L'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC) direttamente da tessuti umani è necessaria per la loro caratterizzazione biologica. Questo manoscritto descrive una metodologia per l'isolamento di CSC prostata da tessuti umani, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei problemi passi difficili.
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Articolo metodologico
Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il modello di cellule staminali cancerose (CSC) è stato notevolmente rivisitato nel corso degli ultimi due decenni. Durante questo periodo CSC sono stati identificati e direttamente isolato da tessuti umani e serialmente propagate in topi immunodeficienti, tipicamente attraverso l'etichettatura degli anticorpi di sottopopolazioni di cellule e frazionamento di citometria a flusso. Tuttavia, le caratteristiche cliniche uniche di cancro alla prostata hanno notevolmente limitato lo studio di CSC prostata da campioni freschi di tumori umani. Recentemente abbiamo riportato l'isolamento di CSC prostata direttamente da tessuti umani in virtù del loro fenotipo HLA di classe I (HLAI)-negativo. Le cellule tumorali della prostata vengono raccolte da campioni chirurgici e dissociate meccanicamente. Una sospensione cellulare viene generato ed etichettato con anticorpi HLAI e stromali coniugati modo fluorescente. Sottopopolazioni di cellule HLAI-negativi sono finalmente isolate utilizzando un citometro a flusso. Il limite principale di questo protocollo è la natura frequentemente microscopica e multifocaletumore primario nei campioni prostatectomia. Tuttavia, isolato CSC prostata dal vivo sono adatti per la caratterizzazione molecolare e validazione funzionale da trapianto in topi immunodeficienti.
Introduzione
Eterogeneità intratumorale è considerata una caratteristica del cancro 1. Infatti, sono stati descritti diversi meccanismi di eterogeneità intratumorale, inclusi la mutazione genetica e interazioni con il microambiente. Inoltre, alcuni tipi di cancro possono contenere una gerarchia cellulare con una sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che presenta le caratteristiche di capacità del tumore di avvio e di auto-rinnovamento in saggi di trapianto di serie 2-5. Inizialmente descritto in ematologica 6, seno 7, 8 e cervello neoplasie, CSC sono stati studiati anche nel cancro della prostata 9-12 così com....
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Protocollo
1. Raccolta ed elaborazione di Human Prostate Cancer Tissue da campioni chirurgici
- Preparare due provette coniche da 50 ml in polistirolo contenente 15 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1.640 terreno di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina.
- Personale di servizio Patologia raccolto campioni primari e metastatici della prostata cancro da campioni prostatectomia e la chirurgia palliativa, rispettivamente, sotto un consiglio di Institutional Review approvato il protocollo. Campioni metastatici possono essere ottenuti da dissezioni linfonodali durante chirurgia primaria, le vertebre ....
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Risultati
Figura 1. Prostata umana raccolta tumore del cancro e citometria a flusso grafico che illustra specifiche popolazioni provenienti da un cancro alla prostata umano. (A) noduli tumorali sono raccolte per generare una sospensione cellulare. Contenuto Tumore del campione processato viene confermata con ematossilina convenzi.......
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Discussione
Questo protocollo descrive l'isolamento di CSC da tessuti tumorali della prostata umana freschi. Diverse considerazioni importanti influenzano l'esito positivo di questo protocollo.
Il recupero di un numero elevato di cellule tumorali della prostata vitali dipende da un'attenta valutazione al lordo dei campioni chirurgici. Nella nostra esperienza, l'isolamento di successo delle cellule prostatiche tumorali è meglio garantita quando i noduli tumorali macroscopici sono osservat.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Hariri Famiglia e la Fondazione TJ Martell.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Siero fetale bovino | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillina Streptomicina | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm, 15 mm Piatto per coltura cellulare | Corning | 3295 | |
| 35 & micro; m Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| provetta conica da 50 ml | Crystalgen | 23-2263 | |
| provetta conica da 15 ml | Crystalgen | 23-2265 | |
| tampone per lisi di globuli rossi | Sigma | R7757 | |
| HLA classe I (W6/32) anticorpo PE | Abcam | ab43545 | |
| CD31 anticorpo FITC | eBioscience | 11-0319-42 | |
| Anticorpo CD45 FITC | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ anticorpo EP | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ Anticorpo FITC | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| Provette in polistirene da 12 mm x 75 mm con tappo del filtro cellulare | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| Formalina tampone neutra al 10% | Fisher | RBBP-0480 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C....
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Ristampe e permessi
