Una rapida e specifica Microplate Assay per la determinazione di ascorbato intra-ed extracellulare in cellule in coltura

Sommario

L'ascorbato interpreta numerosi ruoli importanti nel metabolismo cellulare, molti dei quali sono venuti alla luce solo negli ultimi anni. Qui si descrive un medium-throughput specifico e poco costoso saggio micropiastra per la determinazione di entrambi ascorbato intra ed extracellulare in coltura cellulare.

Abstract

Vitamina C (acido ascorbico) svolge numerosi ruoli importanti nel metabolismo cellulare, molti dei quali sono venuti alla luce solo negli ultimi anni. Ad esempio, all'interno del cervello, ascorbato agisce in maniera neuroprotettivo e neuromodulatori che coinvolge l'ascorbato bicicletta tra i neuroni e astrociti vicinali - un rapporto che sembra essere cruciale per l'ascorbato cervello omeostasi. Inoltre, prove emergenti suggeriscono fortemente che l'ascorbato ha un ruolo notevolmente ampliato nella regolazione del metabolismo del ferro cellulare e sistemica di quanto è riconosciuto in stile classico. La crescente riconoscimento del ruolo fondamentale di ascorbato di fisiologia cellulare e organismal normale e deregolamentato richiede una serie di media-throughput e alta sensibilità tecniche analitiche che possono essere eseguiti senza la necessità di attrezzature specialistiche altamente costosi. Qui forniamo istruzioni esplicite per un mezzo di throughput, specifico e relativamente poco costoso test micropiastra per la determinazione dei both ascorbato intra ed extracellulare nelle cellule in coltura.

Introduzione

La scoperta della natura chimica di acido ascorbico (vitamina C), e la sua identificazione come il tanto ricercato "fattore anti-scorbutico", di Albert Szent-Györgyi e altri in articoli pubblicati 1928-1934 ¹ sono stati eventi significativi nella storia di biochimica. Infatti, queste scoperte hanno contribuito a Szent-Györgyi stato assegnato il Premio Nobel per la Fisiologia e Medicina nel 1937. La suite in continua espansione dei ruoli per ascorbato di animali e fisiologia vegetale, così come la salute umana, continuano ad essere i soggetti di attivi scientifica indagini e polemiche.

L-ascorbato è un abbondante riducente fisiologico e enzima cofattore nei mammiferi, e contribuisce a numerose reazioni enzimatiche ben definiti che coinvolgono il collagene idrossilazione, carnitina e noradrenalina biosintesi, metabolismo della tirosina e ormone peptidico amidazione ^2. Curiosamente, Evide di montaggioSNO suggerisce che ascorbato svolge un ruolo nello stimolare altri diossigenasi ferro-dipendenti, come prolina e asparaginyl idrossilasi coinvolti nella idrossilazione e mira dei fattori inducibili (HIF) 1α e 2α ^3. Un recente rapporto suggerisce che l'ascorbato svolge un ruolo nella maturazione delle cellule T attraverso colpisce cromatina demetilazione attraverso la sua attività nello stimolare i idrossilasi nucleari, Jumonji C (JmjC) proteine ​​dominio; l'ultimo dei quali sembrano richiedere ascorbato di piena attività ^4. Infatti, la stimolazione di tali enzimi da ascorbato sembra verificarsi con un meccanismo simile alla stimolazione da ascorbato delle HIF e collagene idrossilasi. Tra gli altri effetti classici, ascorbato contribuisce significativamente antiossidazione cellulare come una catena-rottura radical scavenger idrosolubile ⁵ e al riciclo di membrana plasmatica α-tocoferolo (vitamina E) attraverso la riduzione della α-tocopheroxyl radicale ^6, which è importante nella protezione contro la perossidazione dei lipidi di membrana ^7. È importante sottolineare che, sebbene la maggior parte dei mammiferi sono in grado di sintesi de novo epatica di ascorbato da D-glucosio, primati superiori, cavie e alcuni pipistrelli dipendono da fonti alimentari di vitamina ^8. Ciò è dovuto alla inattivazione del gene Gulo, gli ortologhi di cui nei mammiferi affetti codificano l'enzima, γ-gulono-lattone ossidasi ^9-13. Questo enzima è necessario per la reazione finale in ascorbato biosintesi di glucosio ^13.

