Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.
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Articolo metodologico
Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un potente strumento per scoprire le modifiche del proteoma potenzialmente correlati alle diverse condizioni fisiologiche o patologiche. Fondamentalmente, questa tecnica si basa sulla separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico in una prima fase, e in secondo luogo in base al loro peso molecolare mediante SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). In questo rapporto viene descritto un protocollo di preparazione del campione ottimizzato per la piccola quantità di tessuto post mortem e di cervello di topo umano. Questo metodo consente di eseguire sia l'elettroforesi bidimensionale differenza di fluorescenza gel (2D-DIGE) e mini 2DE immunoblotting. La combinazione di questi approcci permette non solo di trovare nuove proteine e / o modifiche proteine nella loro espressione grazie alla compatibilità con rilevazione spettrometria di massa, ma anche una nuova comprensione convalida marcatori. Quindi, mini-2DE accoppiato ai permessi di Western blotting per identificare e convalidare postale-Traduzionali modifiche, proteine catabolismo e fornisce un confronto qualitativo tra condizioni e / o trattamenti diversi. Qui, forniamo un metodo per studiare i componenti di aggregati proteici presenti in AD e demenza Lewy, come il peptide beta-amiloide e l'alfa-sinucleina. Il nostro metodo può quindi essere adattato per l'analisi del proteoma e proteine insolubili estrarre dai modelli di tessuto cerebrale e topi umani. Parallelamente, essa può fornire informazioni utili per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nelle malattie neurodegenerative, nonché i potenziali nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici.
Introduzione
Disturbi mentali e neurologici rappresentano il 13% del carico globale di malattia, nuove sfide come meccanismi fisiopatologici, fattori di rischio e biomarcatori prodromici devono essere esplorate 1. In linea con questo obiettivo, proteomica studi del cervello umano diventano indispensabili per scoprire i meccanismi molecolari coinvolti nei processi come la memoria, il comportamento, le emozioni e la plasticità neuronale per esempio, non solo per motivi fisiologici, ma anche per le condizioni patologiche. Pertanto, l'uso di modelli animali e più specificamente i topi transgenici, porta una vasta gamma di possibilità di imitare l'eziologia delle malattie neurodegenerative umane 2.
Proteomica approcci sono oggi disponibili per realizzare queste nuove prospettive nel campo delle neuroscienze. Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un metodo semplice e potente probabile che permette di confrontare il proteoma di una vasta gamma di campioni. Inoltre, è anche unpotente metodo per isolare una proteina da una miscela complessa al fine di identificare e analizzare ulteriormente mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consiste essenzialmente in due fasi successive: 1) la separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico (pI) da isoelettrofocalizzazione (IEF). Più precisamente, un potenziale elettrico viene applicato attraverso le strisce di acrilammide Immobiline tra un gradiente di pH e quindi proteine migreranno e concentrarsi su un pI determinata in funzione della loro carica netta globale. 2) proteine Isoelectrically focalizzati sono denaturati e caricati negativamente con l'aggiunta di sodio dodecil solfato (SDS), in tal modo le proteine nella loro prima struttura sono separati in funzione del loro peso molecolare apparente (MW) mediante SDS-PAGE 3. Queste due proprietà distinte ci permettono di affrontare un valore doppio di andare oltre nello studio del proteoma. Da un lato questo approccio offre la possibilità di effettuare una analisi quantitativa utilizzando coloranti minime metodo 2D-DIGE, e dall'altro un qualitative analisi mini-2DE accoppiato al western blotting.
