Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

Sommario

Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l'utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l'invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell'integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.

Abstract

È ormai noto che il microambiente cellulare e tissutale sono regolatori critici che influenzano iniziazione e la progressione tumorale. Inoltre, la matrice extracellulare (ECM) è stato dimostrato per essere un regolatore critico del comportamento delle cellule in coltura e omeostasi in vivo. L'attuale approccio di coltura di cellule in bidimensionale (2D), superfici plastiche risultati del disturbo e perdita di complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente. Attraverso l'uso di tridimensionale (3D) saggi di coltura, sono stabilite le condizioni per l'interazione cellula-microambiente simile microambiente in vivo. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per far crescere le cellule del cancro al seno in una matrice 3D di proteine ​​della membrana basale, esemplificando il potenziale della cultura 3D nella valutazione di invasione delle cellule nell'ambiente circostante. Inoltre, si discuterà di come questi test 3D hanno il potenziale per esaminare la perdita di segnalare molecduli che regolano la morfologia epiteliale da immunoistochimica procedure. Questi studi aiutano a identificare importanti dettagli meccanicistici nei processi che regolano l'invasione, necessarie per la diffusione del cancro al seno.

Introduzione

Migrazione e l'invasione delle cellule individuali o collettivi sono due caratteristiche di cancro, e necessari per la diffusione metastatica delle cellule tumorali ^1-4. La capacità delle cellule di cancro di avviare metastasi dipende dalla loro capacità di migrare e invadere nel tessuto limitrofo utilizzando invadopodia a degradare la membrana basale delle cellule. Invadopodia sono sporgenze degradazione matrice ricca di actina dinamiche che consentono la degradazione della matrice extracellulare attraverso il rilascio di proteasi matrice degradazione ^5. Invasione cellula tumorale attraverso la degradazione della matrice e la migrazione delle cellule tumorali e questo è accompagnato da una riorganizzazione dell'ambiente matrice tridimensionale (3D) ^2. Così, per penetrare attraverso la matrice, una cella deve trasformare la sua forma e interagire con la matrice extracellulare (ECM) ^2.

Il mantenimento dell'integrità del tessuto mammario dipende strettamente controlled architettura tissutale da giunzioni cellula-ECM e cellula-cellula adesione influenzano l'espressione genica e la rottura della polarità epiteliale può provocare l'insorgenza del cancro ^6-10. Tuttavia, la maggior vitro migrazione e l'invasione test in quali transwell saggi camera o saggi ferita-graffio sono bidimensionali (2D) e quindi queste trascurano le interazioni complesse tra le cellule e il loro ambiente adiacente ^3,6,8,11-14. Diversità morfologiche e funzionali significativi, in particolare le variazioni di morfologia cellulare, differenziazione cellulare, adesioni cellula-matrice e modelli di espressione genica sono stati rilevati da coltura di cellule in colture 3D che sono comunemente carenti in 2D saggi ^2,6,8,11. Così, utilizza delle analisi 3D sono significativamente utile ricapitolare in un più fisiologico in condizioni vivo, portando ad una migliore definizione di risultati innovativi nella ricerca di base alla clinica ^6-10. Tuttavia, va notato, Nonostante i numerosi vantaggi ottenuti con l'uso di colture 3D, questo modello non può catturare tutte le complessità del microambiente tumorale in vivo che comprende vari tipi di cellule. Tuttavia, è possibile incorporare cellule stromali nei modelli 3D (ad esempio, fibroblasti, leucociti e macrofagi) studiare l'effetto delle interazioni tumore stromale sull'adesione cellula tumorale e invasione ^15-17.

