Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

Summary

Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.

Abstract

La corteccia cerebrale è caratterizzata da molteplici strati e molti tipi di cellule distinte che insieme come rete sono responsabili per molte funzioni cognitive superiori, tra cui il processo decisionale, il comportamento sensoriale-guidata o memoria. Per comprendere come tali reti neuronali intricate eseguire operazioni, un passo fondamentale è quello di determinare la funzione (o attività elettrica) di tipi di cellule individuali all'interno della rete, preferibilmente quando l'animale sta eseguendo un compito cognitivo rilevante. Inoltre, è altrettanto importante determinare la struttura anatomica della rete e l'architettura morfologica dei singoli neuroni per consentire reverse engineering rete corticale. Innovazioni tecniche oggi disponibili consentono di registrare l'attività cellulare in sveglio, comportandosi animali con la possibilità preziosa di post hoc identificare i neuroni registrati. Qui, dimostriamo la tecnica di etichettatura juxtasomal biocitina, che coinvolge l'azione di registrazione potenziometroal chiodare nella configurazione extracellulare (o loose-patch) con pipette di patch convenzionali. La configurazione di registrazione juxtasomal è relativamente stabile e applicabile a tutte le condizioni comportamentali, tra cui anestetizzato, sedato, sveglio testa fissa, e anche in animali liberi di muoversi. Pertanto, questo metodo consente il collegamento cellulare-tipo di azione specifico potenziale chiodare nel comportamento animale alla ricostruzione dei singoli neuroni e, in definitiva, l'intera microcircuito corticale. In questo video manoscritto, mostriamo come singoli neuroni nella configurazione juxtasomal possono essere etichettati con biocitina nel ratto uretano-anestetizzato per l'identificazione post hoc e la ricostruzione morfologica.

Introduction

Reti neuronali consistono di tipi cellulari diversi, caratterizzati da altamente specifiche proprietà morfologiche e fisiologiche ^1-7. Di conseguenza, tipi di cellule individuali eseguono compiti specializzati all'interno della rete (si veda ad esempio Gentet et al. ⁸ e Burgalossi et al. ^9). Stiamo solo cominciando a capire le funzioni di tipo specifico di cellule attraverso le reti neuronali e molto è ancora da scoprire. A tal fine, molti laboratori stanno attuando approcci sperimentali che consentono l'analisi delle proprietà morfologiche della stessa popolazione neuronale da cui sono stati ottenuti i parametri fisiologici ^1,10-15. Qui, dimostriamo l'etichettatura tecnica juxtasomal ^16,17 che comporta registrazioni elettrofisiologiche utilizzando pipette di patch convenzionali nella configurazione extracellulare (quindi non invasiva) in combinazione con elettroporazione del neurone registrato con biocitina. Ilgrande vantaggio di questo approccio è che la natura non invasiva assicura che l'azione potenziale spiking dei singoli neuroni viene registrato senza alterarne (es. dialisi) il contenuto intracellulare della cellula. Seguito da elettroporazione, l'approccio juxtasomal offre la possibilità di identificazione del post hoc delle cellule e la ricostruzione di collegare la funzione (fisiologia) alla struttura (morfologia). In genere, la ricostruzione morfologica prevede la ricostruzione della morfologia dendritica e assonale che può essere estesa a quantificazione di colonna vertebrale e / o bouton densità o anche la ricostruzione della morfologia neuronale a risoluzione nanometrica usando la microscopia elettronica. La tecnica di registrazione juxtasomal può essere utilizzata per le registrazioni in vivo di vari tipi di cellule attraverso strati corticali o in aree sub-corticali in una vasta gamma di specie, anche se la maggior parte degli studi hanno applicato la tecnica a piccoli roditori come topi o ratti. La nostra ricerca è focalizzata sulla registrazione e l'etichettatura dei neuronidi ratto corteccia somatosensoriale primaria (S1) e coinvolge l'identificazione visiva dei neuroni registrati ^18, ricostruzioni dendritiche in combinazione con la registrazione precisa in un sistema di riferimento standardizzato per decodificare le reti corticali ^4,19 e la ricostruzione dettagliata di architettura assonale per caratterizzare locale specifico tipo di cellule e lungo raggio proiezione obiettivi ^20.

Rispetto al vivo di tecniche alternative di registrazione (intracellulari o cellule intere), le registrazioni juxtasomal sono relativamente stabili e possono quindi essere applicate attraverso gli stati comportamentali tra cui anestetizzato ^21,22, sedati ^14, sveglio testa fissa ^23, o anche liberamente in movimento animali ⁹ . Qui vi mostriamo etichettatura juxtasomal in S1 di un ratto uretano-anestetizzato, anche se sottolineiamo l'applicabilità generale di questa tecnica per molte preparazioni di scelta.