Analisi quantitativa da 2D-DIGE conferisce espressione della proteina cambia tutto il proteoma del campione. In breve, i campioni vengono etichettati con tre cianine (CY2, Cy3 e Cy5) che emettono a tre lunghezze d'onda distinte (blu, verde e rosso). Questi coloranti minime fluor contenenti N-idrossi gruppo estere succinimidyl reagiscono con il gruppo ε-amminico lysines residui di proteine conseguente covalenti legami ammidici 4. Residui di lisina sono etichettati solo tra 1-3% e impedendo così più etichette, oltre a proteine e importanti modifiche di carica al netto 5, 6. Cy3 e Cy5 sono spesso utilizzati per etichettare due campioni indipendenti mentre Cy2 tag un mix di uguale percentuale dei campioni da confrontare. I due vantaggi principali sono che tutti i campioni etichettati sono miscelati e IEF e SDS-PAGE sono svolte in un gel in una sola volta per ogni passo, evitando l'inter variabilità tra esperimenti a causa di gel confronto. Inoltre, presenta una soglia alta rilevamento di circa 1 femtomole di proteine 7. Gel vengono analizzati e software 2D a confronto le immagini 2D fluorescenza gel, dove Cy2 serve come standard interno consentendo l'identificazione delle differenze statistiche tra i punti per la loro identificazione posteriore mediante spettrometria di massa. Il software di analisi 2D utilizzando lo standard interno raggiunge un rilevamento rapido di meno del 10% delle differenze tra i campioni con più del 95% di confidenza statistica 8.
Analisi qualitativa da mini-2DE è un passo cruciale per la caratterizzazione delle proteine. Il principio è lo stesso come precedentemente descritto per pI e separazione MW, ma in questo caso le proteine vengono trasferite da una piccola gel di poliacrilammide ad una membrana e immunoblotting viene eseguita dopo. Mentre una elettroforesi su gel di dimensione fornisce cambiamenti nell'espressione di proteine per uno o più epitopi proteici in funzione della anticorpo, il information di mini-2DE dota di due parametri aggiuntivi. In primo luogo, le isovariants proteine cambiano in funzione del pI, indicando che modificazioni post-traduzionali potrebbero aver luogo. In secondo luogo, l'identificazione spettrometria di massa può essere indicativo di zimogeni plausibili e prodotti catabolici di proteine. Pertanto, le modifiche osservate da 2D-DIGE sono probabilmente indicativi dei meccanismi alla base cambiamenti nel profilo proteoma globale. Allineamenti di immunoblots tra i diversi campioni per la stessa proteina epitopo / s in mini-2DE possono riflettere i cambiamenti di acidità che faccia luce sulle variazioni post-traslazionali leggermente osservate o addirittura non da immunoblotting monodimensionale 9, 10. Inoltre, questa analisi informa circa i potenziali siti di taglio dovuti alla conoscenza del pI e MW dei residui metabolici 11,12.
La combinazione di queste due tecniche fornisce un complementare analisi proteomica. Da un lato 2D-DIGE offre un tipicoe di differenze che permettono un isolamento precisa di polipeptidi la cui espressione è diversa. Queste differenze consistono essenzialmente nella comparsa o scomparsa di un punto o di aumento / diminuzione dell'intensità di un dato da una analisi software dei gel fluorescenti. Tuttavia, queste osservazioni da soli sono difficilmente spiegare la natura della modifica osservato. Per queste ragioni, una volta che il polipeptide è isolato e identificato mediante spettrometria di massa, l'uso di mini-2DE permette di confermare precisamente 1) l'identità della proteina isolata e 2) la natura della differenza: variazione del livello isovariant / isoforma espressione, modificazioni post-traslazionali e processi di scissione per esempio. Tuttavia, è necessario sviluppare un tampone di lisi a partire sia compatibile con 2D-DIGE e mini-2DE per limitare i potenziali dispersioni derivanti dall'uso di protocolli di estrazione che sono molto dissimili.
Nel presente articolo, DEdescritto un protocollo adattato per la preparazione, estrazione e prestazioni delle tecniche mini-2DE per proteine cerebrali provenienti da tessuti umani e mouse 2D-DIGE e.
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Protocollo
1. Omogeneizzazione e Total estrazione di proteine da umano e mouse tessuto cerebrale
- Cervello omogeneizzazione del tessuto. Omogeneizzare il tessuto cerebrale 10% (w / v) in 8 M urea, 2 M tiourea e 1% w / v tampone SDS (UTS) utilizzando una lente potter (per campioni umani) o Teflon omogeneizzatore (per topi campioni). Ultrasuoni a 60 Hz 30 impulsi con un generatore di ultrasuoni applicazione 0.5 sec per la disintegrazione del tessuto totale 13, 14.
- Determinare la concentrazione di proteine con saggio Bradford, utilizzando BSA come standard. Questo UTS estrazione buffer è completamente compatibile con una dimensione SDS-PAGE purché non lisati sono sovra-riscaldato per evitare carbamilazione 15.