Cellule epiteliali mammarie in coltura crescono in modo più efficace quando le proteine ​​ECM come laminina e collagene sono presenti. Con questa nota, una miscela di matrice disponibile in commercio è stata derivata da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumore murino ed è noto come matrice della membrana Matrigel seminterrato ^2,8. Un certo numero di tecniche sono state stabilite a crescere cellule epiteliali come colonie 3D a matrice membrana basale ^2,8. Il piano seminterrato modello a matrice membrana 3D è efficace per stabilire delle cellule del seno sia maligno e non malignocrescita, simile a quello che sta succedendo nell'ambiente in vivo ^18,19. Cellule MCF10A sono cellule epiteliali mammarie non maligne. Quando coltivate in matrice membrana basale, queste cellule mostra a tratti vivo delle cellule normali del seno e sottoporsi controllata la proliferazione cellulare, la polarizzazione delle cellule, apoptosi e per stabilire lo spazio lume ^8,12,20. Inoltre, la comparsa di nuclei di cellule di MCF10A formano acini in culture 3D avvicinano maggiormente a quelle delle cellule epiteliali mammarie in tessuto da quelle coltivate in monostrato ^21. Gli studi di Bissell e colleghi sono stati i primi a rivelare che le cellule mammarie maligne possono essere differenziate da cellule della mammella non-maligne quando coltivate in un ambiente ricco di laminina, poiché le cellule maligne mostrano un fenotipo altamente disorganizzata, un aumento della proliferazione, diminuzione cellula- adesione cellulare, aumento dell'espressione di marcatori mesenchimali e un aumento del numero di struttura invasiva formano ^3,6,22.

Anomalie del l'ambiente cellulare possono influenzare la formazione del tumore ^20. Il metodo di coltura 3D può essere usato per studiare efficacemente la comunicazione che avviene tra le cellule tumorali e l'ambiente circostante e determinare come influenze espressione proteica tale ^14,20,21,23 comunicazione. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per crescere MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in culture 3D per analizzare invasività, e per studiare la perdita di morfologia epiteliale utilizzando un marcatore epiteliale laminina, un componente della membrana basale cellulare ^{18,19,24, 25.} Le procedure dettagliate consentono di quantificare con precisione e riproducibile stellato (invasive) formazione della struttura da qualsiasi cellula di cancro invasivo e non è limitante per le linee cellulari del cancro al seno comuni (come MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, o T47D ). Pertanto, questo test può servire come piattaforma per valutare come espressione della proteina in cellule o trattamento con pro o anti-composti invasive regolano la degradazione della matrice extracellulare, da cellule singole o multiple.

