Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Sommario

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione.

Abstract

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Tuttavia, piattaforme attuali hanno diversi fattori limitanti, come il lavoro intensivo preparazione del campione, limiti di rilevabilità bassi, velocità di scansione lenta, ottimizzazione del metodo intensivo per ciascun metabolita, e l'incapacità di misurare sia positivamente e ioni negativi in ​​singoli esperimenti. Pertanto, un nuovo protocollo metabolomica potrebbe avanzare gli studi di metabolomica. Cromatografia idrofilo a base di ammide consente analisi metabolita polare senza derivatizzazione chimica. Alta risoluzione MS utilizzando il Q-Exactive (QE-MS) ha migliorato ottica ionica, maggiore velocità di scansione (256 msec alla risoluzione di 70.000), e ha la capacità di svolgere / commutazione positiva e negativa. Utilizzando una strategia di estrazione metanolo freddo, e accoppiando una colonna ammide con QE-MS consente robusta rilevamento di 168 metaboliti polari mirati e migliaia di funzionalità aggiuntive contemporaneamente. Datun trattamento avviene con il software disponibile in commercio in un modo altamente efficiente, e caratteristiche sconosciute estratte dagli spettri di massa può essere interrogato in database.

Introduzione

Metabolomica, definiti come un esperimento che misura più metaboliti contemporaneamente, è stata una zona di forte interesse. Metabolomica fornisce una lettura diretta di fisiologia molecolare e ha fornito intuizioni in sviluppo e malattie come il cancro ^1-4. Risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria cromatografia-massa del gas (GC-MS) sono tra gli strumenti più comunemente utilizzati ^5-9. NMR, in particolare è stato utilizzato per esperimenti di flusso in quanto composti marcati con isotopi pesanti, come ad esempio ¹³ metaboliti C etichettati, sono NMR attivo ^10,11. Tuttavia, questa strategia richiede relativamente elevata purezza del campione e grandi quantità di campione, il che limita le sue applicazioni in metabolomica. Nel frattempo, i dati raccolti da NMR analisi delle esigenze intensiva e assegnazione composta di spettri NMR complesso è difficile. GC-MS è stato ampiamente utilizzato per metaboliti polari e studi lipidici, ma richiede componen volatilids e quindi spesso derivatizzazione dei metaboliti, che a volte coinvolge la chimica complessa che può richiedere molto tempo e introduce rumore sperimentale.

Cromatografia liquida (LC) accoppiato a tripla spettrometria di massa a quadrupolo utilizza il primo quadrupolo per selezionare gli ioni madri intatte, che vengono poi frammentate nel secondo quadrupolo, mentre il terzo quadrupolo viene utilizzato per selezionare frammenti caratteristici o ioni figlia. Questo metodo, che registra il passaggio da ioni madri a specifici ioni figlia, è denominata multiple reaction monitoring (MRM). MRM è un metodo molto sensibile, preciso e robusto sia per piccole molecole e proteine ​​quantificazione ^12-15,21. Tuttavia, MRM ha i suoi limiti. Per ottenere un'elevata specificità di un metodo MRM deve essere costruita per ogni metabolita. Questo metodo consiste nell'identificare un frammento specifico e corrispondente energia di collisione ottimizzata, che richiede pre-conoscenza della propeproprietā dei metaboliti di interesse, come ad esempio informazioni di struttura chimica. Pertanto, con alcune eccezioni che comportano la perdita neutro di frammenti comuni, non è possibile identificare metaboliti non noti con questo metodo.

Negli ultimi anni, la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) strumenti sono stati rilasciati, come la serie LTQ-Orbitrap e Exactive, il QuanTof, e TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS possono fornire una massa rapporto carica (m / z) degli ioni intatto, per un errore di pochi ppm. Pertanto, uno strumento HRMS operato da rilevare tutti gli ioni precursori (cioè modalità di scansione completa) può ottenere informazioni strutturali diretto dalla massa esatta e la composizione elementare risultante dell'analita, e queste informazioni possono essere utilizzate per identificare potenziali metaboliti. Infatti, tutte le informazioni relative ad un composto può essere ottenuta con una massa esatta, fino al livello di isomeri strutturali. Inoltre, una completametodo di scansione non richiede conoscenza precedente dei metaboliti e non richiede l'ottimizzazione metodo. Inoltre, poiché tutti gli ioni con m / z compreso nel range di scansione possono essere analizzati, HRMS ha una capacità praticamente illimitata in termini di numero di metaboliti che possono essere quantificati in una sola passata rispetto al metodo MRM. HRMS è paragonabile ad un MRM triplo quadrupolo capacità quantitativa causa del breve ciclo di lavoro con un conseguente numero paragonabile di punti di dati che possono essere ottenuti in una MS scansione completa. Pertanto, HRMS offre un approccio alternativo per metabolomica quantitativi. Recentemente, una versione migliorata del HRMS chiamato spettrometria di massa Q-Exactive (QE-MS) può essere utilizzato sotto la commutazione tra i modi positivi e negativi con tempi di ciclo sufficientemente veloce in un unico metodo, che amplia il campo di rilevamento ^19. Qui si descrive la nostra strategia metabolomica utilizzando il QE-MS.