- Aggiungere 1% (w / v) di Amberlite e incubare con miscelazione delicata per 10 min a temperatura ambiente. Successivamente filtrare su 0.22 micron filtri per siringa e infine aggiungere la SDS per la soluzione di urea / tiourea. Questo passaggio riduce la quantità di acido urico e acido isocianico, che sono in equilibrIUM con urea in soluzione e facilitare la sua degradazione.
- Cloroformio / metanolo precipitazione delle proteine. Precipitare tra 100-150 mg di proteine per 11 centimetri strisce IPG e 1-1,5 mg per 18 centimetri quelli (indipendentemente sulla gamma pH selezionato per eseguire l'IEF).
- Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio oppure a 4 ° C. Fresco cloroformio e metanolo a 4 ° C per 30 min prima di iniziare la procedura di precipitazione.
- Aggiungere tre volumi di metanolo e un volume di cloroformio per un volume di UTS lisato. Agitare manualmente la miscela e aggiungere tre volumi di acqua fredda. Vortex per 1 min e agglomerare le proteine mediante centrifugazione a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur e aggiungere tre volumi di freddo MeOH. Nuovamente Vortex e centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. Infine, scartare il surnatante e asciugare il pellet sotto N 2.
- Preparazione di proteine per analisi 2D.Risospendere il pellet di proteine-essiccati in 2D-buffer (8 M urea, 2 M tiourea integrato con 4% CHAPS). Lavare la soluzione con Amberlite come indicato sopra e cercare di mantenere la proporzione di 500 mcg di proteine per 200 ml di tampone per 2D 2D-DIGE. Nota: tampone 2D può essere conservato a -80 ° C o mantenuta a 4 ° C per una settimana (per evitare degradazione dell'urea).
- Sonicare e conservare i campioni a -80 ° C fino effettuare il passaggio seguente. Degno di nota, questo protocollo può essere usato dopo solubilizzazione di acido formico di proteine aggregati 10. In breve, far evaporare l'acido formico sotto N 2 e risospendere il pellet come descritto.
2. 2D-DIGE
- Campioni di prova di qualità. Campioni di dose ancora utilizzando il metodo di Bradford. Diluire 15 pg di proteine in tampone campione LDS, riscaldare a 37 ° C e 15 caricare sul 4-12% gel di poliacrilammide.
- Colorazione con Coomassie. Macchiare gel di poliacrilammide con 0.1% (w / v) CoomassieBlu G-250, 50% EtOH e 10% (v / v) di acido acetico per almeno 1 ora. Sia sfondo Destain notte in 7% di acido acetico e 10% (v / v) di etanolo.
- Etichettatura pre-elettroforetica dei campioni. Prima di eseguire l'etichettatura colorante cianina, verificare il pH del campione, che dovrebbe essere di base o anche neutro poiché la sostituzione N-idrossisuccinimmide è più efficiente a pH basico e somministrato essere ottimale a pH 8,6.
- Etichettare minimamente i due campioni di studio con coloranti fluorescenti Cy3 o Cy5 con un rapporto di 50 ug protein/400 pmol colorante e mantenere per 1 ora a 4 ° C al buio per facilitare il gruppo estere attivo NHS delle cianine con l'ammina senza protoni gruppi di lisine.
- Ridurre le variazioni di esempio facendo un cross-etichettatura con Cy3 e Cy5 coloranti, evitando un accoppiamento preferenziale di un campione a un particolare cianina. Si noti che il cianina-colorante marcatura minima può essere adattato per piccole quantità di proteine con mantenere la proporzione di 1 ug protein per 8 pmol Cyanine-dye. Se è così, il sistema mini-2DE può essere usata al posto della grande sistema gel 2D. Ciò consentirà l'analisi 2D-DIGE per una piccola quantità di tessuto cerebrale.
- Etichettare un pool di entrambi i campioni con la stessa quantità di proteina (50 mg in totale) con colorante fluorescente Cy2 e usato come standard interno. Utilizzare le stesse condizioni come precedentemente indicato.
