È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

20.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/51354

⸱

30 aprile 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

In questo articolo

Sommario

La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l'identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.

Abstract

A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l'utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l'evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l'applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate 1-4.

Introduzione

Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 5. A partire dal 1950 6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano 7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le indagini di myogenesis a causa del poco tempo da precursore delle cellule differenziate 10, relativa facilità di trasfezione per RNAi 11-14, transgenici 15,16 e iperespressione studi 14,17,18, l'espansione in vitro seguita da trapianto in vivo 18-20, e anche compArison di cellule precursori miogeniche e ai loro agenti di regolazione tutta taxa 21,22. Mentre le differenze dovute all'ambiente artificiale del sistema di coltura sono stati descritti 5,23, questi sistemi in vitro hanno dimostrato di essere indispensabile al nostro dissezione del programma intricato regolamentano la formazione di multinucleate, myofibersfrom terminalmente differenziate mononucleate cellule progenitrici proliferative conosciuti come myosatellite cellule (MSC) tra i mammiferi.

Al di fuori della classe Mammalia, tuttavia, la conservazione e / o divergenza di meccanismi che controllano myogenesis sono capiti male, soprattutto a causa della difficoltà di coltura di cellule precursori mioblaste (PPM) e mioblasti da diversi taxa. Infatti, colture primarie di mioblasti sono stati descritti solo in tre uccelli 24-26, un rettile 27, un paio di anfibi 28-30, e alcuni pesci 1,3,4,31-33. Linee cellulari continue miogeniche da vertebrates diversi roditori 34-36 sono ancora più rari, con l'unica linea non-mammiferi miogenico delle cellule essendo derivata da quaglia giapponese (Cortunix japonica), QM7 37. Nonostante i molti tentativi di immortalization, una linea cellulare miogenico teleosteo rimane sfuggente e un protocollo per la trasfezione efficiente di queste cellule è stato pubblicato solo quest'anno 15. Quindi, sono molto necessari protocolli chiari e ben ottimizzato per la coltura PPM primari e mioblasti da una varietà di vertebrati, non solo per espandere ulteriormente la nostra conoscenza dell'evoluzione del programma miogenico, ma di utilizzare il potere della fisiologia comparata a fare progressi in il trattamento di malattie muscolari scheletriche ei disturbi umani.

Mentre la letteratura contiene molte segnalazioni di MPC / mioblasti isolamento 38-49, è comune per gli autori per descrivere i protocolli per tali isolamenti in breve, spesso incompleti, formati. Inoltre, i protocolli più istruttivi pronti contro termineVALIDITA sono stati sviluppati per i topi 50-53, e alcuni di questi contare su selezione di anticorpi 54,55 o transgeni fluorescenza 56,57, rendendo questi protocolli inutilizzabile o impraticabili intimi specie di non roditori utilizzati dai biologi muscolari. Con poco conosciuto su piscine, anfibi, rettili e miogenesi, un protocollo dettagliato e approfondito, descritta con una guida audiovisiva e con efficienza dimostrata in specie lontanamente imparentati, sarebbe più utile per il campo.

In primo luogo descritto da Powell e colleghi nel 1989 58, il seguente protocollo è stato inizialmente sviluppato per isolare PPM e mioblasti da pesci salmonidi (vale a dire, trota iridea, Oncorhynchus mykiss, e salmone atlantico, Salmo salar) e alcuni ciprinidi più grandi (ad esempio pesci rossi, Carassiusauratusauratus) . Nel 2000, Fauconneau e Paboeuf ottimizzati una cultura mioblasti primario per la trota iridea 59, e minoroptimizations made che il protocollo utilizzabile in diversi pesciolini piccoli del clade Danioninae (zebrafish, Danio rerio, e Danio giganti, Devario Aequipinnatus) 32 a causa dei molti strumenti genetici disponibili per il lavoro zebrafish e quindi i suoi parenti stretti. Pesci teleostei sono organismi interessanti per lo studio a causa della loro strategia di crescita divergente (almeno nella maggior parte delle specie). Grandi salmonidi, come la maggior parte dei pesci, crescono indeterminato, con un potenziale di crescita illimitato da parte di un asintoto alla scadenza, anche in età 60-62. A differenza di zebrafish, grandi danionins come il danio gigante 63 e potenziali di crescita visualizzazione Danio baffuti tipici dei pesci teleostei, rendendo la loro diretta giustapposizione una piattaforma ideale per capire se la scelta del destino cellulare MPC svolge un ruolo nella iperplasia muscolo scheletrico contro l'ipertrofia.

