Forniamo un protocollo dettagliato per l'induzione del potenziamento a lungo termine nella regione CA1 dell'ippocampo e il successivo isolamento di frazioni arricchite nucleari dalla zona tetanized della fetta. Questo approccio può essere utilizzato per determinare l'attività dipendente di importazione proteina nucleare in modelli cellulari di apprendimento e memoria.
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Articolo metodologico
Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l'attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine Synapto-nucleari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studiare attività di espressione della proteina dipendente, traslocazione subcellulare, o fosforilazione è essenziale per comprendere i meccanismi cellulari alla base della plasticità sinaptica. Il potenziamento a lungo termine (LTP) e depressione a lungo termine (LTD) indotta in fettine di ippocampo acute sono ampiamente accettati come modelli cellulari di apprendimento e memoria. Ci sono numerosi studi che utilizzano approcci di imaging cellulare o immunoistochimica dal vivo per visualizzare l'attività dinamica delle proteine dipendenti. Tuttavia questi metodi si basano sulla idoneità degli anticorpi per immunoistochimica o sovraespressione di proteine fluorescenza-tagged in singoli neuroni. Immunoblotting di proteine è un metodo alternativo che fornisce una conferma indipendente dei risultati. Il primo fattore limitante nella preparazione di frazioni subcellulari di singoli fettine di ippocampo tetanized è la bassa quantità di materiale. In secondo luogo, la procedura di gestione è fondamentale perché manipolazioni, anche molto brevi e minori di living fette potrebbe indurre l'attivazione di alcune cascate di segnalazione. Qui si descrive un flusso di lavoro ottimizzato al fine di ottenere un quantitativo sufficiente della frazione arricchita nucleare di purezza sufficiente dalla regione CA1 di fettine di ippocampo acute di cervello di ratto. Come esempio rappresentativo mostriamo che la ERK1 / 2 forma fosforilata della proteina messaggero Synapto-nucleare Jacob trasloca attivamente al nucleo dopo induzione di LTP e può essere rilevato in una frazione arricchita nucleare dai neuroni CA1.
Introduzione
Synaptic N-metil-D-aspartato-recettori (NMDARs) svolgono un ruolo cruciale nella plasticità sinaptica e la sopravvivenza delle cellule di segnalazione, mentre l'attivazione di NMDARs extrasinaptica può innescare neurodegenerazione e la morte cellulare. Questi cambiamenti dipendono da / attività regolamentata espressione genica dipendente strettamente controllata e, quindi, richiedono una costante comunicazione tra sinapsi e dendriti attivati e il nucleo 7. Il MAP chinasi ERK1 / 2 sono effettori a valle di NMDARs sinaptiche segnalazione e sono coinvolti nella espressione genica NMDAR-attivazione-indotta, considerando che la segnalazione via NMDAR extrasinaptica non ha o un effetto inibitorio sulla ERK1 / 2 attività di 8,11.
Ci sono certo numero di proteine che hanno dimostrato di navetta tra dendriti distali e il nucleo. Molte di queste proteine contengono un segnale di localizzazione nucleare e sono attivamente trasportati lungo microtubuli in un dineina e modo importina-dipendente al nucleo 6,9. Interestingly, alcuni di questi messaggeri solo transito al nucleo in risposta a specifici stimoli sinaptici. Ad esempio, il trasporto retrogrado di ciclico elemento di risposta AMP binding protein 2 (CREB2) è indotta da LTD chimica, ma non LTP 12. Stimolazione sinaptica NMDAR-dipendente localizzata guida coactivator trascrizionale CREB-regolata (CRTC1) nel nucleo, un processo di traslocazione, che è coinvolto nel lungo termine plasticità ippocampale 4. E 'stato recentemente dimostrato che la proteina messaggero Giacobbe trasloca al nucleo dopo che entrambi, l'attivazione NMDAR sinaptica e extrasinaptica e regola gene CREB dipendente trascrizione 5. L'origine sinaptica o extrasinaptica del segnale è codificato in una modificazione post-traslazionale di Giacobbe. Attività sinaptica induce ERK1 / 2 fosforilazione dipendente di Giacobbe a serina cruciale alla posizione 180 (pJacobS 180), che è un requisito per la successiva traslocazione al nucleo nella cultura ippocampale primaria. Inoltre, in CA1 neuroni di acuta fettine di ippocampo pJacobS 180 trasloca nel nucleo dopo Schaffer collaterale LTP ma non LTD 1,10. pS180 Jacob porta ad un aumento dell'espressione dei geni legati plasticità e l'espressione genica feed torna alla funzione sinaptica. In netto contrasto, Giacobbe che trasloca nel nucleo dopo l'attivazione NMDARs extrasinaptica non è fosforilata in Ser180 e può essere associata a complesso proteico diverso nel nucleo causando 'CREB spento' e una ritrattazione di contatti sinaptici 10.