Protocol

1. Preparazione del animale

Tutte le procedure sperimentali sono svolte in conformità con la legge olandese e previa valutazione da parte di un comitato etico locale presso la VU University Amsterdam, Paesi Bassi.

1. Anestetizzare un ratto Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) con isoflurano (2-3% di ossigeno) e successivamente con uretano (20% in 0,9% NaCl, 1.6-1.7 g / kg) mediante iniezione intraperitoneale. Valutare la profondità dell'anestesia monitorando il ritiro pizzico, riflessi palpebra, e movimenti vibrisse.
2. Somministrare una dose aggiuntiva di uretano (10% della dose iniziale) nel caso l'animale non raggiunge sufficiente profondità dell'anestesia o quando si osservano contrazioni Vibrissae durante il corso dell'esperimento.
3. Posto l'animale anestetizzato sul telaio stereotassico dotato di una piastra elettrica, inserire sonda di temperatura rettale e mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37,5 ± 0,5 ° C da una piastra elettrica.
4. posizione della testa dell'animale nel frame stereotassico, tagliare i capelli sulla sommità della testa con le forbici per rendere la pelle visibile.
5. Iniettare 100 ml 1% lidocaina (in 0.9% NaCl) per via sottocutanea per l'anestesia locale nel sito dell'operazione e aspettare 3-5 minuti. Rimuovere la pelle che copre la superficie del cranio tagliando in direzione caudale-to-rostrale e pulire il tessuto rimanente.
6. Pulire il cranio ampiamente con 0,9% di NaCl e tamponi assorbenti.
7. Determinare le coordinate della zona di destinazione sulla emisfero sinistro (per la corteccia somatosensoriale primaria (S1): 2.5 mm posteriore e 5,5 millimetri lateralmente bregma). Segnare la posizione sul cranio con un pennarello pelle chirurgico.
8. Raschiare l'osso delicatamente da un trapano dentistico dalla regione di interesse finché l'osso diventa trasparente e vasi sanguigni sono chiaramente visibili.
9. Fare un 0,5 millimetri x 0,5 millimetri craniotomia tagliando una finestra nel cranio assottigliata con un bisturi (# 11), evitando di danneggiare la dura madree vasi sanguigni. Optional: segnare i bordi della craniotomia con un pennarello pelle chirurgico per migliorare la visibilità.
10. Applicare un sottile strato di colla sul cranio secco e poi cemento dentale per costruire una vasca (cioè camera di registrazione) che racchiude la craniotomia.
11. Tagliare i baffi a lato controlaterale esattamente a 5 mm dal follicolo baffo. Facoltativo: evidenziare i baffi tagliati con mascara nero.

