Un protocollo per l'analisi dell'epatite C replicazione del virus

Summary

Il virus dell'epatite C (HCV) è un importante agente patogeno umano che causa disturbi del fegato, tra cui cirrosi e cancro. Un sistema di coltura cellulare infettiva per l'HCV è essenziale per comprendere il meccanismo molecolare della replicazione dell'HCV e sviluppare nuovi approcci terapeutici. Qui descriviamo un protocollo per studiare le varie fasi del ciclo di replicazione dell'HCV.

Abstract

Virus dell'epatite C (HCV) colpisce il 3% della popolazione mondiale e provoca gravi disturbi epatici, tra cui epatite cronica, cirrosi e carcinoma epatocellulare. HCV è un virus a RNA enveloped appartenente alla famiglia Flaviviridae. Terapia attuale non è pienamente efficace e provoca effetti collaterali negativi. Non esiste un vaccino HCV disponibili. Pertanto, è necessaria continuato sforzo per sviluppare un vaccino e migliore terapia. Un sistema di coltura cellulare HCV è fondamentale per studiare varie fasi di crescita HCV tra cui l'ingresso del virus, la replicazione del genoma, imballaggio e uscita. Nella procedura attuale presentata, abbiamo utilizzato un virus wild-type intragenotype 2a chimerico, FNX-HCV, e un virus ricombinante FNX-Rluc portando un Renilla luciferasi gene reporter per studiare la replicazione del virus. Una linea di cellule di epatoma umano (Huh-7 riferiscono) è stato utilizzato per la trasfezione in vitro di trascritti HCV RNA genomici. Surnatanti di coltura privi di cellule, lisati proteici e tRNA otale sono state raccolte in vari momenti punti post-trasfezione per valutare la crescita HCV. HCV stato replicazione del genoma è stata valutata mediante RT-PCR e visualizzando la presenza di HCV RNA a doppio filamento. L'espressione della proteina di HCV è stata verificata da blot e immunofluorescenza saggi occidentali utilizzando anticorpi specifici per le proteine ​​HCV NS3 e NS5A. Cellule trasfettate HCV RNA rilasciate particelle infettive nella cultura surnatante e il titolo virale è stato misurato. Saggi di luciferasi sono stati utilizzati per valutare il livello di replicazione e infettività di HCV giornalista. In conclusione, vi presentiamo vari saggi virologici per la caratterizzazione delle diverse fasi del ciclo di replicazione di HCV.

Introduction

Virus dell'epatite C (HCV) causa cirrosi e cancro del fegato. Essa colpisce 170 milioni di persone in tutto il mondo con 350.000 persone muoiono ogni anno ^1-3. HCV è un virus a RNA filamento positivo con un genoma di 9,6 kb. Il genoma di HCV è tradotto come singola poliproteina di ~ 3000 residui amminoacidici che viene scissione proteolitica da varie proteasi cellulari e virali in 10 polipeptidi. HCV è il virus prototipo in genere Hepacivirus e appartiene alla famiglia Flaviviridae ^4. Dopo l'esposizione, HCV stabilisce infezione cronica nel 80% degli individui. L'infezione è prevalentemente asintomatica e tempestiva diagnosi....

Protocol

Uno schema generale del protocollo è illustrato in Figura 1.

1. Cellule

1. Preparare mezzi di crescita completo che contiene il 10-15% di siero bovino fetale (FBS), 10 mM aminoacidi non essenziali, Hepes 10 mM, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml), e 2 mM L-glutammina.
2. Mantenere Huh-7.5.1 celle ¹³ in mezzi di crescita completi contenenti i supplementi di cui sopra per l'analisi in vitro di epatite C ciclo di replicazione virale.
3. Cultura ceppi virali in Huh-7.5.1 celle con i mezzi di crescita integrata specificato a 37 ° C con 5% di CO _2. <....

Results

Il virus dell'epatite C è un virus a RNA. Così per scopo di manipolazione genetica, l'HCV cDNA genomico è stato clonato in un plasmide vettore batterico. Una sequenza del promotore T7 RNA polimerasi è stata introdotta immediatamente prima estremità 5 'del genoma di HCV. Uno schema generale di workflow analisi HCV è presentato nella figura 1. Per generare HCV RNA genomico con precisione 3 ', il genoma di HCV contenente plasmide è tagliato con l'enzima di restrizione XbaI e lo sbalzo singolo fila.......

Discussion

Questa illustrazione descrive un metodo per analizzare il ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. HCV è un agente patogeno umano e il protocollo sulla biosicurezza prescritta dovrà essere seguite scrupolosamente. Sistemi di coltura di cellule HCV infettive sono state descritte in precedenza ^11-13,16,17. Ci sono alcuni punti cruciali attuiamo quando seguendo il protocollo illustrato. In primo luogo, è di grande importanza per avere una buona qualità di intatta tutta la lunghezza RNA genomico virale.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Aminoacido non essenziale	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Siero ridotto Medium, senza fenolo rosso	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	Lo Scripps Research Institute		La linea cellulare è stata gentilmente fornita dal Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami nell'ambito dell'MTA eseguito tra lo Scripps Research Institute e il Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc e pFNX-Rluc Pol null).	Cedars-Sinai Medical Center		I plasmidi HCV sono stati sintetizzati dal Dr. Arumugaswami utilizzando oligonucleotidi sovrapposti.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Fagiolo verde nucleasi	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Sistema di produzione di RNA su larga scala	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Cuvetta per elettroporazione (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
anticorpo monoclonale anti-dsRNA di topo J2	Italiano & Consulenza Scientifica Kft.
Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Pacchetto membrana PVDF	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Latte secco scremato	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anticorpo NS3 contro il virus dell'epatite C [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anticorpo NS3 contro il virus dell'epatite C [H23]	Abcam	ab13830
IgG anti-topo di capra coniugate con perossidasi di rafano (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Reagenti per il rilevamento di blotting occidentale Amersham ECL Prime	GE Healthcare Scienze della vita	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
Sistema di PCR in tempo reale ViiA 7	Life Technologies	Kit
Renilla Promega		E2810
DNase senza RNasi	Promega	M6101
Sistema di rilevamento GloMax-Multi (luminometro)	Promega