- Completa in un volume totale di 350 microlitri di tampone 2D contenente 1,1% di reagente Destreak, 1,2% di tampone IPG e tracce di blu di bromofenolo totale 150 mcg di proteine marcate (50 mg di Cy2, 50 mg di Cy3 e 50 ug di Cy2). Eseguire questo passaggio in quadruplice copia utilizzando quattro strisce indipendenti. Inoltre, preparare due ulteriori strisce non etichettati (uno per ogni campione) con 350-450 mg di proteine per i gel preparative.
- Lasciare le sei strisce cariche ricoperte di pernottamento oli minerali per la reidratazione passiva.
- Isoelettrofocalizzazione. Effettuare la IEF a 206; C. Per un pH 3-11NL, 18 centimetri striscia il protocollo è: l'impostazione corrente massima è di 50 ìA / strip durante le 8 tappe: 1) 150 V step per 1 ora, 2) 200 V fase per 5 ore, 3) 500 V con pendenza 2 ore, 4) gradiente di 1,000 V per 2 ore, 5) 2,000 V pendenza per 2 ore, 6) 4,000 V pendenza per 2 ore, 7) 8,000 V pendenza per 2 ore e 8) per un totale di 24.000 V · h passo . Dopo IEF, inviare l'eccesso di olio minerale con carta cromatografica e memorizzare le strisce a -20 ° C fino alla seconda dimensione.
- IPG Strips equilibratura. Equilibrare strisce in 6 M urea, 2% SDS, 30% glicerolo, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 tampone con 1% di DTT durante e dopo 15 min con 4,7% di iodoacetamide nello stesso tampone ma senza DTT.
- Seconda dimensione o SDS-PAGE elettroforesi. Effettuare le sei 12% gel SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% di acrilammide / bisacrylamide, 0.1% (w / v) di SDS, 0,072% (w / v) APS e 0,1% (v / v) TEMED ) Allo stesso tempo utilizzando un grande sistema 2D, con quattro lastre di vetro a bassa fluorescenza per la strips con campioni di fluorescenza e altri due lastre di vetro con 1,5 mm di spessore per i gel preparative, al fine di asportare le macchie proteiche.
- Caricare i sei IPG strisce sulla cima dei gel e più strati con 0,5% (w / v) di agarosio. Tampone di corsa è composta da 25 mM Tris, glicina 192 mM e 0,1% (w / v) di SDS. Eseguire la migrazione a 2,5 W / gel durante la notte con un sistema di refrigerazione impostato a 4 ° C 16,17.
- Immagini di fluorescenza acquisizione e l'analisi. Utilizzare uno scanner Typhoon 9400 per ottenere le immagini gel di fluorescenza (12 immagini per un esperimento). Scan Cy2, Cy3 e Cy5 immagini per ogni gel a 488/520 nm, 532/580 nm e 630/670 nm di eccitazione / lunghezze d'onda, rispettivamente. Utilizzare il software informatico per analizzare le immagini. I dati sono rappresentativi delle variazioni di volume posto associati alla distribuzione del segnale di tutti i quattro gel tra i due campioni studiati.
- Coomassie colorazione per i grandi gel. Fissare il gel di preparazione in 50% (v / v) EtOH e 3% (v / v) di acido ortofosforico per almeno 24 ore. Poi, dopo, lavare due volte con acqua ultra pura per 20 min. Eseguire colorazione in 34% (v / v) metanolo, 17% (w / v) di solfato di ammonio e acido ortofosforico 2% per 1 ora prima di aggiungere 0,1% (w / v) Coomassie Blu G-250. Tenere i gel nella colorazione per almeno 48 ore e decolorati in acqua ultra pura.
- Spot per l'identificazione MS. Una volta che le immagini di fluorescenza vengono analizzate, il software fornisce un elenco di punti la cui espressione è statisticamente diverso. Asportare manualmente queste macchie dai gel di preparazione. Questa procedura richiede pratica e una certa destrezza manuale per evitare contaminazione cheratina. Poi i campioni possono essere mantenuti in acqua a -20 ° C fino invio di MS. Identificazione Spot è perfettamente compatibile con spettrometria di massa tandem (MS / MS) e la rilevanza delle identità di proteine è giudicata in base al punteggio Mowse basato calcolato con un p-value di 0,05 (p <0,05) 18 probabilità.