Allo stesso modo, abbiamo dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato con topi e axolotl, con rendimento relativamente elevato cellulare e viabindici ility. Salamandre urodèle, come l'axolotl messicano (Ambystomamexicanum), possiedono la straordinaria capacità di rigenerare i tessuti, anche di interi arti e code di 64-66. Questa caratteristica rende questi anfibi interessanti modelli di atrofia muscolare scheletrico e l'invecchiamento. Utilizzando il protocollo descritto di seguito, un approccio simile può essere effettuata come è stato fatto in molte specie di pesce, fornendo un contesto comparativo ancora più ampia per tali studi. Come molti biologi veramente apprezzare comparativi, i progressi più significativi nel campo della biologia di base e traslazionale biomedicina possono essere fatte quando i dati vengono analizzati all'interno dello spettro più ampio (qui, l'intera stirpe dei vertebrati).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione sugli animali vertebrati qui descritti è stato approvato in via preliminare dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Alabama a Birmingham ed è coerente con le linee guida stabilite dal Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health degli Stati Uniti Dipartimento di Salute e Servizi Umani.

1. Preparazione per la Cultura

  1. Preparare il terreno base come segue: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) in DMEM (13,48 g / L; 26,96 g per 2 L).
    1. Determinare il pH e regolare a 7,40 con HCl o NaOH.
    2. Determinare osmolalità e regolare a ~ 300 mOsm con NaCl (se necessario).
    3. Filtro sterilizzare con (2) sistemi di sterilizzazione 1 L di vuoto e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per un massimo di 2-3 mesi.
      NOTA: vedere tabelle 1 e 2 per la completa reagenti, strumenti, consumAbles, e di informazione.
  2. Preparare-L-lisina trattati poli piastre sciogliendo 5 mg di γ-irradiati poli-L-lisina (> 300.000 mw) in 50 ml di acqua ultrapura sterile. Mescolare delicatamente per inversione per 10 minuti a temperatura ambiente, assicurando la piena dissoluzione dei polimeri lisina.
  3. Pipettare la quantità necessaria di poli-L-lisina soluzione in ogni pozzetto, secondo il tipo di placca (Tabella 3). Lasciare le piastre a stare in cappa a flusso laminare per 5 minuti.
  4. Quindi, rimuovere poli-L-lisina soluzione e lavare due volte con acqua sterile. Lasciare le piastre di aria secca in cappa a flusso laminare per 20 minuti.
  5. Ottenere 1 mg di laminina (origine Engelbreth-Holm-Swarm) e sciogliere in 50 ml di terreno base ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Applicare la soluzione laminina alle piastre di coltura cellulare poli-L-lisina trattati a 2 mg / cm 2. (Cfr. tabella 3 per le diverse dimensioni della piastra)
  6. Agitare delicatamente la soluzione per assicurare full bene la copertura. Sigillare le piastre con nastro adesivo di laboratorio e posto in incubatrice per 24 ore. L'incubatore deve essere impostato a temperatura appropriata per specie utilizzata (vedi Tabella 7), e nessun gas aggiuntivi devono essere aggiunti alla incubatrice.
    NOTA: laminina deve poter aderire alle piastre per 24 ore prima della semina di cellule. In caso contrario, si provocherebbe un calo di alcuna adesione cellulare.
  7. Preparare il supporto come descritto nella Tabella 4. Supporto completo sia meglio preparato il giorno di utilizzo.
  8. In preparazione per l'isolamento dei tessuti, assemblare i seguenti elementi e autoclave: 300-500 bicchiere ml (s); Piatti di vetro Petri; gestisce bisturi; pinze (fine e grossolano); forbici dissezione; e diversi fogli di carta autoclave acqua-repellente.
    NOTA: Per ogni persona che assiste con il processo di dissezione, (2) maniglie bisturi, (1) pinza (tipo a seconda delle preferenze personali), (1) forbici dissezione, e (5-10), fogli di carta autoclave idrorepellente sonosufficiente.
  9. Oltre agli elementi sopra autoclave, assemblare etanolo al 70%, un bilanciamento del peso, provette coniche da 50 ml sterili (numero dipende dalla dimensione della cultura), e ghiaccio.

