e l'espressione genica feed torna alla funzione sinaptica. In netto contrasto, Giacobbe che trasloca nel nucleo dopo l'attivazione NMDARs extrasinaptica non è fosforilata in Ser180 e può essere associata a complesso proteico diverso nel nucleo causando 'CREB spento' e una ritrattazione di contatti sinaptici ^10.

Maggior parte degli studi pubblicati sulla importazione nucleare di Synapto-nucleare proteina messenger sono stati condotti in colture primarie neuronali dissociate. Pertanto, sarebbe interessante vedere se questi risultati possono essere riprodotti in fisiologicamente più rilevanti condizioni con fettine di ippocampo in cui la connettività e la funzione neuronale sono molto meglio conservati. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per la valutazione LTP-dependent traslocazione nucleare di messaggeri della proteina mediante immunoblotting. Questo metodo è adatto per analizzare l'attività dipendente fosforilazione di proteine ​​in una frazione nucleare rudimentale anche. In particolare, l'attuale protocollo prevede la preparazione di acuta fettine di ippocampo CA1, induzione, e la registrazione di LTP. Avanti, regione CA1 viene sezionato al microscopio per isolare la regione stimolata. Abbiamo combinato e modificato il protocollo per l'isolamento nucleare fornito da CellLytic nucleare Extraction Kit con le modifiche introdotte dal Zhao e colleghi ^17. La procedura di ottimizzazione comprende la lisi delle regioni CA1 sezionati in tampone ipotonico permettendo rigonfiamento delle cellule e il rilascio di nuclei. Lisi cellulare e la morfologia nuclei possono essere determinati mediante esame microscopico. Arricchimento nucleare viene raggiunto da una breve fase di centrifugazione. Immunoblotting con anticorpi contro NeuN e NSE2, marcatori specifici delle frazioni nucleari e citosoliche, indica che questo approccio può essere utilizzato come un velocee il protocollo riproducibile per isolare queste frazioni subcellulari e studiare molto labili modificazioni post-traduzionali come fosforilazione proteica. Inoltre, questo metodo è vantaggioso per piccoli campioni di tessuto provenienti da regioni CA1 sezionati di fettine ippocampali e può essere usato in combinazione per immunoistochimica di fettine ippocampali.

1 Preparazione di acuta fettine di ippocampo di adulti Rat Brain

1. Anestetizzare ratti con isoflurano. ATTENZIONE: Eseguire la procedura utilizzando un exicator chiuso, non inalare isoflurano. Assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato.
2. Decapitare il ratto, rapidamente isolare il cervello, e immergerlo in precarbonated (95% O _2/5% di CO miscela di gas ₂₎ ghiacciata soluzione Gey (composizione in mM: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O , 0.3 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 11 MgCl ₂ · 6H ₂ O, 0.23 KH ₂ PO _4, 0.8 Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 5 Glucosio · H ₂ O, 25 HEPES, 22 NaHCO _3, pH 7.32) per 30 min ^1,2,10,16.
3. Rimuovere il cervelletto e la parte della corteccia entorinale. Separare gli emisferi corticali con un taglio medio-sagittale, quindi posizionare ciascun emisfero in giù sulla sua superficie mediale. Successivamente farea 50-70 ° taglio (50-70 ° trasversale) lungo il bordo dorsale di ogni emisfero ^13,14.
4. Colla ciascun emisfero con la superficie appena tagliata sulla piattaforma affettatura del sistema di sezionamento. La piattaforma dovrebbe essere coperto da una soluzione di Gey ghiacciata precarbogenated.
5. Tagliare 350 micron 50-70 ° fette trasversali da anteriore a posteriore lato utilizzando un vibratome regolata per ridurre al minimo z oscillazione. La formazione dell'ippocampo, corteccia entorinale e subicular, così come le cortecce che si trovano dorsolaterale all'ippocampo faranno parte delle fette utilizzati per esperimenti ^13,14.
6. Trasferimento fettine di ippocampo a forma di U e sommerse tipo incubatrice e incubare per almeno 2 ore a 32 ° C con carbogenated liquido cerebrospinale artificiale (ACSF contenente, in mM: 110 NaCl, 2.5 KCl, 2,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 1.5 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 1.24 KH ₂ PO _4, 10 Glucosio · H ₂O, 27.4 NaHCO _3, pH 7,3) ^1,2,10,16.