Maggior parte degli studi pubblicati sulla importazione nucleare di Synapto-nucleare proteina messenger sono stati condotti in colture primarie neuronali dissociate. Pertanto, sarebbe interessante vedere se questi risultati possono essere riprodotti in fisiologicamente più rilevanti condizioni con fettine di ippocampo in cui la connettività e la funzione neuronale sono molto meglio conservati. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per la valutazione LTP-dependent traslocazione nucleare di messaggeri della proteina mediante immunoblotting. Questo metodo è adatto per analizzare l'attività dipendente fosforilazione di proteine in una frazione nucleare rudimentale anche. In particolare, l'attuale protocollo prevede la preparazione di acuta fettine di ippocampo CA1, induzione, e la registrazione di LTP. Avanti, regione CA1 viene sezionato al microscopio per isolare la regione stimolata. Abbiamo combinato e modificato il protocollo per l'isolamento nucleare fornito da CellLytic nucleare Extraction Kit con le modifiche introdotte dal Zhao e colleghi 17. La procedura di ottimizzazione comprende la lisi delle regioni CA1 sezionati in tampone ipotonico permettendo rigonfiamento delle cellule e il rilascio di nuclei. Lisi cellulare e la morfologia nuclei possono essere determinati mediante esame microscopico. Arricchimento nucleare viene raggiunto da una breve fase di centrifugazione. Immunoblotting con anticorpi contro NeuN e NSE2, marcatori specifici delle frazioni nucleari e citosoliche, indica che questo approccio può essere utilizzato come un velocee il protocollo riproducibile per isolare queste frazioni subcellulari e studiare molto labili modificazioni post-traduzionali come fosforilazione proteica. Inoltre, questo metodo è vantaggioso per piccoli campioni di tessuto provenienti da regioni CA1 sezionati di fettine ippocampali e può essere usato in combinazione per immunoistochimica di fettine ippocampali.
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Protocollo
1 Preparazione di acuta fettine di ippocampo di adulti Rat Brain
- Anestetizzare ratti con isoflurano. ATTENZIONE: Eseguire la procedura utilizzando un exicator chiuso, non inalare isoflurano. Assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato.
- Decapitare il ratto, rapidamente isolare il cervello, e immergerlo in precarbonated (95% O 2/5% di CO miscela di gas 2) ghiacciata soluzione Gey (composizione in mM: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6H 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucosio · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7.32) per 30 min 1,2,10,16.
- Rimuovere il cervelletto e la parte della corteccia entorinale. Separare gli emisferi corticali con un taglio medio-sagittale, quindi posizionare ciascun emisfero in giù sulla sua superficie mediale. Successivamente farea 50-70 ° taglio (50-70 ° trasversale) lungo il bordo dorsale di ogni emisfero 13,14.
- Colla ciascun emisfero con la superficie appena tagliata sulla piattaforma affettatura del sistema di sezionamento. La piattaforma dovrebbe essere coperto da una soluzione di Gey ghiacciata precarbogenated.
