Nanopodia - sottili, fragili Proiezioni membrana con ruoli in movimento delle cellule e interazioni intercellulari

Sommario

Nanopodia sono canali di membrana sottile ma fragili che si estendono fino a 100 micron dai principali anteriore o posteriore finale di una cella e percepiscono l'ambiente cellulare. Fissaggio diretto a 37 ° C, lavaggio delicato, e di evitare di solventi organici come l'etanolo, metanolo o acetone e di maggiori Triton X-100 le concentrazioni sono tenuti ad osservare queste strutture cellulari.

Abstract

Cellule aderenti in coltura mantenere uno stato polarizzato per sostenere il movimento e le interazioni intercellulari. Nanopodia sono sottili, di forma allungata, in gran parte F actina-negativo-proiezioni di membrana in cellule endoteliali e tumorali che possono essere visualizzati attraverso TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) immunofluorescenza. Cluster TM4SF1 di 100-300 micron di diametro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenente da 3 a ben 14 singoli TM4SF1 molecole. TMED sono disposte in modo intermittente lungo nanopodia ad una distanza regolare di 1 a 3 TMED per μ m ed ancorare saldamente nanopodia a matrice. Ciò consente nanopodia di estendere oltre 100 μ m dalla porta anteriore o posteriore finale delle cellule endoteliali tumorali o polarizzati, e fa sì che i residui di membrana di essere lasciato in matrix quando la cella si allontana. TMED e nanopodia sono stati trascurati a causa della loro estrema fragilità e sensibilità alla temperatura. Lavaggio di routine e la fissazione disturbare la struttura. Nanopodia sono conservate mediante fissaggio diretto in paraformaldeide (PFA) a 37 ° C, seguito da una breve esposizione al 0,01% Triton X-100 prima della colorazione. Nanopodia aprire nuovi orizzonti in biologia cellulare: promettono di rimodellare la nostra comprensione di come le cellule percepiscono il loro ambiente, rilevare e identificare altre cellule a distanza, avviare interazioni intercellulari a stretto contatto, e dei meccanismi di segnalazione coinvolte nel movimento, la proliferazione, e la cella -CELL comunicazioni. I metodi che sono sviluppati per lo studio nanopodia TM4SF1-derivati ​​possono essere utili per gli studi di nanopodia che si formano in altri tipi di cellule attraverso l'agenzia di tetraspanine classici, in particolare il ubiquitariamente espressa CD9, CD81 e CD151.

Introduzione

Durante la polarizzazione per il movimento, cellule animali si estendono una serie di dinamiche, protrusioni di membrana dalle loro superfici, tra cui filopodia, lamellipodia, fibre di retrazione, e volant ^1. Recentemente aggiunto a questa lista fosse nanopodia, un tipo recentemente riconosciuta sottile (100-300 micron di diametro), allungato (fino a 50-100 micron), membrana di proiezione che forniscono canali di membrana per l'estensione delle strutture di F-actina come filopodia e fibra di svincolo e quella macchia positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) in endoteliali tumorali e cellule in coltura ^2,3.

Protocollo

1. Coltura cellulare sul collagene rivestito disco di vetro

1. Dischi Luogo di vetro (12 mm di diametro) in un barattolo di vetro (4 oz) e autoclave per sterilizzare i dischi.
2. Mettete 25 ml di etanolo al 70% in un tubo Falcon da 50 ml e metterlo in una cappa di coltura cellulare. Questa soluzione può essere riutilizzato più volte fino a quando il livello della soluzione scende a 20 ml.
3. Posizionare una pinza nitide con un punto extra fine in etanolo al 70% per 5 minuti prima di utilizzarlo per gestire il disco di vetro.
4. Rimuovere con cautela la pinza dal tubo e chiudere il tappo, quindi inserire delicatamente i etanolo trattati pi....

Risultati

Per la Fase 1:

Se le cellule (come HUVEC e PC3 utilizzato in questo studio) sono in grado di crescere normalmente, le cellule si attaccano al disco collagene rivestite entro 30 minuti dopo che sono teste di serie, polarizzano e diventano mobili poco dopo, e si estendono nanopodia prima del loro percorso di movimento. figure 1A e 1B mostrano rispettivamente una polarizzata e proliferanti HUVEC. Figura 2A mostra cellule PC3 polarizzate in uno sta.......