2 Posizionamento Elettrodi, Baseline registrazione, e induzione di LTP

1. Trasferire la fetta dell'ippocampo di una camera di registrazione di tipo sommerso montato sotto un microscopio. Profumato (6-7 ml / min) con ACSF carbogenated per almeno 30 minuti a 32 ° C.
2. Preparare microelettrodi capillare di vetro riempito con ACSF (resistenza di punta è di 3-5 MW).
3. Mettere a microelettrodi di vetro riempito con ACSF nelle fibre CA1 Schaffer-collaterali per la stimolazione e nel radiatum CA1 strato per fEPSP registrazione ^1,2,10 (Figura 2). La distanza tra gli elettrodi deve essere di circa 300 micron.
4. Evoke campo eccitatori postsinaptici Potenziali (fEPSPs) dalla stimolazione delle fibre Schaffer-collaterali con impulsi di corrente rettangolari bifasici (200 msec / polarità) in una gamma di 3-4 V.
5. Eseguire il test di stimolazione massima misurando la inprapporto ut-uscita e definire la forza di stimolazione come il 40% dei valori massimi fEPSP-pendenza ottenuti e mantenerla costante durante l'esperimento.
6. Iniziare la registrazione di base per almeno 15 minuti dopo il test di stimolazione massima. Misurare le risposte a stimoli testare ogni minuto tutto l'esperimento. Eseguire registrazioni di base con la stimolazione a bassa frequenza.
7. Registrare la linea di base per almeno 30 min.
8. Per l'induzione tardo-LTP applicare ad alta frequenza 100 Hz tetanization composto da tre treni di stimolo 1 sec a 100 Hz con un intervallo di intertrain 5 min. Per aumentare il campo di stimolazione all'interno CA1 regione 5 micron bicucullina può essere lavato in 2 minuti prima tetanization e devono essere lavati subito dopo l'ultimo tetanization.

3 Raccolta di fette dopo induzione di LTP e Snap congelamento

1. Arresto LTP registrazione 2 min o 30 min dopo tre treni di stimolazione tetanica inducono tardo-LTP.
2. Raccogliere ogni fetta in una provetta da 1,5 ml e conservare a -80 ° C.

4 Isolamento di frazioni nucleari arricchiti dalla regione CA1 dell'ippocampo

1. Prendere 1,5 ml provette Eppendorf con le fette congelate da -80 ° C e tenerli su ghiaccio.
2. Aggiungere 0,5 ml di fresco freddo TBS tampone contenente proteasi (PI) e fosfatasi (PS) inibitori, nel tubo. Incubare per 2-3 minuti e trasferire ad uno stereomicroscopio. ATTENZIONE: Usare guanti protettivi e un camice da laboratorio mentre si lavora con PI e PS.
3. Sezionare la regione CA1 strato piramidale dell'ippocampo con due aghi. Utilizzare un ago per tenere la fetta con lo stereomicroscopio e il secondo ago per tagliare l'area CA1.
4. Raccogliere il CA sezionato1 Le regioni da 5 fette (per ogni gruppo) in una nuova provetta da 1,5 ml contenente 50 ml di tampone di lisi (1X tampone di lisi ipotonico contenente, in mM: 10 HEPES, 1.5 _MgCl2, 10 KCl, pH 7.9, con PI e PS). Si noti che questa quantità di materiale sarà sufficiente per eseguire 2-3 immunoblot.
5. Omogeneizzare i tessuti raccolti da un'attenta pipettando su e giù. Utilizzare una pipetta 200 microlitri. Incubare il lisato in ghiaccio per 5-7 minuti per consentire alle cellule a gonfiarsi.
6. Prendete 2 ml di lisato, goccia su un vetrino microscopico, e visualizzare il gonfiore delle cellule al microscopio in campo chiaro. Con una corretta gonfiore delle cellule nuclei appaiono come rotondo strutture intatte.
7. Raccogliere 20 ml di campione in una nuova provetta da 1,5 ml come 'frazione omogeneizzato'. Aggiungere 8 ml di denaturazione 4x tampone campione SDS.
8. Centrifugare i restanti lisati a 11.000 rpm per 1 min.
9. Raccogliere con cautela il surnatante dalla cima ('frazione citosolica'), transfer in un nuovo tubo e aggiungere 20 ml di tampone campione 4x.
10. Risospendere il pellet in 60 ml di tampone ipotonico e aggiungere 20 ml di tampone campione 4x. Questa frazione è indicato come un 'frazione arricchita nucleare'.
11. Omogenato, citosolico, e le frazioni arricchite nucleari possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C per immunoblotting tardi.