Protocollo

1. Cultura tridimensionale delle cellule del cancro al seno in membrana basale Matrix (La Tecnica Embedment)

1. Manipolazione Matrigel matrice della membrana basale: Scongelare su ghiaccio notte a 4 ° C. Matrice membrana basale è liquido a bassa temperatura ma solidifica a temperatura ambiente. Mantenere matrice membrana basale su ghiaccio (Figure 1A-B).
2. Coprire il piatto confocale No.1 fondo di vetro con 50 ml di matrice membrana basale mediante diffusione della matrice usando la punta di un Pipetman P-200 in un modello a spirale (Figura 1C). Prestare attenzione quando la diffusione della matrice membrana basale per evitare la formazione di bolle d'aria. Allo stesso modo, evitare di diffondere la matrice di chiudere i confini del piatto fondo di vetro per evitare la formazione di menisco. Se matrice membrana movimentazione inesperto scantinato, poi preraffreddato il piatto, P-200 Pipetman e pipette può essere di ghiaccio (in alternativa lasciato una notte in frigorifero a 4 ° C). Questo passo offertetempo supplementare per diffondere la matrice membrana basale prima della solidificazione. Porre la capsula (es) in un incubatore di coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO ₂₎ per almeno 30 minuti per consentire la matrice membrana basale a solidificare (Figura 1D).
3. Mentre la matrice è in fase di solidificazione, trypsinize un confluente 100 mm piastra 70-80% delle cellule. Una volta che le cellule hanno iniziato sollevamento fuori della piastra, risospendere in 10 ml di terreno RPMI 1640 contenente il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), per inattivare la tripsina (Figura 1E). Poi il trasferimento delle cellule risospese in un tubo da 15 ml (Figura 1F).
4. Spin le cellule (presenti nel tubo conico) a 100 xg per 3 minuti in una coltura cellulare centrifuga dedicato (Figure 1G-H).
5. Mentre le cellule vengono centrifugati, un'aliquota di 50 ml di matrice in una provetta 1 ml (nota: ogni piatto fondo di vetro viene allocata una provetta, di conseguenza, sel'esperimento richiede 3 piatti, ne consegue che 3 provette da microcentrifuga sono necessari pure), e quindi la provetta in ghiaccio (Figura 1B).
6. Aspirare il mezzo dal tubo conico dal punto 1.4, pur lasciando il pellet indisturbato (Figura 1I). Risospendere le cellule (che sono stati filati in giù) in 1 ml di FBS-integrato RPMI (Figura 1J).
7. Una volta che le cellule sono contate con un emocitometro (Figura 1K), o un contatore di un'aliquota particella cella 2,5 x 10 ⁴ cellule in provetta e ciliegina sulla torta con opportuno supporto in modo da ottenere il volume totale di 50 microlitri (Figura 1L).
8. Mescolare le cellule dal punto 1.7 (25.000 cellule in 50 microlitri) con il tubo per microcentrifuga matrice contenente da passo 1,5 in rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 microlitri (Figura 1M).
9. Piastra delicatamente 100 ml di matrice: miscela di cellule dal punto 1.8 sulla sPiatto olidified membrana basale matrice rivestita dal punto 1.2 (Figura 1N). Questo permette alle cellule di essere incorporati in matrice membrana basale.
10. Trasferire il piatto (es) nell'incubatore coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO ₂₎ e lasciare la matrice: miscela di cellule solidificare per almeno 30 min.
11. Una volta che la matrice: miscela di cellule è solidificato, aggiungere 2 ml di media RPMI FBS-integrate per il piatto (Figura 1O) e prendere il piatto indietro l'incubatrice dove verrà conservato per il resto dell'esperimento (Figura 1P).
12. Cambiare media ogni giorno per un periodo di 5 giorni (o secondo la richiesta per un saggio, la durata del saggio per MDA-MB-231 cellule è di 5 giorni di lunghezza).
13. Utilizzando un microscopio ottico, prendere contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini delle MDA-MB-231 colonie sospese in matrice membrana basale (Figura 3A). Immagine 20 aree rappresentative a 10 volte più fine, una volta al giornoper cinque giorni per determinare colonia morfogenesi (Figura 3C).
14. Analizzare le immagini ciecamente per determinare colonia di cellule stellate formazione (Figura 3B). Una colonia è considerata stellate se una o più sporgenze dal sferoide di cellule sono percepiti. Per determinare la percentuale di colonie stellate invasive, dividere il numero di colonie stellate per il numero totale di colonie di cellule per immagine acquisita, e poi la media delle colonie stellate percentuali delle 20 immagini per ogni giorno.

Figura 1. Cultura tridimensionale di MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in matrice membrana basale (la tecnica incastro). AB) Uno schema del setup sperimentale (eseguita nella cappa). C) Il pozzo del piatto fondo di vetro rivestitocon 50 ml di matrice membrana basale. D) Lavastoviglie (es) posto in un incubatore di coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO ₂₎ per consentire la matrice a solidificare per almeno 30 min. state tripsinizzate E) Cellule. F ) Le cellule sono state risospese in una provetta conica da 15 ml. GH) Cells (presenti nel tubo conico) sono stati centrifugati a 100 xg per 3 minuti in un tessuto cultura centrifuga. I) pellet. J) Cells (che sono stati centrifugati) sono stati risospesi in 1 ml di FBS-integrata mezzo RPMI. K) Le cellule sono state contate con un emocitometro. L) 2,5 x 10 ⁴ cellule aliquotati in provetta e condito con appropriati mezzi di comunicazione in modo da ottenere il volume totale di 50 microlitri. M ) Mescolare cellule dal punto 1.7 (25.000 cellule in 50 microlitri) con il tubo per microcentrifuga matrice contenente da passo 1,5 in rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 μ., L N) piastra delicatamente 100 ml di matrice: miscela di cellule dal punto 8 sul piatto matrice rivestite solidificato dal punto 1.2 O) Una volta che la matrice: miscela di cellule è solidificato, aggiungere 2 ml di mezzi di RPMI FBS-integrati a. il piatto. P) porre il recipiente in incubatrice dove sarà memorizzato per il resto dell'esperimento.