- Tagliare 350 micron 50-70 ° fette trasversali da anteriore a posteriore lato utilizzando un vibratome regolata per ridurre al minimo z oscillazione. La formazione dell'ippocampo, corteccia entorinale e subicular, così come le cortecce che si trovano dorsolaterale all'ippocampo faranno parte delle fette utilizzati per esperimenti 13,14.
- Trasferimento fettine di ippocampo a forma di U e sommerse tipo incubatrice e incubare per almeno 2 ore a 32 ° C con carbogenated liquido cerebrospinale artificiale (ACSF contenente, in mM: 110 NaCl, 2.5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glucosio · H 2O, 27.4 NaHCO 3, pH 7,3) 1,2,10,16.
2 Posizionamento Elettrodi, Baseline registrazione, e induzione di LTP
- Trasferire la fetta dell'ippocampo di una camera di registrazione di tipo sommerso montato sotto un microscopio. Profumato (6-7 ml / min) con ACSF carbogenated per almeno 30 minuti a 32 ° C.
- Preparare microelettrodi capillare di vetro riempito con ACSF (resistenza di punta è di 3-5 MW).
- Mettere a microelettrodi di vetro riempito con ACSF nelle fibre CA1 Schaffer-collaterali per la stimolazione e nel radiatum CA1 strato per fEPSP registrazione 1,2,10 (Figura 2). La distanza tra gli elettrodi deve essere di circa 300 micron.
- Evoke campo eccitatori postsinaptici Potenziali (fEPSPs) dalla stimolazione delle fibre Schaffer-collaterali con impulsi di corrente rettangolari bifasici (200 msec / polarità) in una gamma di 3-4 V.
- Eseguire il test di stimolazione massima misurando la inprapporto ut-uscita e definire la forza di stimolazione come il 40% dei valori massimi fEPSP-pendenza ottenuti e mantenerla costante durante l'esperimento.
- Iniziare la registrazione di base per almeno 15 minuti dopo il test di stimolazione massima. Misurare le risposte a stimoli testare ogni minuto tutto l'esperimento. Eseguire registrazioni di base con la stimolazione a bassa frequenza.
- Registrare la linea di base per almeno 30 min.
- Per l'induzione tardo-LTP applicare ad alta frequenza 100 Hz tetanization composto da tre treni di stimolo 1 sec a 100 Hz con un intervallo di intertrain 5 min. Per aumentare il campo di stimolazione all'interno CA1 regione 5 micron bicucullina può essere lavato in 2 minuti prima tetanization e devono essere lavati subito dopo l'ultimo tetanization.
3 Raccolta di fette dopo induzione di LTP e Snap congelamento
- Arresto LTP registrazione 2 min o 30 min dopo tre treni di stimolazione tetanica inducono tardo-LTP.
- a rimuovere gli elettrodi e velocemente trasferire la fetta su una piattaforma di metallo precold messo in ghiaccio secco. Ripetere la procedura per una fetta di controllo tenuto in incubatrice a forma di U. ATTENZIONE: Utilizzare guanti durante il lavoro con ghiaccio secco.
- Raccogliere ogni fetta in una provetta da 1,5 ml e conservare a -80 ° C.
4 Isolamento di frazioni nucleari arricchiti dalla regione CA1 dell'ippocampo
- Prendere 1,5 ml provette Eppendorf con le fette congelate da -80 ° C e tenerli su ghiaccio.
- Aggiungere 0,5 ml di fresco freddo TBS tampone contenente proteasi (PI) e fosfatasi (PS) inibitori, nel tubo. Incubare per 2-3 minuti e trasferire ad uno stereomicroscopio. ATTENZIONE: Usare guanti protettivi e un camice da laboratorio mentre si lavora con PI e PS.
- Sezionare la regione CA1 strato piramidale dell'ippocampo con due aghi. Utilizzare un ago per tenere la fetta con lo stereomicroscopio e il secondo ago per tagliare l'area CA1.