5. Immunoblotting semiquantitativa di proteine ​​Synapto-nucleari

1. Scongelare i campioni e farli bollire per 5 min a 95 ° C.
2. Prendere 5 ml di ogni frazione e determinare la concentrazione di proteine ​​da amido di prova nero o prova BCA.
3. Carico pari quantità di campioni di proteine ​​da omogenato, frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari su SDS-PAGE. I campioni di controllo e fette LTP devono essere posizionati sullo stesso gel per il confronto diretto.
4. Eseguire una procedura di western-blotting standard (trasferimento umido è consigliato).
5. Sonda le membrane con tegli anticorpi di scelta. Successivamente le stesse macchie (o gli stessi campioni eseguiti in parallelo) possono essere sondati con un pennarello citoplasmatica - enolase2 neurone specifica (NSE2) e marcatore nucleare - NeuN e un anticorpo actina come controllo di caricamento.

Analisi 6. Dati

1. L'efficienza di induzione di LTP può essere analizzato dal software Clampfit. La pendenza media di registrazioni di base è stato confrontato con le piste dopo tetanization utilizzando ANOVA a due vie, p <0.05 è stato considerato significativamente differenti. I valori di pendenza fEPSP sono stati rappresentati nei diagrammi come media ± SEM
2. Per la quantificazione di immunoblot, scanditi il ​​film autoradiografica e analizzare la densità integrata delle bande proteiche da ImageJ o bande di fluorescenza con un sistema di Licor. I valori delle bande immunoreattive devono essere normalizzati per il controllo di carico e assorbente. Per il confronto del controllo e gruppi di LTP può essere utilizzato un nonparametrical Mann-Whitney U-test.

Tabella 1 Buffer.

Abbiamo precedentemente dimostrato che la Synapto-nucleare proteina messenger Giacobbe si accumula nel nucleo dopo l'induzione di LTP, ma non LTD 1. Inoltre, traslocazione di Giacobbe dopo stimolazione sinaptica richiede l'attivazione di MAPK ERK1 / 2 e la fosforilazione di Giacobbe a Ser180 (Figura 1). Fosforilata Jacob trasloca al nucleo in modo importina-dipendente e lo stato fosforilato può essere conservato per lunghi periodi di tempo prolungati per associazione con il filamento intermedio αinternexin 15 (Figura 1). Il fosfo-stato di Giacobbe è importante per l'espressione di geni di attività-dipendente e la sopravvivenza cellulare. È interessante notare che, attivazione di NMDARs extrasinaptica spinge anche Jacob nel nucleo, ma in questo caso Giacobbe non è fosforilata in Ser180 e l'accumulo nucleare induce CREB 'spento' 5,10. I risultati sopra descritti sono stati ottenuti da Protocols stabiliti nel nostro recente studio (vedi Karpova et al. 10 per una descrizione dettagliata del modello).