2. Esame delle caratteristiche morfogenetiche delle Culture 3D con immunofluorescenza

1. Impostare un vassoio di ghiaccio, fosfato freddo soluzione tamponata (PBS), 20% di acetone: 80% di metanolo (soluzione fissativo), e il 3% albumina sierica bovina (BSA, soluzione bloccante) (Figura 2A) prima di prendere il piatto (es) dall'incubatore.
2. Porre la capsula (es) sul vassoio ghiaccio e aspirare media, poi lavare 3x con 2 ml di PBS freddo (Figura 2B).
3. Dopo l'ultimo lavaggio PBS viene aspirato, aggiungere 2 ml di 20% acetone: soluzione di metanolo 80% nel piatto (es) (Figura 2C (Figura 2D).
4. Dopo il 20 min di fissazione è terminata, portare i piatti indietro a temperatura ambiente, aspirare il fissativo, e successivamente lavare 3x con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio PBS viene aspirato, aggiungere 2 ml di 3% BSA al piatto (es) per bloccare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 2E).
5. Durante il periodo di blocco preparare diluizioni di primaria (laminina V 1:100) e anticorpi secondari (ad una diluizione appropriata) disciolti in 3% di siero albumina bovina (BSA) tampone di bloccaggio. Si prega di notare che 400-500 microlitri della soluzione 'BSA anticorpo primario +' deve essere aggiunto direttamente sulla matrice: miscela di cellule.
6. Una volta che il blocco di 30 min scaduta, aggiungere l'anticorpo primario e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2F). Si prega di notare che non lavaggi PBS devono essere eseguiti seguendo la 30 min blockinperiodo di g.
7. Al termine della fase 2.6, rimuovere la soluzione 'BSA + primario di anticorpi', e lavare 3x con PBS.
8. Aggiungere l'anticorpo secondario disciolto in 3% BSA (ad una diluizione appropriata) direttamente sulla matrice: miscela di cellule, coprire i piatti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (figura 2G).
9. Rimuovere la soluzione 'BSA + anticorpo secondario', e lavare 3x con PBS.
10. Aggiungere 2 ml di Hoechst 33258 (1:10.000) disciolti in PBS per nuclei colorazione, e incubare per 5 min sotto un foglio di alluminio (o coprire con un contenitore opaco per limitare fotoscolorimento) (Figura 2H).
11. Una volta che la 5 min di incubazione con Hoechst 33258t sono scaduti, lavare il piatto (es) 5x con PBS.
12. Aggiungere mezzo di montaggio direttamente sulla matrice: miscela di cellule nel piatto confocale e coprire con coprioggetto vetro con cautela per evitare indurre eventuali interruzioni per l'integrità delle colonie nel matri membrana basalex: miscela di cellule (Figura 2I).
13. Lasciare il piatto (es) per asciugare tutta la notte (o 24 ore) a temperatura ambiente (Figura 2I). Una volta asciutto, il piatto (es) può essere conservato a -20 ° C, ma si raccomanda che essi dovrebbero essere ripreso al più presto.
14. Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza con opportune lunghezze d'onda laser di anticorpi utilizzati (Figure 3D-E).

Figura 2. Esame delle culture 3D mediante immunofluorescenza. . A) Uno schema del setup sperimentale B) Dish (es) posto sulla vaschetta del ghiaccio e dei media aspirato; Successivamente le cellule sono state lavate tre volte con 2 ml di PBS freddo C) 2 ml di 20% acetone:. soluzione di metanolo 80% aggiunto nel piatto (es) D) Fissare le cellule per.20 min a 4 ° C (sul ghiaccio, o in frigorifero). E) 2 ml di 3% BSA aggiunto al piatto (es) per bloccare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. F) Una volta che il 30 min di blocco sono scaduti, aggiungere gli anticorpi primari e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente G) anticorpi secondari disciolti in 3% BSA (ad una diluizione appropriata) sono stati aggiunti direttamente sulla matrice membrana basale:. miscela di cellule; . successivamente piatti coperti e incubate per 1 ora a temperatura ambiente H) 2 ml di Hoechst (1:10.000; disciolto in PBS) aggiunto alla dishe (i) e le cellule incubate per 5 minuti sotto un foglio di alluminio I) Soluzione di montaggio aggiunto direttamente. sulla matrice: miscela di cellule nel piatto confocale e il piatto è coperto con vetrino coprioggetti. Lavastoviglie (es) essicca per una notte (o 24 ore) a temperatura ambiente.