2. Dissezione dei tessuti

  1. Prima di iniziare, assicurarsi che uno stock sufficiente di pesce è disponibile.
    NOTA: L'età del pesce da utilizzare è di importanza critica. Mentre i pesci di due specie diverse possono essere di pesi simili, un pesce più giovane di una specie si possiedono più PPM di un pesce più vecchio di un'altra specie. Come regola generale, i pesci più giovani, soprattutto quando si lavora con salmonidi, sono i migliori. Per danionins, il pesce vecchio di un anno può essere utilizzata in modo ottimale, mentre i salmonidi di età 4-6 mesi o più giovani (fino a 15 g) sono ottimali.
  2. Per ogni 5 g di tessuto che deve essere sezionato, aliquota di 25 ml di terreno di isolamento in un tubo da 50 ml sterile.
  3. Pesare, massa record e il numero del tubo (s). Mettere le provette su ghiaccio.
  4. Euthanize 2-3 pescialla volta per immersione in> 300 mg / L di sodio bicarbonato tamponata tricaine metansolfonato. Consentire movimento dell'opercolo cessare per> 5 minuti e poi immergere pesce in etanolo al 70% (contenuto nei contenitori sterili) per 30 secondi.
  5. Rimuovere il pesce dal 70% di etanolo e mettere su carta autoclave idrorepellente. Direttamente dietro la opercoli, usare un bisturi per fare un superficiale, poco profonda incisione. Rimuovere le squame e la pelle afferrando la pelle alla incisione di cui sopra e tirare verso la coda del pesce.
  6. Dopo la rimozione della pelle, asportare il epaxial, fast-glicolisi muscolare 'bianco' del pesce da entrambi i lati (evitando il muscolo lento-ossidativo 'rosso' si trova vicino alla linea laterale) e il luogo in terreno di isolamento. Scartare il resto del pesce come richiesto dalla istituzione.
    Cellule Mentre è del tutto possibile PPM cultura provenienti da muscolo rosso, quasi ogni pubblicazione utilizzando teleosteo MPC ha utilizzato isolati dal epaxial m: NOTAyotome.
  7. Ripetere i passaggi 2,4-2,6 fino ad ottenere una sufficiente quantità di muscolo. Durante la dissezione, assicurarsi che il tessuto muscolare pool rimane sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare.

3. Dissociazione meccanica

  1. Versare un tubo di 25 ml / 5 g di muscoli in una piastra di Petri di vetro. Utilizzando due bisturi manici con allegato # 10 lame bisturi, trita tessuto una consistenza fangosa o purea. Un movimento "avanti e indietro" di tirare le lame di bisturi passato vicenda funziona meglio.
    NOTA: Mentre omogeneizzatori tessuto possono sembrare del caso, il numero di cellule vitali sarà drasticamente ridotto, se non abolita.
  2. Usando una pipetta 25 ml sierologica e pipetta sierologica, rimuovere il tessuto impastato e sostituire nel tubo conico originale.
  3. Ripetere i passaggi 3.1-3.2 finché tutti i tessuti in tutte le provette è stato dissociato meccanicamente.
  4. Tessuto Centrifugare per 5 minuti a 300 xg e 10 ° C.
  5. Follcentrifugazione causa, eliminare i ml 25 di media surnatante con una pipetta 25 ml sierologica, aspiratore, o da un attento decantazione.
  6. Aggiungere 25 ml di mezzo di lavaggio per ogni tessuto tubo, risospendere e recentrifuge come sopra.
  7. Lavare due volte con mezzo di lavaggio, rimuovendo il supernatante ogni volta.