Per dimostrare che Giacobbe trasloca nel nucleo dopo induzione di LTP, abbiamo indotto e misurato l'induzione di Schaffer collaterale fEPSP potenziamento in fettine di ippocampo acute e successivamente isolati nuclei neuronali da neuroni CA1 (figure 2 e 3). Abbiamo confrontato due diversi punti di tempo dopo l'applicazione della stimolazione ad alta frequenza (2 min e 30 min) e registrato l'induzione di LTP per ogni fetta che è stata successivamente trattati per l'isolamento nucleare e Western blotting (figure 2 e 3). Arricchimento del marcatore nucleare neuronale NeuN può essere visto nella frazione arricchita nucleare preparata dalla regione CA1 sezionato, mentre citosolica marcatore enolase2 neurone specifica (NSE) è presente soprattutto nella frazione surnatante ottenuto dopo centrifugazione del lisato cells (Figura 4A). La specificità di anticorpi pS180 Jacob è stato caratterizzato in precedenza (per i dettagli vedi Karpova et al. 10). livelli pS180 Jacob è rimasto inalterato in totale omogenati di proteine ​​CA1 e nel arricchito frazione di 2 min nucleare dopo tetanization (Figura 4B), ma abbiamo trovato un aumento significativo pJacobS 180 immunoreattività 30 minuti dopo l'induzione di LTP (Figura 4C), confermando che Jacob translocating al nucleo in questo modello plasticità cellulare è fosforilata in Ser180.

Figura 1 Jacob fosforilata in S180 codifica all'origine sinaptica di segnali NMDARs. Stimolazione tetanica delle fibre collaterali di Schaffer dell'ippocampo risultati in attivazione di NMDARs sinaptiche e la successiva attivazione di MAPKERK1 / 2 cascata di segnalazione. Attivato ERK1 / 2 si lega e fosforila Giacobbe a serina 180 e Jacob-ERK1 complesso / 2 trasloca nel nucleo e questo correla con l'attività CREB maggiore e l'attivazione della plasticità legati espressione genica.

Figura 2 Attrezzature e strumenti utilizzati per l'induzione LTP e sezionare la regione CA1 di fettine di ippocampo. A) Vibratome usato per la preparazione di fettine di ippocampo acute (1 - Vibratome) B1-2) Elettrofisiologia e configurazione di imaging (2 - microscopio; 3 - Micromanipolatore e sistema di perfusione; 4 - elettrodi Ricodifica; 5 - elettrodo di stimolazione; 6 - Acqua lente obiettiva ; 7 - Fetta supporto con fetta dell'ippocampo) C) Impianti utilizzati per la dissezione della regione CA1 di fettine di ippocampo (8 Stereomicroscope; 9 - Siringa con aghi; 10 - Piccole forbici chirurgiche; 11 - bisturi; 12 - plastica pipetta Pasteur, 13 - spatola sottile; 14-100 mm piatto cultura di plastica riempito di ghiaccio-acqua, e 40 millimetri piatto cultura plastica utilizzata per la dissezione di fette.

Figura 3 Cartoon dimostrare la procedura sperimentale. Numeri indicano passi nel protocollo. 2,1-2,8) Una fetta dell'ippocampo acuta nella camera sommersa con elettrodi di vetro posizionati nella radiatum falda per il potenziamento di Schaffer collaterale-CA1 Sinapsi. L'inserto rappresenta le tracce analogiche campione fEPSP, la barra orizzontale indica 5 msec e la barra verticale indica 0,5 mV. 3.3) Le fette sono stati raccolti in provette da 1,5 ml dopoRegistrazione LTP e Snap congelato. 4.3) Dissezione della regione CA1 da adulti fettine di ippocampo di ratto. 4,4-4,5) regioni CA1 omogeneizzati in tampone di lisi ipotonica, che causa rigonfiamento osmotico delle cellule e il rilascio di nuclei. 4.8) Centrifugazione di lisati a 11.000 rpm per 1 min. 4.10) Raccolta delle frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari per immunoblotting. 5.3) Caricamento di frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari su SDS-PAGE e successiva occidentale-blotting standard.

Figura 4 induzione di LTP CA1 porta all'accumulo di pJacS180 nel nucleo. A) immunoblot per omogenato, citosolica e frazioni arricchite nucleari di CA1 lisato sondato con citosolica e marcatori nucleari. B) immunoblot analisi del livello di pJac-S180 in omogenato 2 min e 30 min dopo induction di tetanization. C) immunoblot analisi del livello pJacS180 nel nucleare arricchito frazione 2 min e min dopo tetanization. Questi risultati fanno parte del grafico quantificazione pubblicato nella Karpova et al 10. Questi immunoblot rappresentativi non sono incluse nel alla pubblicazione originale.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.