Protocollo

1. Preparazione di LC-MS Reagenti, Istituzione di un metodo cromatografico, e Istituzione di strumenti procedure operative

1. Preparazione di solventi LC
   1. Preparare 500 ml fasi mobili. A è acetato di ammonio 20 mM e 15 mM idrossido di ammonio in 3% acetonitrile / acqua, pH finale 9.0; e B è 100% acetonitrile.
   2. Liberamente tappo della bottiglia, metterla in un sonicatore bagnomaria, e sonicare per 10 minuti senza riscaldamento supplementare. (Questo passaggio è quello di garantire che tutti i sali di ammonio dissolvono completamente e che non ci siano bolle d'aria residue.)
   3. Trasferire 250 ml di solvente per una bottiglia di vetro da 250 ml per uso LC-MS, e mantenere il resto a 4 ° C.
2. Preparare la soluzione di taratura gamma bassa di massa. E 'importante utilizzare una gamma bassa massa miscela personalizzata calibrazione per applicazioni metabolomica per garantire che masse accurate vengono rilevati a basso peso molecolare.
   1. Pesare 5 mg sia sodium fluoroacetate e acido omovanillico e sciogliere in 5 ml di acqua per fare una concentrazione finale di 1 mg / ml. Sciogliere diazinon in metanolo per effettuare una concentrazione finale di 10 mg / ml.
   2. Per preparare 1 ml di soluzione negativa basso calibrazione di massa, mescolare 960 ml di soluzione negativa termo calibrazione con 20 ml di fluoroaceate sodio e soluzione di acido omovanillico. Per fare 1 ml di soluzione positiva a basso calibrazione di massa, mescolare 990 ml di termo soluzione di calibrazione positivo e 10 ml di soluzione diazinone. (La soluzione di taratura massa bassa deve essere conservato a 4 ° C ed essere preparato fresco ogni 2 mesi).
3. Taratura di QE-MS ad una Messa Low Range
   1. Prima di eseguire la calibrazione gamma bassa massa, effettuare una calibrazione massa standard (m / z, 150-2,000) in modalità sia positivi che negativi in ​​base alle istruzioni del produttore.
   2. Una volta che passa una calibrazione di massa regolare, regolare l'intervallo di scansione a 60-900 m / z nel pannello di controllo dello strumentoe viene applicato un CID fonte di 25 eV per modalità positiva e 35 eV per modalità negativa. (Questo darà segnali stabili del frammento ione caffeina e lo ione solfato. L'intervallo di scansione qui è fisso, perché l'ultima m / z non deve essere maggiore di 15x del partendo m / z)
   3. Una volta che la sorgente di ioni è stabile, quindi eseguire la calibrazione personalizzato. Nota: Una fonte stabile è definita come meno del 10% della variazione corrente ionica totale in modalità positiva, e meno del 15% in modo negativo. Gli ioni di calibrazione personalizzati e corrispondenti m / z sono elencati nella Tabella 1.
4. Stabilire la strumentazione LC-MS per l'analisi metabolita polare. LC è accoppiato ad un QE-MS per la separazione metabolita e rilevamento.
   1. Dotare il QE-MS con una sonda di ionizzazione elettrospray riscaldata (H-ESI). Impostare i parametri di ottimizzazione rilevanti per la sonda elencati: temperatura del riscaldatore, 120 ° C; gas guaina, 30; gas ausiliario, 10; spazzare gas, 3; spruzzo di tensione, 3,6 kV permodalità positiva e 2,5 kV per modalità negativa. Impostare la temperatura capillare a 320 ° C, e S-lente a 55.
   2. Costruire un metodo di scansione completa come segue: Fascia Scansione completa: da 60 a 900 (m / z); Risoluzione: 70.000; tempo massimo di iniezione: 200 msec con tempi di iniezione tipici intorno a 50 msec; controllo automatico del guadagno (AGC): 3.000.000 di ioni. Queste impostazioni determinano un ciclo di lavoro di circa 550 msec per eseguire scansioni in modalità sia positivi che negativi.
   3. Stabilire il metodo cromatografico. Impiegare una colonna ammide (100 x 2,1 mm di diametro, 3.5 mm) per la separazione composto a temperatura ambiente ^13,15. La fase mobile A è come sopra descritto, e la fase mobile B è acetonitrile. Utilizzare un gradiente lineare come segue: 0 min, 85% B; 1.5 min, 85% B, 5.5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 min, 85% B. La portata è di 0,15 ml / min tra 0 e 10 min e 15 per 20 min, e 0,3 ml / min 10,5-14,5 min.