2. Juxtasomal Recordings e biocitina Etichettatura

1. Fai pipette di patch di vetro borosilicato con diametro interno di punta di circa 1 micron di ottenere elettrodi con 3-5 resistenza mW. Nota: La morfologia pipetta ideale per la registrazione juxtasomal è un cono graduale esile, un angolo di cono basso, e un ~ 1 micron punta (Figura 1).
2. A seconda della profondità di registrazione (rispetto alla superficie piale), le dimensioni del cono elettrodo di registrazione devono essere regolati. Criticamente importante è che tegli cono diametro dovrebbe essere inferiore a 75 micron al punto di entrata nel cervello per evitare danni meccanici o stress per l'area di registrazione. Ciò indica che per le registrazioni superficiali corticali, un cono di 300-500 micron, con un diametro esterno massimo di 75 micron è necessaria (Figura 1A) che registrazioni da strati corticali relativamente profondi richiedono una conicità più di 1,500-1,800 micron, di nuovo con esterno massimo diametro di 75 micron (a 1.800 micron dalla punta dell'elettrodo).
3. Caricare la pipetta di patch con la normale suoneria di ratto (NRR) integrato con il 2% biocitina (vedi Tabella 1 per le soluzioni e reagenti) e montare la pipetta di patch su un palco testa fissata ad un micromanipolatore.
4. Impostare l'angolo della porta elettrodo a 34 ° rispetto al piano sagittale per indirizzare specificamente colonna D2 di ratto S1.
5. Collegare il palcoscenico testa ad un amplificatore in bridge-mode (cioè pinza corrente).
6. Posizionare la patchpipetta in prossimità della craniotomia. Riempite la vasca con 0,9% di NaCl e determinare la resistenza degli elettrodi, che dovrebbe essere tra 3-5 mW, valutato applicando un impulso quadrato con iniezione di corrente positiva (1 nA, 200 msec on / off).
7. Stabilire sovrapressione di 100-150 mbar e far avanzare la pipetta di patch a 1 micron passi durante l'applicazione corrente positiva come impulsi quadrati (1 nA, 200 msec on / off). Monitorare la variazione di resistenza robusta momento stabilire un contatto con la dura madre. A questo punto, impostare le coordinate del micromanipolatore a 'zero' per consentire misurazioni precise di profondità.
8. Anticipo in 1 micron step-mode fino a quando la pipetta di patch penetra la dura madre indicata da un improvviso calo di resistenza dell'elettrodo. Rimuovere la pressione della pipetta azienda.
9. Ricerca di singole unità, mentre avanza in 1 micron passi. Monitorare la resistenza di continuo mediante l'applicazione di 200 msec on / off impulsi. Un aumento della resistenza dell'elettrodo typicalleato indica la vicinanza di un singolo neurone. Far avanzare l'elettrodo fino potenziale d'azione positiva (AP) forme d'onda di ~ 2 mV sono registrati (Figure 2A e 2B).
10. Facoltativo: registrare il pattern spiking spontanea del neurone e determinare baffo-spiking evocata da, per esempio, caudalmente deviando basette singole per 200 msec ad un angolo di 3,3 ° utilizzando un dispositivo piezoelettrico ^18.
11. Far avanzare l'elettrodo fino a quando la resistenza è 25-35 mW e picchi hanno ampiezze di 3-8 mV per ottenere condizioni ottimali di riempimento juxtasomal. Avviare il ripieno juxtasomal applicando impulsi quadrati di corrente positiva (1 nA, 200 msec on / off). Lentamente e gradualmente aumentare la corrente a passi di 0,1 nA monitorando la forma d'onda AP e frequenza (Figure 2A e 2B).
12. Controllare l'apertura membrana come un chiaro aumento della frequenza AP durante la su-fase dell'impulso blocco (Figura 2C ). La forma d'onda picco durante il riempimento mostra un aumento della larghezza e ridotto (Figure 2C e 2D), dopo-iperpolarizzazione. Parametri supplementari includono un aumento del rumore o un piccolo (1-5 mV) spostamento DC negativo.
13. Aumentare o diminuire la corrente (1 nA), mentre il riempimento di mantenere stabile biocitina infusione. Ridurre o interrompere impulsi di corrente al momento improvviso aumento della frequenza AP per evitare la tossicità da eccesso afflusso di ioni extracellulari, come ioni sodio. Nota: ogni neurone risponderà in modo diverso per l'iniezione e juxtasomal corrente devono essere regolati in base alle condizioni di registrazione singoli parametri di etichettatura.
14. Strettamente monitorare il segnale dopo l'arresto della iniezione di corrente. La forma d'onda picco dopo una sessione di riempimento è di solito allarga e mostra una forte riduzione dopo iperpolarizzazione. Attendere recupero del neurone, che è evidente quando la forma d'onda di picco ritorna alle sue proprietà originali (ossia presenza dinormale, Figura dopo-iperpolarizzazione 2).
15. Ripetere biocitina riempimento sessioni dopo la completa ripresa del neurone per aumentare il carico biocitina per migliorare la qualità della colorazione.
16. Ritrarre la pipetta di patch a passi di 1 micron fino a quando l'ampiezza picco scende a ridurre ogni stress meccanico alla cella. Attendere almeno 1 ora per il biocitina di diffondere intracellulare mentre strettamente controllo della temperatura corporea dell'animale e la respirazione.

3. Perfusione animali e rimozione del cervello

1. Preparare il setup perfusione, lavare, e precaricare il tubo con il 0,9% di NaCl.
2. Posizionare l'animale su un vassoio chirurgico e fissare con nastro adesivo etichettatura standard. Garantire una sufficiente profondità dell'anestesia; pizzico piede e riflessi palpebrali dovrebbero essere assenti.
3. Effettuare una mediale a laterale incisione (5-6 cm) attraverso la parete addominale appena sotto la gabbia toracica e procedere in direzione antero-posteriore per esporre lo sterno.Tirare sterno anteriormente e separare accuratamente il fegato dal diaframma.
4. Fai una piccola incisione nella membrana, tagliare le costole inferiori e continuare l'incisione per tutta la lunghezza della cavità addominale per esporre il cuore.
5. Rimuovere il pericardio.
6. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro e fare un'incisione nell'atrio destro. Profumato con 0,9% di NaCl (~ 8 ml / min) fino a decolorazione del fegato è completa.
7. Passare l'infusione al 4% paraformaldeide (PFA) fino rigidità della zampa anteriore e la mascella inferiore è evidente.
8. Decapitare il ratto usando un paio di forbici
9. Rimuovere i restanti muscoli del collo ed esporre completamente il cranio.
10. Posizionare le forbici nel tronco cerebrale sul lato dorsale e tagliare l'osso attentamente lungo la sutura sagittale, mantenendo la posizione dorsale.
11. Rimuovere le ossa da entrambi i lati della sutura sagittale per esporre il cervello con pinze. Rimuovere con attenzione la dura per evitare dAmage.
12. Inserire delicatamente una spatola smussato al lato ventrale del cervello e rimuovere il cervello delicatamente.
13. Post-fissare l'intera notte cervello in PFA a 4 ° C. Accendere il cervello per 0,05 M tampone fosfato (PB) e conservare a 4 ° C.

