Forniamo un protocollo dettagliato per l'induzione del potenziamento a lungo termine nella regione CA1 dell'ippocampo e il successivo isolamento di frazioni arricchite nucleari dalla zona tetanized della fetta. Questo approccio può essere utilizzato per determinare l'attività dipendente di importazione proteina nucleare in modelli cellulari di apprendimento e memoria.
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Articolo metodologico
Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l'attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine Synapto-nucleari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studiare attività di espressione della proteina dipendente, traslocazione subcellulare, o fosforilazione è essenziale per comprendere i meccanismi cellulari alla base della plasticità sinaptica. Il potenziamento a lungo termine (LTP) e depressione a lungo termine (LTD) indotta in fettine di ippocampo acute sono ampiamente accettati come modelli cellulari di apprendimento e memoria. Ci sono numerosi studi che utilizzano approcci di imaging cellulare o immunoistochimica dal vivo per visualizzare l'attività dinamica delle proteine dipendenti. Tuttavia questi metodi si basano sulla idoneità degli anticorpi per immunoistochimica o sovraespressione di proteine fluorescenza-tagged in singoli neuroni. Immunoblotting di proteine è un metodo alternativo che fornisce una conferma indipendente dei risultati. Il primo fattore limitante nella preparazione di frazioni subcellulari di singoli fettine di ippocampo tetanized è la bassa quantità di materiale. In secondo luogo, la procedura di gestione è fondamentale perché manipolazioni, anche molto brevi e minori di living fette potrebbe indurre l'attivazione di alcune cascate di segnalazione. Qui si descrive un flusso di lavoro ottimizzato al fine di ottenere un quantitativo sufficiente della frazione arricchita nucleare di purezza sufficiente dalla regione CA1 di fettine di ippocampo acute di cervello di ratto. Come esempio rappresentativo mostriamo che la ERK1 / 2 forma fosforilata della proteina messaggero Synapto-nucleare Jacob trasloca attivamente al nucleo dopo induzione di LTP e può essere rilevato in una frazione arricchita nucleare dai neuroni CA1.
Introduzione
Synaptic N-metil-D-aspartato-recettori (NMDARs) svolgono un ruolo cruciale nella plasticità sinaptica e la sopravvivenza delle cellule di segnalazione, mentre l'attivazione di NMDARs extrasinaptica può innescare neurodegenerazione e la morte cellulare. Questi cambiamenti dipendono da / attività regolamentata espressione genica dipendente strettamente controllata e, quindi, richiedono una costante comunicazione tra sinapsi e dendriti attivati e il nucleo 7. Il MAP chinasi ERK1 / 2 sono effettori a valle di NMDARs sinaptiche segnalazione e sono coinvolti nella espressione genica NMDAR-attivazione-indotta, considerando che la segnalazione via NMDAR extr....
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Protocollo
1 Preparazione di acuta fettine di ippocampo di adulti Rat Brain
- Anestetizzare ratti con isoflurano. ATTENZIONE: Eseguire la procedura utilizzando un exicator chiuso, non inalare isoflurano. Assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato.
- Decapitare il ratto, rapidamente isolare il cervello, e immergerlo in precarbonated (95% O 2/5% di CO miscela di gas 2) ghiacciata soluzione Gey (composizione in mM: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6H 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO
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Risultati
Abbiamo precedentemente dimostrato che la Synapto-nucleare proteina messenger Giacobbe si accumula nel nucleo dopo l'induzione di LTP, ma non LTD 1. Inoltre, traslocazione di Giacobbe dopo stimolazione sinaptica richiede l'attivazione di MAPK ERK1 / 2 e la fosforilazione di Giacobbe a Ser180 (Figura 1). Fosforilata Jacob trasloca al nucleo in modo importina-dipendente e lo stato fosforilato può essere conservato per lunghi periodi di tempo prolungati per associazione con il filamento .......
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Discussione
I passi descritti nel protocollo di cui sopra forniscono una guida come preparare ippocampale acuta affettato da giovani o adulti ratti, induce e registrare LTP, rapidamente sezionare zona stimolata di slice, e preparare frazione arricchita nucleare per lo studio di attività dinamica delle proteine dipendenti. Questo approccio deriva dalla combinazione di diversi metodi utilizzati indipendentemente l'uno dall'altro. Abbiamo ottimizzato il flusso di lavoro e fornire sufficienti dettagli per il principiante di c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), dalla sovvenzione DIP (MRK), dall'EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), dal Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK e SB), MM ha ricevuto una borsa di studio a lungo termine dall'Organizzazione Europea di Biologia Molecolare (EMBO, ALTF 884-2011) e Marie-Curie IEF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscopio | Leica S4E, Germania | ||
| Vibrotomo | Leica VT1000S, Germania | ||
| Stimolatore di impulsi isolato | A-M Sistemi, USA | Centrifuga modello 2100 | |
| Sistema Thermo Scientific | |||
| SDS-PAGE Biorad | |||
| Cooler | Julabo | ||
| Microscopio a campo chiaro | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Incubatore per colture cellulari | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipolatore | Luigs & Neumann, SM-5, Germania | ||
| Camera di blotting e fornitore di energia elettrica | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Camera di registrazione di tipo sommerso | su | ||
| a forma di U e incubatore di tipo sommerso. | su misura | ||
| Piccole forbici | |||
| Bisturi | |||
| Spatola | |||
| Pipetta | |||
| Piatto di coltura in plastica. | |||
| Siringa | |||
| per becher | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2· 2H2O | Merck | 1.02382.0500 | analisi pro |
| MgSO4· 2H2O | Merck | 5886.05 | pro analisi |
| MgCl2· 6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | per la biologia molecolare |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | per la biologia molecolare |
| Na2HPO4· 2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra puro |
| · H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | per biologia molecolare |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥ 99,5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Anticorpi primari | Numero di catalogo dell'azienda | Specie | |
| pJac-s180 | Biogenes | coniglio (diluito 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | topo (diluito 1:1.000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | coniglio (diluito 1:1.000) |
| Beta-actina | Sigma | A-5441 | topo (diluito 1:5.000) |
| Anticorpi secondari | Numero di catalogo dell'azienda | Specie | |
| IgG HRP coniugato | DAKO | capra anti-topo (1:5.000) | |
| IgG HRP coniugato | NEB | capra anti-coniglio (1:5.000) | |
Riferimenti
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276(2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T.
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Ristampe e permessi
