Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

Summary

Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.

Abstract

La corteccia cerebrale è caratterizzata da molteplici strati e molti tipi di cellule distinte che insieme come rete sono responsabili per molte funzioni cognitive superiori, tra cui il processo decisionale, il comportamento sensoriale-guidata o memoria. Per comprendere come tali reti neuronali intricate eseguire operazioni, un passo fondamentale è quello di determinare la funzione (o attività elettrica) di tipi di cellule individuali all'interno della rete, preferibilmente quando l'animale sta eseguendo un compito cognitivo rilevante. Inoltre, è altrettanto importante determinare la struttura anatomica della rete e l'architettura morfologica dei singoli neuroni per consentire reverse engineering rete corticale. Innovazioni tecniche oggi disponibili consentono di registrare l'attività cellulare in sveglio, comportandosi animali con la possibilità preziosa di post hoc identificare i neuroni registrati. Qui, dimostriamo la tecnica di etichettatura juxtasomal biocitina, che coinvolge l'azione di registrazione potenziometroal chiodare nella configurazione extracellulare (o loose-patch) con pipette di patch convenzionali. La configurazione di registrazione juxtasomal è relativamente stabile e applicabile a tutte le condizioni comportamentali, tra cui anestetizzato, sedato, sveglio testa fissa, e anche in animali liberi di muoversi. Pertanto, questo metodo consente il collegamento cellulare-tipo di azione specifico potenziale chiodare nel comportamento animale alla ricostruzione dei singoli neuroni e, in definitiva, l'intera microcircuito corticale. In questo video manoscritto, mostriamo come singoli neuroni nella configurazione juxtasomal possono essere etichettati con biocitina nel ratto uretano-anestetizzato per l'identificazione post hoc e la ricostruzione morfologica.

Introduction

Reti neuronali consistono di tipi cellulari diversi, caratterizzati da altamente specifiche proprietà morfologiche e fisiologiche ^1-7. Di conseguenza, tipi di cellule individuali eseguono compiti specializzati all'interno della rete (si veda ad esempio Gentet et al. ⁸ e Burgalossi et al. ^9). Stiamo solo cominciando a capire le funzioni di tipo specifico di cellule attraverso le reti neuronali e molto è ancora da scoprire. A tal fine, molti laboratori stanno attuando approcci sperimentali che consentono l'analisi delle proprietà morfologiche della stessa popolazione neuronale da cui sono stati ottenuti i param....

Protocol

1. Preparazione del animale

Tutte le procedure sperimentali sono svolte in conformità con la legge olandese e previa valutazione da parte di un comitato etico locale presso la VU University Amsterdam, Paesi Bassi.

1. Anestetizzare un ratto Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) con isoflurano (2-3% di ossigeno) e successivamente con uretano (20% in 0,9% NaCl, 1.6-1.7 g / kg) mediante iniezione intraperitoneale. Valutare la profondità dell'anestesia monitorando il ritiro pizzico, riflessi palpebra, e movimenti vibrisse.
2. Somministrare una dose aggiuntiva di uretano (10% della dose iniziale) nel caso l'animale non raggiunge suffic....

Results

La conoscenza dettagliata sulla struttura 3D dei singoli neuroni è fondamentale per chiarire i principi organizzativi delle reti neuronali. Il nostro metodo prevede un gasdotto per ottenere l'etichettatura biocitina alta qualità da una preparazione in vivo, consentendo in tal modo la classificazione post hoc neuronale e la ricostruzione dettagliata di dendritica e l'architettura assonale di singoli neuroni ad alta risoluzione. A seconda della qualità di etichettatura juxtasomal, i neuroni sono recupera.......

Discussion

Il metodo juxtasomal permette la registrazione in azione vivo potenziale chiodare da singole unità le varie patologie comportamentali (anestetizzati, sveglio testa fissa o muoversi liberamente) con l'opzione di-biocitina etichettatura del neurone registrato per la post hoc tipo di cellula di classificazione e / o ricostruzione 3D. Il principale vantaggio è quello di ottenere parametri fisiologici nella configurazione extracellulare (quindi non invasiva), essendo ancora in grado di etichett.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di controllo SM-6	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 amplificatore	Neuralynx
Axoclamp-2B amplificatore	Axon Instruments
Osada modello EXL-M40	Osada, Inc.
Dispositivo piezoelettrico	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		Software di acquisizione LabView
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Tamponi assorbenti Sugi	Kettenbach	30601
Citocromo C da cuore equino	Sigma	C2506
Catalasi da fegato bovino	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain standard ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Uretano	Sigma	U2500
Isoflurano	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaina	Sigma	L5647
Simplex cemento dentale rapido	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocitina	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
base Trizma	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Glicerolo di grado analitico	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072