Dopo l'assorbimento trasportatore mediata dal lume intestinale nell'uomo, ascorbato è distribuito in tutto il corpo attraverso il sistema circolatorio. La vitamina si trova in genere nella sua forma ridotta a millimolari concentrazione intracellulare (con la notevole eccezione di eritrociti in cui le concentrazioni sono in genere simili a concentrazione plasmatica prevalente), e al conc micromolarentrations (ad esempio 50-200 micron) nella maggior parte dei fluidi extracellulari ^14,15.

In condizioni fisiologiche, ascorbato subisce generalmente reversibile un elettrone ossidazione al ascorbil radicale libero (AFR, noto anche come monodehydroascorbate o semidehydroascorbate). Mentre l'AFR è relativamente stabile radicale ^16, in assenza della sua rapida riduzione enzimatica di un elettrone ritorna ascorbato, due AFR può ulteriormente dismutate una ascorbato e una deidroascorbato (DHA) ^9,13,17. Entro l'interno della cellula, l'ossidazione del prodotto a due elettroni di ascorbato, DHA, può essere rapidamente ridotta ritorna ascorbato da glutatione-e NAD (P) H enzimatico-dipendente e reazioni non enzimatiche ^13.

Mentre è classicamente accettato che solo il ruolo significativo di ascorbato nel metabolismo del ferro è di stimolare l'assorbimento alimentare di ferro non-eme ^18, noi ed altri abbiamo fornito prove strongly suggerendo che ascorbato gioca un ruolo notevolmente ampliato nel metabolismo di questo metallo. Primo, ascorbato che viene rilasciato da cellule ascorbato-piene sembra giocare un ruolo importante nel modulare l'assorbimento di ferro non legato alla transferrina dalle cellule ^19,20, e molto recenti evidenze indicano che l'ascorbato modula anche l'assorbimento di ferro legato alla transferrina da celle ^21, l'ultima delle quali corrisponde ad una maggiore fisiologica percorso ferro-uptake ^22.

L'ascorbato è essenziale per la normale funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi ^23,24. Insieme con la corteccia surrenale, ghiandola pituitaria, il timo, retina e corpo luteo, il cervello contiene alte concentrazioni di ascorbato rispetto ad altri tessuti del corpo ^23,25-27. Inoltre, l'esposizione di entrambi ^28,29 astrociti e cellule simili ai neuroni ³⁰ al glutammato è noto per innescare il rilascio di ascorbato nello spazio extracellulare, dove il ascorbate è pensato per aiutare a proteggere i neuroni contro glutammato indotta da disfunzione neuronale ^31. Sebbene l'esatto meccanismo di glutammato indotto ascorbato di liberazione dagli astrociti è sconosciuto, di recente abbiamo fornito prove che indicano il coinvolgimento di cellule gonfiore causato da glutammato assorbimento da parte del glutammato astrociti e aspartato trasportatore (GLAST, noto anche aminoacido eccitatorio trasportatore isoforma 1 [EAAT1 ] nell'uomo) e conseguente attivazione di osmolyte e anionici canali di volume sensibile (VSOACs) che sono permeabili alle piccole anioni organici come ascorbato ^32. Le identità molecolari dei condotti membrana plasmatica coinvolti nella formazione VSOAC restano da identificare ^33,34.

Sebbene molti saggi sono stati sviluppati per la determinazione di ascorbato in campioni biologici, che comprendono spettrofotometriche, cromatografiche fluorimetrica e saggi ^35,36, c'è molto variabilità specificità, sensibilità, interference da contaminanti chimici, range lineare efficace e stabilità dell'analita endpoint. Inoltre, altri fattori importanti che influenzano la scelta del saggio sono rapidità, facilità d'uso e l'accesso alle apparecchiature relativamente specializzata come una cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) apparecchi.

Presentiamo qui un saggio colorimetrico per micropiastre semplice e altamente specifico per la determinazione di ascorbato intracellulare in cellule in coltura, così come un test separato per la determinazione di ascorbato-efflusso da cellule coltivate. Il secondo test ha lo scopo di aggirare il problema della sottovalutazione del rilascio ascorbato dalle cellule a causa del rapido re-uptake di ascorbato rilasciato da trasportatori ascorbato di sodio-dipendente (SVCTs). Sebbene entrambi questi metodi sono apparsi in alcune delle nostre precedenti pubblicazioni ^{19,20,32,37,38,} questo manoscritto fornisce un insieme esplicito di istruzioni e linee guida per la loro esecuzione effettiva.