2. Preparation del metabolita Campioni

1. Preparare un solvente di estrazione. Miscelare 40 ml di metanolo (LC-MS grado) e 10 ml di acqua (grado LC-MS) in un tubo da 50 ml, e tenerlo in freezer -80 ° C per almeno 1 ora prima dell'uso. Nota: Questa procedura e alle fasi che seguono possono essere modificati per l'estrazione di tessuto biologico e di campioni di fluido.
   1. Culture cancro colon HCT 8 cellule in tre 10 centimetri piatti o piastre da 6 pozzetti con terreno di coltura completo, RPMI 1640 supplementato con 10% inattivato al calore siero fetale bovino e 100.000 unità / L penicillina e 100 mg / L streptomicina.
   2. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere rapidamente il mezzo, e posizionare il piatto o piatto sulla parte superiore del ^13,15 ghiaccio secco. Aggiungere estrazione 1 ml di solvente immediatamente (80% metanolo / acqua), e trasferire la piastra al -80 ° C freezer. Per un piatto 10 cm e aggiungere 3 ml di solvente di estrazione per ciascun pozzetto. (Prova per rimuovere il mezzo più possibile per evitare l'effetto di soppressione ionica causa di sali residui di mezzo.)
   3. Lasciare la piastra per 15 min. Togliere dal freezer, e raschiare le cellule nel solvente in ghiaccio secco. Trasferire la soluzione in 1,7 ml provette Eppendorf e centrifugare con la velocità di 20.000 xga 4 ° C per 10 min. (Preparare metaboliti cellulari da tre piatti separati per fare tre campioni replicati. Lo scopo di mantenere due tubi è di avere uno come backup.)
   4. Trasferire il supernatante in due nuove provette Eppendorf, e asciugarli nel vuoto velocità. Questo richiede circa 3-6 ore a seconda della velocità di aspirazione utilizzata. (I campioni possono anche essere essiccate per una notte sotto gas azoto.)
   5. Dopo tubi di essiccazione, negozio di ciascun campione nel -80 ° C freezer. Quando si è pronti, ricostituire un campione in 20 ml di acqua (LC-MS grado), e iniettare 5 ml di LC-QE-MS per l'analisi.

3. Impostazione di Sequenza Campione

1. Una volta che la taratura è stata correttamente effettuata sul QE-MS, LC colonna equilibrare per 5 minuti con il 85% e ad un flussovelocità di 0,15 ml / min, che è la condizione iniziale della sfumatura LC.
2. Impostare la sequenza di esempio in ordine casuale. Nota: In questo modo, distribuisce le fluttuazioni introdotte dal LC-MS per ogni campione e assicura confronto più accurato tra diversi campioni. Ogni 6 campioni, aggiungere una pista di lavaggio, che condivide lo stesso metodo MS, tranne il gradiente LC è 95% A per 10 min e seguita da un 5 min colonna equilibrazione al 85% A con una portata di 0,15 ml / min. Aggiungere campioni bianchi (100% acqua) dopo ogni corsa lavaggio di valutare lo sfondo del sistema e riportare i livelli.
3. Salvare la sequenza e una volta che la colonna LC mostra la pressione stabile, circa 400 psi, inizia la corsa sequenza. Se non c'è altro campione è da eseguire dopo questa sequenza, quindi aggiungere una corsa di arresto alla fine della sequenza, che ha una portata di 0 ml / min alla fine del gradiente e scegliere "stand-by" dopo aver terminato l' sequenza.
4. Eseguire nuovamente lo stesso campione fissato 12 ore dopo la calibrazione. (Questo is per valutare la fluttuazione errore massa dopo la calibrazione.)