4. Enzimatica dissociazione

  1. Durante la fase 3.4, preparare la soluzione collagenasi unendo 0,22 g di tipo IV collagenasi e 44 ml di terreno di base (o quantità sufficiente a 0.11 g/0.22 ml).
  2. Mescolare in un becher per 10-15 minuti a 4 ° C. Filtro sterilizzare con una siringa da 50 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron.
    NOTA: Più di un filtro a siringa può essere necessario, a seconda della preparazione collagenasi. Collagenase ottenuto da fornitori diversi Worthington Biochemical pone maggiori difficoltà durante la filtrazione. Collagenase viene utilizzata per dissociare legami peptidici in collagene che costituiscono l'endomisio. Questodigestione rimuoverà la barriera protettiva delle miofibre.
  3. Per ogni g di tessuto muscolare, risospendere il tessuto in una soluzione di collagenasi allo 0,2%. Per 5 g di tessuto muscolare, aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi e 15 ml di terreno base.
  4. Aggiungere 10 ml di FPF per ml di collagenasi soluzione a medio / base (ad esempio, 250 ml a 25 ml). Assicurarsi che il tessuto è ben sospeso, in quanto questo influenzerà l'efficienza della digestione enzimatica.
  5. Incubare il tessuto muscolare in collagenasi per 60 minuti a 18 ° C con dolce dondolio. A seconda del grado di dissociazione meccanica e specie, collagenasi digestione può essere esteso a 90 minuti, anche se questo può influenzare la vitalità cellulare.
  6. Seguendo tubi digestione collagenasi, centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere tessuto in 25 ml di terreno di lavaggio.
  7. Recentrifuge a 300 x g per 5 minuti a 126; C. Ripetere con mezzo di lavaggio una seconda volta.
  8. Dopo tessuto lavaggio due volte, risospendere tessuto muscolare in 25 ml di mezzo di lavaggio e triturare con 10 ml pipetta sierologica finché il tessuto / medio omogenato passa dentro e fuori della pipetta con relativa facilità. 5-10 triturazioni di solito è sufficiente.
    1. Ripetere con 5 ml pipetta sierologica e poi una cannula metallica 16 attaccato ad una siringa.
  9. Provette per centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Decantare il surnatante.
  10. Durante la centrifugazione sopra di 5 minuti, preparare la soluzione tripsina digestione combinando 0,25 g di tripsina con 5 ml di terreno base.
  11. Agitazione a 4 ° C per 10-15 minuti e filtro sterilizzare con una siringa da 20 ml e 0,45 micron filtro a siringa.
  12. Recuperare provette coniche e aggiungere 100 ml di soluzione di tripsina e 4,9 ml di mezzo di dissociazione per ogni 1 g di tessuto muscolare di ogni tubo. Per example, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina e 24,5 ml di dissociazione medio per 5 g di tessuto muscolare.
    NOTA: La tripsina è una serina proteasi che separerà cellule precursori miogenici dalla lamina basale.
  13. Tessuto Risospendere in tripsina / dissociazione medie dimensioni, ben. Incubare per 20 minuti a 18 ° C.
  14. Seguendo la prima incubazione tripsina, provette coniche centrifugare a 300 xg per 1 min a 12 ° C.
  15. Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento. Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina.
  16. Per il pellet residuo di tessuto, ripetere i passaggi 4,12-4,15, combinando il supernatante seguente passo 4.15 con il fluido supernatante / isolamento dalla prima digestione tripsina.
  17. ALTERNATIVA: Le digestioni collagenasi e tripsina possono essere combinati per massimizzare le rese delle cellule.
    1. A tale scopo, triturare la collagenasi digest utilizzando una cannula metallica (6 in lunghezza e 16 gauge funziona meglio) attaccato ad una siringa da 20 ml fino omogenato passa facilmente attraverso la cannula.
    2. Per l'omogeneizzato, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina (preparato nella fase 4.10) e incubare a 18 ° C per 20 minuti.
    3. Seguendo le provette di incubazione, centrifugare conici a 300 xg per 1 minuto a 12 ° C.
    4. Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento.
    5. Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina.
    6. Procedere con il punto 4.18 come con il protocollo standard.
  18. Distribuire la miscela di medio surnatante / isolamento finale in 50 ml provette coniche e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 12 ° C.
  19. Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non disturbare la cellapellets. Pipettare 2 ml di terreno completo in ogni provetta, dissolvendo ogni pellet di cellule.
  20. Combinare cellule sospese in terreno completo in una provetta conica da 50 ml.
  21. Risciacquare ogni provetta con 1 ml di terreno completo, combinandosi con il pool di cellule risospese in precedenza.
  22. Triturare con una cannula metallica e siringa 5-10 volte.
  23. Filtrare sospensione cellulare attraverso un filtro 100 micron cella, lavando con mezzo completo.
  24. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella 40 pm.
  25. Aggiungere mezzo completo sufficienti a 50 ml e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 15 ° C.