Protocollo

1. Determinare ascorbato intracellulare in cellule in coltura

1. Coltura cellulare e la raccolta
   1. Grow sospensione (ad esempio eritroleucemia umana, K562) o cellule aderenti (ad esempio astrociti primari) utilizzando le procedure standard di coltura ^19-21,32,38. Nota: per garantire le cellule contengono acido ascorbico, caricare cellule in coltura con l'ascorbato sia come ascorbato o DHA ^33,39.
2. Creare un estratto cellulare-ascorbato contenente
   1. Incubare un numero adeguato di PBS sospensione (PBS)-lavati o cellule aderenti con 450 ml di ghiacciata cellulare Permeabilization Buffer [CPB; 0,1% (w / v) in PBS saponina; 4 ° C]. Nota: determinare il numero di cellule necessario per ottenere un valore di assorbanza nell'intervallo lineare del test (vedi sotto) empiricamente l'utente finale. Nota: estratti di tessuto possono anche essere utilizzati (vedi la discussione per ulteriori dettagli).
   2. Agitazionecellule te in ghiaccio per 10 minuti al fine di garantire lisi cellulare approfondita.
   3. Creare un estratto intracellulare-ascorbato contenente chiarito rimuovendo detriti cellulari mediante centrifugazione del lisato grezzo a 16.000 xg per 5 minuti in una microcentrifuga refrigerata (4 ° C).
   4. Rimuovere accuratamente 4 x aliquote di 100 microlitri di ciascun campione e aggiungere a una sequenza orizzontale di pozzetti in una piastra a 96 pozzetti fondo piatto che contiene sia 25 pl / pozzetto di PBS ("-AO") solo o 25 ml / pozzetto di 45,5 U / ml soluzione stock di L-ascorbato ossidasi (AO) in PBS ("+ AO"). Nota: questo dovrebbe essere fatto in parallelo con la preparazione degli standard (vedi sotto).
3. L'ascorbato costruzione standard-curva (deve essere costruito di nuovo per ogni test)
   1. Preparare una soluzione stock di 10 mM acido ascorbico in PBS freddo. Nota: Controllare la concentrazione di ascorbato spettrofotometricamente utilizzando una cuvetta di quarzo con un 1cm percorso di lunghezza a 265 nm (coefficiente di estinzione = 14.5 mM ^-1 cm ^{-1) 40.}
   2. Preparare con cura una serie di standard ascorbato tra 0 e 20 micron.
   3. In parallelo con il punto 1.2.4, rimuovere con cautela 4 × aliquote da 100 microlitri da ogni standard e aggiungere a una sequenza orizzontale di pozzetti in una piastra di fondo 96 pozzetti flat che contiene 25 ml / pozzetto di PBS ("-AO") o un soluzione madre 45,5 U / ml di AO in PBS ("+ AO"). Nota: 100 ml di norme di ascorbato di cui sopra conterrà 0-2 nmole di ascorbato. Si prega di notare, lo scopo della AO è quello di controllare il contributo di riducenti non ascorbato di ferricianuro di riduzione.
4. Determinare ascorbato intracellulare - Fase 1: rimuovere selettivamente ascorbato e quantitativamente ossidare ascorbato con ferricianuro
   1. Orbitally mescolare la piastra a 96 pozzetti a 550 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti al buio coprendo la piastra in alluminio. Nota: Til suo passo dovrebbe ossidare tutti ascorbato nei pozzi "+ AO" al DHA. I pozzi "-AO" dovrebbero essere influenzate.
   2. Aggiungere 50 ml di ferricianuro di potassio 3,5 mm (in appresso denominate "ferricianuro") in PBS a tutti i pozzetti. La finale [ferricianuro] = 1 mm. Nota: Utilizzare un multipipettor.
   3. Orbitally mescolare la piastra a 550 rpm a temperatura ambiente per altri 5 minuti al buio. Nota: Questo passo dovrebbe comportare la riduzione di ferricianuro di Ferrocianuro da ascorbato in un rapporto stechiometrico di 2 molecole di ferricianuro ridotti per 1 molecola di ascorbato ossidato.
   4. Immediatamente aggiungere 25 ml di una soluzione recente costruzione contenente 50% (v / v) di acido acetico e 30% (w / v) di acido tricloroacetico (TCA). Nota: Utilizzare un multipipettor.
5. Determinare ascorbato intracellulare - Fase 2: quantificare la quantità di ferrocianuro formato ³⁷
   1. Aggiungere 100 ml di soluzione di determinazione ferrocianuro di ³⁷ each bene. Nota: Una soluzione di lavoro deve essere effettuata immediatamente prima dell'uso: 2 ml di 3 M Na-acetato (pH 6.0); 0,5 ml di acido acetico glaciale (~ 17.4 M di acido acetico); 2 ml di 0,2 M di acido citrico; 2 ml di 3,3 FeCl mm ₃ a 0,1 M di acido acetico; 1 ml di 30 mM ferene-S. Il volume finale di questa soluzione di lavoro dovrebbe essere di 7,5 ml.
   2. Orbitally mescolare la piastra al buio a 550 rpm per 30 min a temperatura ambiente.
   3. Leggere i valori di assorbanza dei pozzetti a 593 nm (cioè il massimo assorbimento del Fe (II) (Ferene-S) ₃ complesso).
   4. Calcolare la quantità di acido ascorbico intracellulare come nmoli di ascorbato per milione di cellule sottraendo inizialmente i valori A _{593 nm} per pozzi '+ AO' dai corrispondenti - pozzi 'AO' per ogni campione e poi interpolazione dalla curva standard ascorbato (vedi punto 1.3 ). Quando la costruzione della curva standard, tracciare questa "differenza di valore" per ogni standard contro l'importo di ascorbmangiato per pozzetto.

