Qui si descrive un protocollo con il mini-himar1 mariner trasposone-mediata mutagenesi per generare una libreria mutante inserimento ad alta densità per schermo, isolare ed identificare i regolatori alginato romanzo nel prototipo Pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1.
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Articolo metodologico
Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, batterio ambientale con versatili capacità metaboliche. P. aeruginosa è un batterio patogeno opportunista che stabilisce le infezioni polmonari croniche in pazienti con fibrosi cistica (CF). La sovrapproduzione di un polisaccaride capsulare chiamato alginato, noto anche come mucoidy, promuove la formazione di biofilm mucoide che sono più resistenti rispetto alle cellule planctoniche alla chemioterapia antibiotica e difese dell'ospite. Inoltre, la conversione dal nonmucoid al fenotipo mucoide è un marcatore clinico per l'insorgenza di infezione cronica in CF. Sovrapproduzione alginato di P. aeruginosa è un processo ergoniche che tassa pesantemente energia cellulare. Di conseguenza, la produzione di alginato è altamente regolamentato in P. aeruginosa. Per capire meglio regolamentazione alginato, si descrive un protocollo utilizzando il mini-himar1 trasposone mutagenesi per l'identificazione di regolatore alginato romanzos in un ceppo PAO1 prototipo. La procedura si compone di due fasi fondamentali. In primo luogo, abbiamo trasferito il trasposone mini-himar1 (pFAC) dall'host E. coli SM10/λpir in destinatario P. aeruginosa PAO1 via coniugazione biparental per creare una libreria di mutante inserimento ad alta densità, che sono stati selezionati su piastre di isolamento di Pseudomonas agar addizionato con gentamicina. In secondo luogo, abbiamo proiettato e isolate colonie mucoidi per mappare il sito di inserimento attraverso inversa PCR usando primer DNA puntano verso l'esterno dal cassetto gentamicina e sequenziamento del DNA. Usando questo protocollo, abbiamo identificato due nuovi regolatori di alginato, MUCE (PA4033) e kinB (PA5484), in ceppo PAO1 con una wild-type Muca che codifica per il fattore anti-sigma Muca per il regolatore di alginato maestro AlgU (ALGT, σ 22) . Questo protocollo mutagenesi ad alta produttività può essere modificato per l'identificazione di altri geni di virulenza legate causando variazione colony morfologia.
Introduzione
La capacità del opportunistica, patogeno Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa produrre in eccesso alginato è un fattore importante nella sua capacità di stabilire un biofilm. La sovrapproduzione di alginato è un fenotipo spesso indicato come mucoidy. L'isolamento di colonie mucoidi dal espettorati di individui affetti da fibrosi cistica (CF) è indicativo di una infezione cronica, ed è direttamente associata ad un declino generale della salute del paziente 1. Attualmente, resta inteso che la regolazione e la produzione di alginato in P. aeruginosa si verifica principalmente a due operoni. Il primo è l'operone biosintetica alginato,....
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Protocollo
1. Preparazione di ceppi batterici e biparental Coniugazione
- Seminare E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml di Luria Broth (LB), completata con 15 mg / ml di gentamicina e posto in un incubatore agitazione durante la notte a 37 ° C.
- Seminare P. aeruginosa ceppo PAO1 in 5 ml di LB, e posto in un incubatore agitazione per una notte a 42 ° C.
- Misurare OD 600 di culture durante la notte e mescolare quantità uguali di PAO1 ed E. coli pFAC tale che il volume finale è compreso tra 1-1,4 ml.
- Miscela centrifugare a 6000 xg per 5 min.
- Nel frattempo, asciugare piastre LB per la coniugazione: lasci....
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Risultati
Come illustrato nella Figura 1, il mini-himar1 mariner trasposone vettore, pFAC, contiene due ripetizioni invertite 27 bp con siti di inserzione TA fiancheggianti la cassetta resistenza aacC1 gentamicina, con il suo promotore σ 70-dipendente, e un sito di clonazione multipla (MCS). Inoltre, il vettore pFAC contiene i geni che codificano la transposase altamente attiva himar1, β-lattamasi (bla), e l'operone trasferimento tra. I siti di inserzion.......
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Discussione
È importante notare che questo metodo può essere utilizzato in altre specie Pseudomonas con queste alterazioni: incubare P. fluorescens e P. putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri deve essere coltivato su piastre LB addizionato con 150 mg / ml di gentamicina, sul passo 1.11, pag cellule stutzeri devono essere trasferiti in 500 ml di LB invece di 1 ml. Inoltre, ci sono due passaggi critici per questo protocollo. In primo luogo, il ceppo ricevente.......
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Dichiarazioni
L'autore Hongwei D. Yu è il Chief Science Officer e co-fondatore di ProGenesis Technologies, LLC.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Aeronautics and Space Administration West Virginia Spazio di Grant Consorzio Nazionale (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) e NIH P20RR016477 e P20GM103434 all'idea Network West Virginia per la Ricerca Biomedica Eccellenza. Ringraziamo Vonya M. Eisinger per l'assistenza tecnica con questo lavoro.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Luria Brodo | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolazione agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific Piccole |
| Piastre (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Grandi Piastre (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Incubatore con agitazione da banco | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | agitazione a 200 giri/min |
| Incubatore ad armadio | VWR | 1540 | |
| Microcentrifuga da banco | Sorvall | 75-003-287 | tramite Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spettrofotometro | Bio-Rad | 170-2525 | o metodo/fornitore preferito |
| Anelli di inoculazione monouso | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Fiale criogeniche da 2,0 ml | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| Provette da 15 ml | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Latte scremato | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Sangue e Tessuti (250) | Qiagen | 69506 | o il metodo/fornitore preferito |
| Kit di purificazione PCR QIAquick (250) | Qiagen | 28106 | o il metodo/fornitore preferito |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | o il metodo/fornitore preferito |
| Kit di legatura del DNA FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | tramite Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | tramite Fisher Scientific |
| Sal1, endonucleasi di restrizione | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | tramite Fisher Scientific |
| Taq DNA polimerasi | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarosio | Genemate | 3120-500 | tramite Fisher Scientific |
| Gentamicina solfato | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Fiale criogeniche da 2,0 ml | Corning | 430659 | tramite Fisher Scientific |
Riferimenti
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. ....
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Ristampe e permessi