5. Conteggio, diluizione e semina delle cellule

  1. Dopo la centrifugazione finale nel passo 4,25, rimuovere il surnatante da un'attenta decantazione o con una pipetta sierologica. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di terreno completo.
  2. Con le celle completamente risospese, rimuovere 20 pl; Della sospensione cellulare e posto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
  3. Aggiungere 5 ml di Trypan colorante blu e attendere 5 minuti. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule vitali.
  4. Su determinazione, diluire celle alla concentrazione necessaria. Teleosteo PPM sono meglio seminati a 150.000-200.000 cellule per cm 2. Per una strategia sei pozzetti placcatura, diluendo cellule a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml supporta proliferazione e differenziazione sufficiente.
  5. Recupera-L-lisina poli-trattati, piatti laminina rivestite e cellule di semi. (Vedi Tabella 5 per diluizioni specifico targa e volumi di placcatura.) Nota: La tabella 6 illustra numero medio di cellule isolate per grammo di tessuto muscolare isolati da varie specie di teleostei. La trota iridea (O. mykiss) esporre un minor numero di PPM per grammo di tessuto muscolare che fare zebrafish (D. rerio) e verrà quindi richiederà più pesce per isolare da per una corretta semina.
  6. Sigillare piastre con nastro laboratorio e posto in incubatrice refrigerazione alla temperatura appropriata. PPM di tutte le specie qui elencate (salvo per i topi), possono essere incubate in condizioni atmosferiche normali senza anidride carbonica (CO 2) integrazione. (Vedi Tabella 7).
  7. ALTERNATIVA: Alcuni laboratori hanno adottato un protocollo che richiede permettendo PPM di aderire al substrato di coltura per 40 minuti.
    1. Poi risciacquare piastre con mezzi di lavaggio per rimuovere eventuali cellule debolmente attaccate e non aderenti. Attenzione: Questo passaggio è molto importante per evitare l'adesione "non-specifico" di altre cellule (ad esempio fibroblasti) alla substrati cultura.
    2. Aggiungi mezzi di comunicazione completi e cellule posto in incubatrice e la cura per come di seguito dettagliato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche (PPM) devono essere visibili attaccato al substrato laminina (vedi figure 1a e 1d). Dopo la semina, le cellule (PPM) adottano una forma mandrino-like, indicativa di questo tipo di cellule (figura 1) e sono MyoD1 + (Figura 2). Nelle specie Danio, PPM sembrano essere più compatto, con piccoli processi bipolari che fanno PPM da Oncorhynchus e Salmo specie. Tuttavia...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull'isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie p...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Non c'è nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano estendere molte grazie al Drs. Josep Planas e Juan Castillo per le loro competenze professionali per lo sviluppo e l'applicazione di questo protocollo cultura di piccoli pesci e anfibi. Un ringraziamento anche a causa delle innumerevoli persone che hanno instancabilmente assistito con la dissezione e la dissociazione del tessuto muscolare da molti pesci (sia nelle specie e numero), tra cui Matthew ricarica, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, e Sinibaldo Romero. Questo lavoro è stato sostenuto da University of Alabama a Birmingham Dipartimento di fondi di start-up Biologia, Centro per la Ricerca proteasi NIH di Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS di Grant # R03AR055350, e NDSU Advance AVANTI NSF di Grant # HRD-0.811.239 di PRB. Il sostegno è stato fornito anche dalla UAB Nutrition Obesity Research Center di aggiudicazione # P30DK056336, NIH NIDDK. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamenterappresentano la posizione ufficiale del NIH.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tabella 1. Informazioni dettagliate sui reagenti
reagenti(preferito vs. alternativo)Numero di catalogo (preferito v. alternativo)Quantità per coltura
γ-irradiato poli-L-lisinaSigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM (glucosio alto)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
LamininBD Biosciences ( Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
di bicarbonato di sodio (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1,51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9,53 g
Antibiotico/AntimicoticoThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 ml di
gentamicina solfatoLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 mL
Sieri equini donatoriThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
Sieri fetali boviniThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 mL
Collagenasi (Tipo IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0,44 g
Tripsina (dal pancreas)MP Biomedicali (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
Tabella 2. Materiali di consumo, strumenti e attrezzature
Strumenti di consumoAttrezzature
Piastre per colture cellulariPinze (grossolane)Pipettatore
Sterile Provette coniche da 50 mLPinze (fini)Misuratore di
Nastro da laboratorioManici per bisturi Incubatoredi raffreddamento (Echotherm)
0,2 μ m Sistemi di sterilizzazione sottovuotoLame per bisturi (#10, #11)Cappa
laminare Autoclave idrorepellenteForbici chirurgicheCollettore
Pipette sierologiche Piastredi Petri in vetroMisuratore
12-16 G Cannule con Luer Locks
Tabella 3. Volumi ottimizzati per il rivestimento di piastre per colture cellulari
Dimensioni della piastracm^2 per pozzettoPoli-L-lisina*Laminina**
6 pozzetti9,51,6 mL1
24 pozzetti1,90,320,2 48
pozzetti0,950,160,1
96 pozzetti0,320,060,03