Risultati

Un esempio dei MDA-MB-231 cellule invasione nel matrice 3D è illustrato in Figura 3C. Le celle sono incorporate in una matrice (giorno 1), e cominciano a formare invasive (stellate) strutture dal giorno 3, e completamente invadono nella matrice da 5 ° giorno (Figura 3C). Il numero di colonie formate stellate sono contati, ed espresso come percentuale del numero totale di colonie per piastra (invasive e non invasive). Inoltre, poiché le misurazioni vengono effettuate giornalmente per cin...

Discussione

Lo sviluppo delle tecniche di coltura cellulare 3D ha permesso ai ricercatori di studiare la trasformazione di cellule epiteliali mammarie, che ci permette di visualizzare i drammatici cambiamenti morfologici. Oltre ad analizzare invasione cellulare, sferoidi epiteliali mammarie singole o multicellulari possono essere usate per valutare i cambiamenti nella adesione cellulare, la proliferazione, la dimensione e basale-apicale polarità. In contrasto con metodologie precedentemente riportati in cui le cellule vengono sovra...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette da 1,5 ml	VWR	CA10011-700	Sterile,
monouso Piastra di coltura da 100 mm BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, monouso
Provetta Falcon da 15 ml	VWR	CA21008-918	Sterile, monouso
1 ml Puntali filtrati	VWR	10011-350	Sterile, monouso
200 μ l puntali filtrati	VWR	22234-016	Sterili, monouso
20 μ l puntali filtrati	VWR	22234-008	Piastre di
coltura confocali n. 1 sterili monouso da 35 mm con fondo di vetro	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Preraffreddato prima dell'uso
Albumina sierica bovina (BSA)	BioShop	ALB003.100	Utilizzato al 3% per IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, altamente adsorbito	in modo incrociato Life Technologies	A11029	1:250 per IF
Alexa Fluor 568 capra anti-coniglio IgG (H + L) anticorpo	Life Technologies	A11011	1:1.200 per IF
Anti-Beta-catenina	BD Transduction Laboratories	610153	monoclonale di topo; Utilizzato a 1:100 per IF
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma	F1051	Utilizzato al 10% (v/v)
Hoechst 33258, pentaidrato (bis-benzimide) - 10 mg⁄ ml di soluzione in Water	Life Technologies	H3569	utilizzato allo 0,1% (diluizione 1:10.000)
InVivo Analyzer Suite	Cibernetica		utilizzata per l'imaging di colture 3D (immagini DIC a 10X e 40X)
Kisspeptina-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	utilizzata a 100 nM
Anti-laminina	Cedarlane	AB19012(CH)	Coniglio-policlonale a figura intera umano; Utilizzato in scala 1:100 per
il microscopio a scansione laser IF LSM-510 META	Zeiss		Utilizzato con obiettivo 63X; lente ad immersione in olio
Matrigel senza rosso fenolo (BD356237)	VWR	CACB356237	Lotto n.2180819;
Microscopio Olympus IX-81	Olympus		Utilizzato per l'imaging di colture 3D (immagini DIC a 10X e 40X)
Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antibiotico (aggiunto al terreno; utilizzato allo 0,01%)
Pipetta da 10 ml	VWR	CA53300-523	sterile e monouso
con Glutammine	Life Technologies	11875-119	Utilizzato per la coltura di cellule
MDA-MB-2310,25% Tripsina-EDTA (1x), Rosso fenolo	Life Technologies	25200-072	Utilizzato per tripsinizzare le cellule MDA-MB-231
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Quotazioni singole (CC4136)	Lonza	CC-3150	Utilizzato per la coltura di cellule MCF10A