3. Qualitativa Mini-2DE Assay
- Risospendere massimo 100 pg di proteina in tampone campione 2D fino a un volume finale di 200 microlitri di una striscia IPG 11 cm. Nel caso di sistema sovraespressione o proteina purificata, l'importo di partenza può essere abbassata a 20 mg.
- Aggiungere 1,1% (v / v) Destreak reagente, 0,55% (v / v) di tampone di IPG e tracce di blu di bromofenolo in un volume finale di 200 microlitri. Poi, vortice, fare un giro veloce e caricare in una striscia IPG per la reidratazione passiva (per portare il nastro al suo spessore originale) durante la notte coperto con olio minerale. Nota: la percentuale di buffer di IPG è la stessa per tutti l'intervallo di pH desiderato (pH 3-11, 4-7, 7-11, ecc), ma la sua composizione varia in funzione del campo di pH selezionato.
- Isoelectrofocalisation. Eseguire IEF a 20 ° C. La durata del programma dipende dall'intervallo di pH selezionato. Degno di nota, parametri come elettroendosmosi possono disturbare il profilo IEF e in questi casi,ottimizzazione in tempo electrofocalisation è necessaria 19. Nota: non è necessariamente un IEF più che fornisce risultati migliori ma accorciare il tempo di IEF può anche migliorare la risoluzione. Dopo IEF, strisce IPG possono essere conservati a -20 ° C per mesi.
- IPG strisce di equilibrio. Equilibrare le strisce in un tampone contenente 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glicerolo, 5% SDS, 0,05% blu di bromofenolo. Fai tre equilibratura bagna per 15 minuti con il cambiamento la soluzione tampone tra ogni bagno.
- SDS-PAGE. Strato strip IPG su gel prefabbricato (IPG +1 ben 11 centimetri striscia IPG) con una percentuale di poliacrilammide scelto a seconda del MW della proteina di interesse. Poi, asciugare il gel su una membrana di nitrocellulosa / PVDF a 100 mV durante 33 min.
- Incubare per una notte con l'anticorpo richiesta e visualizzare per attività perossidasi. Eseguire gli allineamenti di immunoblots usando polipeptidi indipendenti rivelate dal anticorpo secondario. Raggiungere un semi-quantitative analisi densitometria del volume e l'intensità delle tracce / spot con il software ImageJ.
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Risultati
Proteomica sul tessuto cerebrale rimane difficile poiché nessun tampone ideale esiste per recuperare il 100% di proteine, proteine del citoscheletro soprattutto associata alla membrana o. La prima serie di esperimenti si sono concentrati sulla ricerca di un tampone di lisi adatto compatibile con i due approcci e che consente di recuperare un grande pannello di proteine. Così, tre buffer di lisi sono stati analizzati per determinare la più appropriata. In primo luogo, è stato utilizzato il buffer comune biologia moleco...
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Discussione
Scoprire cambiamenti di espressione di proteine patologiche, la ricerca dei biomarcatori e la modulazione dei potenziali percorsi di bersagli farmacologici sono tra gli obiettivi delle neuroproteomics avvicina 30. Tra gli strumenti emergenti, il campo 2DE aggiunge un expectative promettente. Tuttavia, un consenso dovrebbe essere raggiunto per minimizzare la variabilità e aumentare la riproducibilità negli esperimenti. In linea di questa idea un protocollo standardizzato effettuare 2D-DIGE (Figura 2)...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da Inserm, dell'Università di Lille 2, MEDIALZ, LABEX (laboratorio di eccellenza, programma di investire per il futuro) e DISTALZ (sviluppo di strategie innovative per un approccio transdisciplinare alla malattia di Alzheimer). FJ.FG è attualmente una borsa destinatario di ANR (francese Agenzia Nazionale di Ricerca / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), ma questo lavoro è stato anche sotto il supporto di una sovvenzione da parte del JCCM (Spagna).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in funzione dell'intervallo di pH/dimensione | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in funzione dell'intervallo di pH desiderato | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Scatola di plastica per effettuare la reidratazione passiva |
| Filtro MILLEX GS | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Gel prefabbricati 13,3 x 8,7 cm (L x L) | Bio-Rad | Riferimento in funzione del MW per separare | |
| l'unità di messa a fuoco isoelettrica IPGphor III | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm | Azienda di gel | P2D1.5 |
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