*0,1 mg/mL concentrazione** 0,020 mg/mL concentrazione
Tabella 4. Terreni per l'isolamento, la dissociazione e la coltura
ReagenteIsolamento LavaggioDissociazione
Base Terreno419,25 mL395,40 mL297,00 mL
Gentamicina solfato**0,75 mL0,60 mL-Siero
equino donatore75,00 mL--
Siero fetale bovino***---
* PSF: cocktail di penicillina/streptomicina/fungizone (100x); ** Concentrazione di 50 mg/mL; Caratterizzato
Tabella 5. Diluizioni e volumi di placcatura consigliati
Dimensione della piastracm^2 per pozzettodi diluizione della placcatura
6 pozzetti9,51,5-2,0x10^6 cellule/mL1 mL
24 pozzetti1,91,5-2,0x10^6 cellule/mL250 μ L
48 pozzetti0,951,5-2,0x10^6 cellule/mL150 μ L
96 pozzetti0,321,5-2,0x10^6 cellule/mL50-100 μ L
Tabella 6. Numero medio di cellule per g di tessuto
SpecieMedia # cellule/g di tessuto
Danio rerio6.400.000
Danio dangila1.783.000
Devario aequipinnatus1.797.000
Oncorhynchus mykiss66.800
Tabella 7. Temperature di incubazione consigliate
Temperaturadella specie
Danio/ Devario spp.26 - 28 gradi C
Oncorhynchus/Salmo spp.10* - 18 gradi C
Ambystoma mexicanum18° C
* Temperature più basse favoriscono tassi di proliferazione più bassi.
Azienda disierologicopHa flusso di carta a vuoto di microosmolalità Volume

Riferimenti

  1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
  2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
  3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
  4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
  5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
  6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
  7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
  8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
  9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
  10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
  11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
  12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345(2010).
  13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
  14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
  15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
  16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
  17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
  19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
  20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
  21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
  22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
  23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
  24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
  25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
  26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
  27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
  28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
  29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
  30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
  31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
  33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
  35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
  37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
  39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
  40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
  41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
  42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
  43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
  44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
  45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
  46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
  47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
  48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
  50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
  51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
  52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
  54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
  57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
  58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
  60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
  61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
  62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
  63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
  64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
  65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
  66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
  67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
  69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
  70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
  71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
  72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
  73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
  74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
  75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
  76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
  77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
  78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
  79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
  80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
  81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
  82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
  83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule precursori miogenichecoltura cellulare primariadissezione dei tessutidissociazione meccanicadissociazione enzimaticatrattamento con collagenasisubstrato di lamininasemina cellularesaggio di miogenesimodello zebrafish
Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.