4. Affettare il cervello nelle sezioni tangenziali

1. Prendete il cervello fuori dal 0,05 M PB e metterlo su una carta da filtro fronte anteriore. Utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare il cervelletto lungo il piano coronale e separare gli emisferi tagliando lungo il piano sagittale intermedio.
2. Applicare supercolla sulla piattaforma di montaggio e montare l'emisfero sinistro sul suo piano sagittale con anteriore rivolto verso destra. Fissare la piattaforma di montaggio ad un angolo di 45 ° su un vibratome e immergere il cervello in 0,05 M PB.
3. Assicura una lama di rasoio sul vibratome e assicurarsi che il primo contatto con la superficie del cervello è al centro del piano antero-posteriore dell'emisfero. Tagliare 24 100 micronsezioni e raccoglierle in una piastra a 24 pozzetti contenenti 0,05 M PB.

5. Procedure istologiche

1. Eseguire protocolli istologici per la citocromo ossidasi colorazione ²⁴ e il-biotina-perossidasi avidina metodo secondo metodi precedentemente descritti ^25. Optional: visualizza biocitina utilizzando coniugato avidina fluorescente / streptavidina-Alexa. Questo permette inoltre a doppio colorazione con tecniche di tracciatura retrograda o anterograda.
2. Lavare le sezioni 5 x 5 min con 0,05 M PB e preparare il tetraidrocloride 3-3'-diaminobenzidina (DAB) contenente soluzione per la colorazione citocromo ossidasi per visualizzare barili nel layer 4 (L4) di S1 (vedi Tabella 2 per le soluzioni e reagenti). Incubare le sezioni 6-12 della pia nella soluzione preriscaldato per 30-45 minuti a 37 ° C.
3. Sciacquare le sezioni con 0,05 M PB per 6 x 5 min e dissetare attività della perossidasi endogena incubando tutte le sezioni nel 3% H ₂ O ₂ in 0,05 M PB per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Sciacquare le sezioni con 0,05 M PB per 5 x 10 min. Incubare sezioni ABC-soluzione (vedi Tabella 3 per le soluzioni e reagenti) notte a 4 ° C.
5. Sciacquare le sezioni con 0,05 M PB per 5 x 10 min e preparare la DAB-soluzione per visualizzare il neurone biocitina-riempita (vedi Tabella 4 per le soluzioni e reagenti). Incubare le sezioni in soluzione filtrata per 45-60 minuti a temperatura ambiente.
6. Sciacquare le sezioni con 0,05 M PB per 5 x 10 min. Sezioni Mount su vetrini da microscopio e copertura antiscivolo con Mowiol (cfr. tabella 5 per le soluzioni e reagenti).
7. Determinare la qualità di etichettatura utilizzando microscopio ottico.

Results

La conoscenza dettagliata sulla struttura 3D dei singoli neuroni è fondamentale per chiarire i principi organizzativi delle reti neuronali. Il nostro metodo prevede un gasdotto per ottenere l'etichettatura biocitina alta qualità da una preparazione in vivo, consentendo in tal modo la classificazione post hoc neuronale e la ricostruzione dettagliata di dendritica e l'architettura assonale di singoli neuroni ad alta risoluzione. A seconda della qualità di etichettatura juxtasomal, i neuroni sono recupera...

Discussion

Il metodo juxtasomal permette la registrazione in azione vivo potenziale chiodare da singole unità le varie patologie comportamentali (anestetizzati, sveglio testa fissa o muoversi liberamente) con l'opzione di-biocitina etichettatura del neurone registrato per la post hoc tipo di cellula di classificazione e / o ricostruzione 3D. Il principale vantaggio è quello di ottenere parametri fisiologici nella configurazione extracellulare (quindi non invasiva), essendo ancora in grado di etichett...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di controllo SM-6	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 amplificatore	Neuralynx
Axoclamp-2B amplificatore	Axon Instruments
Osada modello EXL-M40	Osada, Inc.
Dispositivo piezoelettrico	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		Software di acquisizione LabView
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Tamponi assorbenti Sugi	Kettenbach	30601
Citocromo C da cuore equino	Sigma	C2506
Catalasi da fegato bovino	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain standard ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Uretano	Sigma	U2500
Isoflurano	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaina	Sigma	L5647
Simplex cemento dentale rapido	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocitina	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
base Trizma	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Glicerolo di grado analitico	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072