2. Determinazione della ascorbato-efflusso da cellule in coltura

1. Coltura cellulare e la raccolta
   1. Crescere sospensione o cellule aderenti come sopra (vedi punto 1.1). Nota: effettuare il saggio di seguito in un formato piattaforma 24 pozzetti con sospensione e cellule aderenti per i migliori risultati.
   2. Risospendere le cellule in sospensione, o sovrapporre cellule aderenti, con 400 ml di pre-riscaldato soluzione salina tamponata con HEPES, con o senza calcio e magnesio, e contenente 5 mM D-glucosio (HBS / D; pH 7.3, 37 ° C) in pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere lo stesso volume di HBS / D per pozzetti esenti cella specificata di ciascun piastra da 24 pozzetti da esaminare. Nota: quest'ultimo servirà come controlli privi di cellule per la reazione di base (vedi sotto).

3. Determinano la quantità di ascorbato Rilasciato

1. Le seguenti soluzioni madre devono essere preparate in anticipo: 120U / ml AO in HBS / D (preparare fresco); 2.4 mM Ferene-S in HBS / D; 120 micron FeCl ₃ e 600 mM Na-citrato in HBS / D (preparare immediatamente da soluzioni stock più concentrate).
2. Per avviare la reazione ferrireduction (volume finale per bene dovrebbe essere di 600 ml), aggiungere i seguenti volumi di reagenti ai singoli pozzetti già contenenti 400 ml di HBS / D:
   1. Aggiungere 50 ml di AO (120 U / ml) o HBS / D per accoppiato pozzetti in triplicato. La concentrazione finale AO dovrebbe essere di 10 U / ml. Nota: Label accoppiato pozzi come "- AO" e "+ AO".
   2. Mescolare le piastre con miscelazione delicata orbitale per 5 min a 37 ° C.
   3. Aggiungere 50 ml di 2,4 mm ferene-S in tutti i pozzetti. La concentrazione finale ferene-S dovrebbe essere di 200 micron. Mescolare le piastre come sopra per 5 min a 37 ° C.
   4. Aggiungere 50 ml di preparato fresco da 120 micron citrato ferrico. Il ferro finale e le concentrazioni di citrato dovrebbe essere di 10 micron di ferro e 50 micron citrato. Mescolare bene.
3. In tre pozzetti di controllo triplicato, aspirare il terreno sovrastante e aggiungere 600 microlitri HBS / D contenente 0,1% di saponina. Nota: Questi risultati serviranno come "cell-lisi 100%" controlli di lattato deidrogenasi (LDH) rilascio da condurre in parallelo (vedi sotto).
4. Incubare per 60 minuti al buio a 37 ° C.
5. Al termine del dosaggio ascorbato-efflusso, rapidamente aspirare 500 microlitri da ogni pozzetto e aggiungere al opportunamente etichettati pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Nota: per cellule in sospensione, inizialmente rimuovere le cellule per centrifugazione a 4 ° C.
6. Aggiungere 300 microlitri aliquote di surnatante in una piastra a 96 pozzetti e poi leggere a 593 nm.