Discussione

Nanopodia sono sottili canali di membrana cellulare che attaccano saldamente alla matrice attraverso TMED e può estendersi più di 100 micron da una cella cellulare polarizzata di percepire l'ambiente e mediare le interazioni intercellulari ^2,3. Nanopodia aderire alla matrice così fermamente che i residui sono lasciati alle spalle come le cellule si allontana (figure 1 e 2). Nanopodia permettono quindi di studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente e determinare.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dischi di vetro	Fisher Scientific	12-545-82	da 12 mm di diametro
	Fisher Scientific	02-912-310	Barattoli dritti in vetro trasparente pulito certificato,
vetrino in vetro	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Vetrini Tubo
Falcon da 50 ml	BD Falcon	352070	Provetta da centrifuga conica in polipropilene ad alta trasparenza da 50 ml, grado di protezione 16.000 RCF. Sterile.
Provetta Falcon da 15 ml con rack in polistirolo	Corning	430790	Corning Provette da centrifuga in PP da 15 ml
Pinze affilate	Fisher Scientific	13-812-42	Pinze per schegge appuntite extra fini da
24 pozzetti	BD Bioscience	353047	Piastra per colture cellulari da
150 mm Piastra per colture cellulari	BD Bioscience	353025	da 150 mm
19 G 1 ½ Ago per siringa	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Laboratori Decon di	etanolo	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Soluzione di collagene	BD Bioscience	354249	Collagene I, alta concentrazione, coda di ratto, 100 mg
di tripsina/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0,25% tripsina-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM ad alto glucosio (1x), liquido, con L-glutammina, senza piruvato di sodio
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Soluzione, pH 7,4
PFA (paraformaldeide)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Siero fetale bovino
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml e EGM-2 SingleQuot Kit Supplemento & Fattori di crescita
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilizzato in acqua. Soluzione madre al 4% e concentrazione di lavoro è 0,4%.
Anticorpo TM4SF1 anti-umano di topo	Millipore	MAB3127	Epitopo si trova nel dominio extracellulare
dell'anticorpo CD9 umano del topo	BD Bioscience	555370	Epitope si trova nel dominio extracellulare
Alexa Fluor 488 Asino anti-topo 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)
Falloidina	Chemicon	90324	Falloidina coniugata con rodamina
Mezzi di montaggio anti-sbiadimento.	Life Technologies	P-36931	Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI
70% etanolo			17,5 ml di etanolo (200 proof) 7,5 ml di acqua a doppia deionizzazione
10x PBS (per 200 ml)			20 ml di 10x PBS 180 ml di acqua a doppia deionizzazione
20% Triton X-100 (per 20 ml)			4 ml di Triton X-100 16 ml di acqua a doppia deionizzazione
4% NaN3 (per 25 ml)			1 g di NaN3 25 ml di acqua a doppia deionizzazione
50 ng/ml Soluzione di collagene bovino in PBS (fare 5 ml)			Soluzione madre da 50 μ g/ml (50 ml) 830 μ l di Collagene I (3 mg) 50 ml di tampone bloccante PBS
ICC (50 ml)			49 ml di PBS 2% FBS (aggiungere 1 ml) 0,04% NaN3 (aggiungere 100 μ l di 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0,01% Triton X-100 (fare 50 ml)			50 ml di ICC Blocking Buffer 25 μ l di 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cappa per coltura cellulare	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Serie 60) Cabina di sicurezza biologica
37 gradi C, 5% CO2 Incubatore per colture cellulari	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Cuscinetto riscaldante per incubatore con rivestimento ad acqua
	K& H Produzione	1020	K& H Lectro Kennel Pad riscaldato con copertura in pile libero (www.amazon.com)
Centrifuga	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Emocitometro centrifugo da banco
	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line

Barattolo di vetro da 4 once per colture cellulari , Inc.