4. Post Analisi Strumento di pulizia e manutenzione

1. Al termine della sequenza, lavare la colonna con 95% Un ad una portata di 0,2 ml / min per 2 h, e se necessario, invertire la colonna prima del lavaggio.
2. Rimuovere la colonna LC e collegare direttamente il LC alla sorgente di ioni da un sindacato. Preparare detergente, acqua / metanolo / acido formico (v: v: v, 90:10:0.2), impostare MS in modalità standby, e sistema di lavaggio LC-MS ad una portata di 0,1 ml / min per 1 ora per rimuovere il residuo precipitato sali o altre impurità. Abbassare la portata se c'è pressione dell'impianto troppo.
3. Impostare la temperatura capillare a 50 ° C, e rimuovere la gabbia ione. Estrarre con attenzione il cono ione sweep e il condotto di trasferimento ionico dopo che la temperatura capillare scende a 50 ° C. Utilizzare una maglia ruvida come carta vetrata, per rimuovere le impurità lasciati sulla superficie del cono ione sweep.
4. Posizionare il trasferimento di ionitubo in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml di 90% di acqua / metanolo contenente 0,1% di acido formico. Dopo sonicating la provetta in un bagno sonicatore acqua per 20 minuti, decantare il solvente all'interno, sostituirlo con 10 ml di metanolo puro e con ultrasuoni per altri 20 min. (Se necessario, la sonicazione può essere effettuata a 40 ° C o una temperatura ancora più elevata per ottenere migliori risultati di lavaggio.)

5. Analisi LC-MS Data

1. Per la sequenza del campione senza intoppi, dopo aver terminato i primi due campioni della sequenza, controllare i picchi di metaboliti sconosciuti. Utilizzare un file csv che elenca i nomi dei metaboliti, formula chimica neutro e modalità di rilevamento (positivo o negativo), come file di input, e il file di output contiene picchi estratti ed errori di massa in ppm. Se la forma del picco è anormale o l'errore di massa è spento da più di 5 ppm, il resto della sequenza deve essere fermato e risoluzione di problemi deve essere fatto.
2. Scegliere il metodo di "allineamento piccoed estrazione frame "sul software disponibile in commercio. Selezionare i dati grezzi da LC-MS e di gruppo. Scegli campioni nel mezzo della sequenza di esecuzione come campione di riferimento cromatografia per l'allineamento di picco. Carica un seme telaio compresi i metaboliti noti per l'analisi dei metaboliti mirato con i dati raccolti e il relativo seme telaio.
3. Effettuare l'analisi dei dati in modalità positiva e negativa separatamente. Utilizzare l'impostazione predefinita per gli altri parametri. Disattivare la funzione di ricerca del database ed eseguire il flusso di lavoro. Esportare i dati elaborati da un foglio excel contenente area del picco di ogni frame. Il primo set di fotogrammi corrispondono ai metaboliti nel elenco mirato. Nota: Per un'analisi metabolita mirata, le informazioni metaboliti è ottenuta sulla base degli studi precedenti ^13,15.
4. Per un'analisi metabolita non mirati, scegliere il metodo di "estrazione componente". Caricare i campioni in bianco per sottrazione del fondo. Impostare picco di intensità soglia di unt 10 ^5, larghezza m / z di 10 ppm e rapporto segnale-rumore di 3.
5. Utilizzare il database metabolome umano per l'identificazione di composti sconosciuti. Utilizzare un filtro CV a rimuovere i componenti con grandi curricula all'interno di campioni replicati. Passare manualmente ogni componente e scegliere quelli con picchi ben definiti o relativamente grande differenza in diversi tipi di campioni per la ricerca nel database. I dati di esportazione con risultati in database. (Allineamento Peak potrebbe essere aggirato se il punteggio di allineamento picco è troppo bassa.)

Risultati

L'accuratezza dei dati metabolomica dipende molto dalle prestazioni LC-QE-MS strumento. Per valutare se lo strumento funziona in buone condizioni, e se il metodo applicato è corretto, diversi metaboliti noto picchi LC sono estratte dal cromatografia ionica totale (TIC), come mostrato nella Figura 1. Metaboliti polari inclusi amminoacidi, intermedi glicolisi , intermedi TCA, nucleotidi, vitamine, ATP, NADP ⁺ e così via hanno una buona conservazione delle colonne e buon picco di forme nella col...

Discussione

I passaggi più critici per successo profiling metabolita in cellule usando questo protocollo sono: 1) controllo del mezzo di crescita e attenta estrazione delle cellule; 2) regolazione del metodo LC basato su MS configurazione metodo per assicurarsi che ci sia un numero sufficiente (di solito almeno 10) punti dati attraverso un picco per la quantificazione; 3) fare una calibrazione bassa massa prima di eseguire campioni; 4) l'iniezione non più di 5 ml di evitare tempi di ritenzione spostamento e allargamento della c...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Miscela di calibrazione positiva	Thermo Scientific	#88323	È sensibile alla luce. Conservare a 4 gradi C
Miscela di calibrazione negativa	Thermo Scientific	#88324	Conservare a 4 gradi C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	Provoca irritazione agli occhi, quindi lavorare nel cappuccio. Conservare a 4 gradi C
Inserto per aghi H-ESI	Fisher Scientific	#1303200	Questo potrebbe essere sostituito o pulito con acido formico/acqua al 5% (rimuovere l'anello di gomma) se intasato.
colonna Xbridge amide	Waters	#186004860	Guard per aumentare la durata della colonna.