- Raccogliere il CA sezionato1 Le regioni da 5 fette (per ogni gruppo) in una nuova provetta da 1,5 ml contenente 50 ml di tampone di lisi (1X tampone di lisi ipotonico contenente, in mM: 10 HEPES, 1.5 MgCl2, 10 KCl, pH 7.9, con PI e PS). Si noti che questa quantità di materiale sarà sufficiente per eseguire 2-3 immunoblot.
- Omogeneizzare i tessuti raccolti da un'attenta pipettando su e giù. Utilizzare una pipetta 200 microlitri. Incubare il lisato in ghiaccio per 5-7 minuti per consentire alle cellule a gonfiarsi.
- Prendete 2 ml di lisato, goccia su un vetrino microscopico, e visualizzare il gonfiore delle cellule al microscopio in campo chiaro. Con una corretta gonfiore delle cellule nuclei appaiono come rotondo strutture intatte.
- Raccogliere 20 ml di campione in una nuova provetta da 1,5 ml come 'frazione omogeneizzato'. Aggiungere 8 ml di denaturazione 4x tampone campione SDS.
- Centrifugare i restanti lisati a 11.000 rpm per 1 min.
- Raccogliere con cautela il surnatante dalla cima ('frazione citosolica'), transfer in un nuovo tubo e aggiungere 20 ml di tampone campione 4x.
- Risospendere il pellet in 60 ml di tampone ipotonico e aggiungere 20 ml di tampone campione 4x. Questa frazione è indicato come un 'frazione arricchita nucleare'.
- Omogenato, citosolico, e le frazioni arricchite nucleari possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C per immunoblotting tardi.
5. Immunoblotting semiquantitativa di proteine Synapto-nucleari
- Scongelare i campioni e farli bollire per 5 min a 95 ° C.
- Prendere 5 ml di ogni frazione e determinare la concentrazione di proteine da amido di prova nero o prova BCA.
- Carico pari quantità di campioni di proteine da omogenato, frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari su SDS-PAGE. I campioni di controllo e fette LTP devono essere posizionati sullo stesso gel per il confronto diretto.
- Eseguire una procedura di western-blotting standard (trasferimento umido è consigliato).
- Sonda le membrane con tegli anticorpi di scelta. Successivamente le stesse macchie (o gli stessi campioni eseguiti in parallelo) possono essere sondati con un pennarello citoplasmatica - enolase2 neurone specifica (NSE2) e marcatore nucleare - NeuN e un anticorpo actina come controllo di caricamento.
Analisi 6. Dati
- L'efficienza di induzione di LTP può essere analizzato dal software Clampfit. La pendenza media di registrazioni di base è stato confrontato con le piste dopo tetanization utilizzando ANOVA a due vie, p <0.05 è stato considerato significativamente differenti. I valori di pendenza fEPSP sono stati rappresentati nei diagrammi come media ± SEM
- Per la quantificazione di immunoblot, scanditi il film autoradiografica e analizzare la densità integrata delle bande proteiche da ImageJ o bande di fluorescenza con un sistema di Licor. I valori delle bande immunoreattive devono essere normalizzati per il controllo di carico e assorbente. Per il confronto del controllo e gruppi di LTP può essere utilizzato un nonparametrical Mann-Whitney U-test.
