Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Abstract

Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un potente strumento per scoprire le modifiche del proteoma potenzialmente correlati alle diverse condizioni fisiologiche o patologiche. Fondamentalmente, questa tecnica si basa sulla separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico in una prima fase, e in secondo luogo in base al loro peso molecolare mediante SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). In questo rapporto viene descritto un protocollo di preparazione del campione ottimizzato per la piccola quantità di tessuto post mortem e di cervello di topo umano. Questo metodo consente di eseguire sia l'elettroforesi bidimensionale differenza di fluorescenza gel (2D-DIGE) e mini 2DE immunoblotting. La combinazione di questi approcci permette non solo di trovare nuove proteine ​​e / o modifiche proteine ​​nella loro espressione grazie alla compatibilità con rilevazione spettrometria di massa, ma anche una nuova comprensione convalida marcatori. Quindi, mini-2DE accoppiato ai permessi di Western blotting per identificare e convalidare postale-Traduzionali modifiche, proteine ​​catabolismo e fornisce un confronto qualitativo tra condizioni e / o trattamenti diversi. Qui, forniamo un metodo per studiare i componenti di aggregati proteici presenti in AD e demenza Lewy, come il peptide beta-amiloide e l'alfa-sinucleina. Il nostro metodo può quindi essere adattato per l'analisi del proteoma e proteine ​​insolubili estrarre dai modelli di tessuto cerebrale e topi umani. Parallelamente, essa può fornire informazioni utili per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nelle malattie neurodegenerative, nonché i potenziali nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici.

Introduction

Disturbi mentali e neurologici rappresentano il 13% del carico globale di malattia, nuove sfide come meccanismi fisiopatologici, fattori di rischio e biomarcatori prodromici devono essere esplorate ^1. In linea con questo obiettivo, proteomica studi del cervello umano diventano indispensabili per scoprire i meccanismi molecolari coinvolti nei processi come la memoria, il comportamento, le emozioni e la plasticità neuronale per esempio, non solo per motivi fisiologici, ma anche per le condizioni patologiche. Pertanto, l'uso di modelli animali e più specificamente i topi transgenici, porta una vasta gamma di possibilità di imitare l'eziologia delle ma....

Protocol

1. Omogeneizzazione e Total estrazione di proteine ​​da umano e mouse tessuto cerebrale

1. Cervello omogeneizzazione del tessuto. Omogeneizzare il tessuto cerebrale 10% (w / v) in 8 M urea, 2 M tiourea e 1% w / v tampone SDS (UTS) utilizzando una lente potter (per campioni umani) o Teflon omogeneizzatore (per topi campioni). Ultrasuoni a 60 Hz 30 impulsi con un generatore di ultrasuoni applicazione 0.5 sec per la disintegrazione del tessuto totale ^{13, 14.}
   1. Determinare la concentrazione di proteine ​​con saggio Bradford, utilizzando BSA come standard. Questo UTS estrazione buffer è completamente compatibile con una dimensione SDS-PAGE purché....

Results

Proteomica sul tessuto cerebrale rimane difficile poiché nessun tampone ideale esiste per recuperare il 100% di proteine, proteine ​​del citoscheletro soprattutto associata alla membrana o. La prima serie di esperimenti si sono concentrati sulla ricerca di un tampone di lisi adatto compatibile con i due approcci e che consente di recuperare un grande pannello di proteine. Così, tre buffer di lisi sono stati analizzati per determinare la più appropriata. In primo luogo, è stato utilizzato il buffer comune biologia moleco.......

Discussion

Scoprire cambiamenti di espressione di proteine ​​patologiche, la ricerca dei biomarcatori e la modulazione dei potenziali percorsi di bersagli farmacologici sono tra gli obiettivi delle neuroproteomics avvicina ^30. Tra gli strumenti emergenti, il campo 2DE aggiunge un expectative promettente. Tuttavia, un consenso dovrebbe essere raggiunto per minimizzare la variabilità e aumentare la riproducibilità negli esperimenti. In linea di questa idea un protocollo standardizzato effettuare 2D-DIGE (Figura 2).......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in funzione dell'intervallo di pH/dimensione
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in funzione dell'intervallo di pH desiderato
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Scatola di plastica per effettuare la reidratazione passiva
Filtro MILLEX GS	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Gel prefabbricati 13,3 x 8,7 cm (L x L)	Bio-Rad		Riferimento in funzione del MW per separare
l'unità di messa a fuoco isoelettrica IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm	Azienda di gel	P2D1.5