Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione.
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Articolo metodologico
Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Tuttavia, piattaforme attuali hanno diversi fattori limitanti, come il lavoro intensivo preparazione del campione, limiti di rilevabilità bassi, velocità di scansione lenta, ottimizzazione del metodo intensivo per ciascun metabolita, e l'incapacità di misurare sia positivamente e ioni negativi in singoli esperimenti. Pertanto, un nuovo protocollo metabolomica potrebbe avanzare gli studi di metabolomica. Cromatografia idrofilo a base di ammide consente analisi metabolita polare senza derivatizzazione chimica. Alta risoluzione MS utilizzando il Q-Exactive (QE-MS) ha migliorato ottica ionica, maggiore velocità di scansione (256 msec alla risoluzione di 70.000), e ha la capacità di svolgere / commutazione positiva e negativa. Utilizzando una strategia di estrazione metanolo freddo, e accoppiando una colonna ammide con QE-MS consente robusta rilevamento di 168 metaboliti polari mirati e migliaia di funzionalità aggiuntive contemporaneamente. Datun trattamento avviene con il software disponibile in commercio in un modo altamente efficiente, e caratteristiche sconosciute estratte dagli spettri di massa può essere interrogato in database.
Introduzione
Metabolomica, definiti come un esperimento che misura più metaboliti contemporaneamente, è stata una zona di forte interesse. Metabolomica fornisce una lettura diretta di fisiologia molecolare e ha fornito intuizioni in sviluppo e malattie come il cancro 1-4. Risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria cromatografia-massa del gas (GC-MS) sono tra gli strumenti più comunemente utilizzati 5-9. NMR, in particolare è stato utilizzato per esperimenti di flusso in quanto composti marcati con isotopi pesanti, come ad esempio 13 metaboliti C etichettati, sono NMR attivo 10,11. Tuttavia, questa strategia richiede relativament....
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Protocollo
1. Preparazione di LC-MS Reagenti, Istituzione di un metodo cromatografico, e Istituzione di strumenti procedure operative
- Preparazione di solventi LC
- Preparare 500 ml fasi mobili. A è acetato di ammonio 20 mM e 15 mM idrossido di ammonio in 3% acetonitrile / acqua, pH finale 9.0; e B è 100% acetonitrile.
- Liberamente tappo della bottiglia, metterla in un sonicatore bagnomaria, e sonicare per 10 minuti senza riscaldamento supplementare. (Questo passaggio è quello di garantire che tutti i sali di ammonio dissolvono completamente e che non ci siano bolle d'aria residue.)
- Trasferire 250 ml di solvente per una bottiglia di vetro....
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Risultati
L'accuratezza dei dati metabolomica dipende molto dalle prestazioni LC-QE-MS strumento. Per valutare se lo strumento funziona in buone condizioni, e se il metodo applicato è corretto, diversi metaboliti noto picchi LC sono estratte dal cromatografia ionica totale (TIC), come mostrato nella Figura 1. Metaboliti polari inclusi amminoacidi, intermedi glicolisi , intermedi TCA, nucleotidi, vitamine, ATP, NADP + e così via hanno una buona conservazione delle colonne e buon picco di forme nella.......
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Discussione
I passaggi più critici per successo profiling metabolita in cellule usando questo protocollo sono: 1) controllo del mezzo di crescita e attenta estrazione delle cellule; 2) regolazione del metodo LC basato su MS configurazione metodo per assicurarsi che ci sia un numero sufficiente (di solito almeno 10) punti dati attraverso un picco per la quantificazione; 3) fare una calibrazione bassa massa prima di eseguire campioni; 4) l'iniezione non più di 5 ml di evitare tempi di ritenzione spostamento e allargamento della c.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Università della Pennsylvania) per le discussioni importanti sul calibrazione di massa ed elaborazione dei dati. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R00CA168997. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Miscela di calibrazione positiva | Thermo Scientific | #88323 | È sensibile alla luce. Conservare a 4 gradi C |
| Miscela di calibrazione negativa | Thermo Scientific | #88324 | Conservare a 4 gradi C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | Provoca irritazione agli occhi, quindi lavorare nel cappuccio. Conservare a 4 gradi C |
| Inserto per aghi H-ESI | Fisher Scientific | #1303200 | Questo potrebbe essere sostituito o pulito con acido formico/acqua al 5% (rimuovere l'anello di gomma) se intasato. |
| colonna Xbridge amide | Waters | #186004860 | Guard per aumentare la durata della colonna. |
Riferimenti
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al.
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Ristampe e permessi
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Protocollo di metabolomicaAnalisi dei metaboliti polariCromatografia idrofila a fase inversa (Amide)Q-Exactive MSEstrazione con metanolo freddoEstrazione dei picchi dei metabolitiSoftware di elaborazione datiAnalisi metabolomica non mirataRilevamento mirato dei metabolitiCalibrazione dell'errore di massa