4. Determinazione di ascorbato extracellulare

1. Leggere i valori di assorbanza dei pozzetti a 593 nm.
2. Calcolare la quantità di ascorbato extracellulare come nmoli ascorbato per mg di proteina (o per milione di cellule) come descritto per la determinazione di ascorbato intracellularenel passaggio 1.5.4. Nota: l'utente finale deve ottimizzare le condizioni in modo che il rilascio ascorbato non è limitato dalla ascorbato intracellulare.

5. Determinazione della LDH uscita

1. Con i restanti 200 ml di soluzione extracellulare da ciascun campione condurre un saggio di rilascio di LDH ^32,41 per determinare l'entità della lisi cellulare. Nota: il calcolo in% del totale LDH rilasciabile. Determinare LDH rilasciabile dai campioni che sono stati trattati con 0,1% di saponina.

Risultati

Determinazione del ascorbato intracellulare in cellule in sospensione coltivate

Nel primo test (Figura 1), ascorbato intracellulare viene determinata, seguendo ascorbato-specifica (cioè AO-sensitive) riduzione del ferricianuro di Ferrocianuro, utilizzando la determinazione altamente sensibile di ferrocianuro da una procedura pubblicata ^37. Il rilevamento di ascorbato si basa sulla chelazione colorimetrica del ferro ferroso che viene generato dalla riduzione ...

Discussione

In questo articolo presentiamo due test colorimetrici micropiastre rapidi, specifici e relativamente sensibili per la determinazione di ascorbato derivato dai compartimenti intra ed extracellulari nelle cellule in coltura. Le analisi possono essere completate con accesso alla normale attrezzatura da laboratorio e reagenti. Il reagente solo moderatamente costosa necessaria per il dosaggio è AO, che è essenziale in quanto conferisce un elevato grado di specificità analita verso L-ascorbato. ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nunc Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti	Thermo	269620	È possibile utilizzare qualsiasi piastra a fondo piatto a 96 pozzetti
Microcentrifuga da banco refrigerata	Eppendorf	5415D	È possibile utilizzare anche una microcentrifuga non refrigerata che è stata bilanciata alla temperatura in una cella frigorifera
Centrifuga da banco refrigerata	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Spettrofotometro per micropiastre Bio-Rad Benchmark Plus	Bio-Rad		È possibile utilizzare qualsiasi spettrofotometro per micropiastre in grado di leggere a 593 nm ed è consigliato. Se si utilizza un lettore di piastre basato su filtro, scegliere la lunghezza d'onda più vicina possibile e utilizzare il metodo della curva standard.
Ependorf MixMate (miscelatore orbitale per micropiastre)	Eppendorf		Si tratta di un miscelatore per micropiastre molto versatile e affidabile e funziona molto bene per questi saggi
Soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4
Soluzione salina tamponata con MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3
MBS + 5 mM di D-glucosio (MBS/D)
Soluzione salina tamponata con HEPES + 5 mM di D-glucosio (HBS/D); 137 mM di NaCl, 5,2 mM di KCl, 1,8 mM di CaCl2• 2 H2O, 0,8 mM MgSO4• 7 H2O, 5 mM D-glucosio, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3)
Tampone di permeabilizzazione cellulare (CPB; 0,1% di saponina in PBS)
Sostanze chimiche
Acido L-ascorbico o L-ascorbato di sodio	Sigma-Aldrich		Dovrebbero essere ottenute preparazioni di massima purezza
Dimero dell'acido deidro-L-ascorbico (DHA)	Sigma-Aldrich	30790	Le soluzioni acquose producono teoricamente 2 moli di monomero DHA per mole di dimero DHA
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762	Soluzioni madre preparate in DMSO o etanolo
Ascorbato ossidasi (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Le soluzioni madre (120 U/ml) possono essere preparate in PBS o MBS e poi congelate in aliquote
Ferricianuro di potassio (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Triidrato
Ferene-S (3-(2-Piridil)-5,6-Di(2-furil)-1,2,4-triazina-5′,5′ Acido ′-disolfonico sale disodico)	Sigma-Aldrich	92940
Sodio L-glutammato	Sigma-Aldrich
L-glutammina	Sigma-Aldrich Saponina Sigma-Aldrich
		47036	Preparare una soluzione madre allo 0,1%
Soluzioni madre per il saggio
3 M acetato di sodio (pH 6,0)
Acido
0,2 M acido citrico
3,3 mM FeCl3 in acido
30 mM ferene-S
50% (v/v) acido acetico + 30% (p/v) acido tricloroacetico (TCA)
Soluzioni madre per il saggio
AO (120 U/ml)2,4
mM ferene-S
0,12 mM FeCl3 in 0,6 mM di citrato