| Nome del buffer | Reagente | Concentrazione (mM) | Quantità | Commenti / Descrizione |
| Di Gey soluzione (pH: 7.3 ~ 7.4) | NaCl | 130 | 7.6 g | filtrazione sterile |
| 1.000 ml | KCl | 4.9 | 0.37 g | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1.5 | 0.22 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 0.3 | 0,0739 g | ||
| MgCl 2 · 6H 2 O | 11 | 2.24 g | ||
| KH 2 PO 4 | 0.23 | 0,0313 g | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0.8 | 0,2145 g | ||
| Glucosio · H 2 O | 5 | 0,9909 g | ||
| HEPES | 25 | 5.96 g | ||
| NaHCO3 | 22 | 1.85 g | ||
| ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) | NaCl | 110 | 6,428 g | filtrazione sterile |
| 1.000 ml | KCl | 2.5 | 0,1865 g | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 2.5 | 0,368 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 1.5 | 0,370 g | ||
| KH 2 PO 4 | 1.24 | 0,169 g | ||
| Glucosio · H 2 O | 10 | 1,9817 g | ||
| NaHCO3 | 27.4 | 2.3 g | ||
| 1x ipotonico tampone (pH: 7,9) | HEPES | 10 | 0.23 g | |
| 100 ml | MgCl 2 · 6H 2 O | 1.5 | 0,0304 g | |
| KCl | 10 | 0,07455 g |
Tabella 1 Buffer.
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Risultati
Abbiamo precedentemente dimostrato che la Synapto-nucleare proteina messenger Giacobbe si accumula nel nucleo dopo l'induzione di LTP, ma non LTD 1. Inoltre, traslocazione di Giacobbe dopo stimolazione sinaptica richiede l'attivazione di MAPK ERK1 / 2 e la fosforilazione di Giacobbe a Ser180 (Figura 1). Fosforilata Jacob trasloca al nucleo in modo importina-dipendente e lo stato fosforilato può essere conservato per lunghi periodi di tempo prolungati per associazione con il filamento ...
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Discussione
I passi descritti nel protocollo di cui sopra forniscono una guida come preparare ippocampale acuta affettato da giovani o adulti ratti, induce e registrare LTP, rapidamente sezionare zona stimolata di slice, e preparare frazione arricchita nucleare per lo studio di attività dinamica delle proteine dipendenti. Questo approccio deriva dalla combinazione di diversi metodi utilizzati indipendentemente l'uno dall'altro. Abbiamo ottimizzato il flusso di lavoro e fornire sufficienti dettagli per il principiante di c...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), dalla sovvenzione DIP (MRK), dall'EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), dal Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK e SB), MM ha ricevuto una borsa di studio a lungo termine dall'Organizzazione Europea di Biologia Molecolare (EMBO, ALTF 884-2011) e Marie-Curie IEF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscopio | Leica S4E, Germania | ||
| Vibrotomo | Leica VT1000S, Germania | ||
| Stimolatore di impulsi isolato | A-M Sistemi, USA | Centrifuga modello 2100 | |
| Sistema Thermo Scientific | |||
| SDS-PAGE Biorad | |||
| Cooler | Julabo | ||
| Microscopio a campo chiaro | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Incubatore per colture cellulari | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipolatore | Luigs & Neumann, SM-5, Germania | ||
| Camera di blotting e fornitore di energia elettrica | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Camera di registrazione di tipo sommerso | su | ||
| a forma di U e incubatore di tipo sommerso. | su misura | ||
| Piccole forbici | |||
| Bisturi | |||
| Spatola | |||
| Pipetta | |||
| Piatto di coltura in plastica. | |||
| Siringa | |||
| per becher | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2· 2H2O | Merck | 1.02382.0500 | analisi pro |
| MgSO4· 2H2O | Merck | 5886.05 | pro analisi |
| MgCl2· 6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | per la biologia molecolare |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | per la biologia molecolare |
| Na2HPO4· 2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra puro |
| · H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | per biologia molecolare |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥ 99,5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Anticorpi primari | Numero di catalogo dell'azienda | Specie | |
| pJac-s180 | Biogenes | coniglio (diluito 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | topo (diluito 1:1.000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | coniglio (diluito 1:1.000) |
| Beta-actina | Sigma | A-5441 | topo (diluito 1:5.000) |
| Anticorpi secondari | Numero di catalogo dell'azienda | Specie | |
| IgG HRP coniugato | DAKO | capra anti-topo (1:5.000) | |
| IgG HRP coniugato | NEB | capra anti-coniglio (1:5.000) | |
Riferimenti
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