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Articolo metodologico

Colorazione istochimica di

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⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 maggio 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

In questo articolo

Sommario

La composizione della parete cellulare vegetale varia tra i tipi di tessuto e può includere lignina, cellulosa, emicellulosa e pectina. Sono state sviluppate varie tecniche di colorazione per visualizzare le differenze a livello di tipo cellulare. Questo articolo è una raccolta di tecniche di colorazione della parete cellulare comunemente usate.

Abstract

Arabidopsis thaliana è un organismo modello comunemente usato per comprendere e manipolare vari processi cellulari nelle piante, ed è stato ampiamente utilizzato nello studio della formazione della parete cellulare secondaria. La deposizione della parete cellulare secondaria si verifica dopo che la parete cellulare primaria è stata depositata, un processo eseguito esclusivamente da cellule specializzate come quelle che formano i vasi e i tessuti delle fibre. La maggior parte delle pareti cellulari secondarie è composta da cellulosa (40-50%), emicellulosa (25-30%) e lignina (20-30%). Sono state isolate diverse mutazioni che influenzano la biosintesi della parete cellulare secondaria e i mutanti corrispondenti possono o meno mostrare evidenti cambiamenti nella composizione biochimica o nei fenotipi visivi, poiché queste mutazioni potrebbero essere mascherate da risposte compensatorie. Le procedure di colorazione sono state storicamente utilizzate per mostrare le differenze su base cellulare. Questi metodi sono esclusivamente mezzi di analisi visivi; Tuttavia, il loro ruolo nell'analisi rapida e critica è di grande importanza. Il rosso Congo e il bianco calcofluor sono coloranti usati per rilevare i polisaccaridi, mentre il Mäule e il floroglucinolo sono comunemente usati per determinare le differenze nella lignina e il blu di toluidina O è usato per colorare in modo differenziale i polisaccaridi e la lignina. Le tecniche apparentemente semplici di sezionamento, colorazione e imaging possono essere una sfida per i principianti. A partire dalla preparazione del campione utilizzando il modello di A. thaliana, questo studio descrive in dettaglio i protocolli di una varietà di metodologie di colorazione che possono essere facilmente implementate per l'osservazione dell'organizzazione cellulare e tissutale nelle pareti cellulari secondarie delle piante.

Introduzione

La parete cellulare vegetale in possesso di una pletora di informazioni nelle sue varie componenti: la lignina, cellulosa, emicellulosa (silano, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxilano collegamento misto glucano, o glucomannano), e pectina. Tecniche istologiche forniscono importanti indicazioni visive a studiare le differenze all'interno delle pareti cellulari secondarie a livello organizzativo e cellulari. Varie tecniche istologiche sono stati sviluppati e sono disponibili in letteratura, ma queste tecniche può essere difficile e per principianti richiede tempo perché i protocolli molto dettagliate con semplici istruzioni visive sono quasi mai disponibili. L'obiettivo di questo studio è quello di fornire semplici linee guida per tecniche di colorazione istologiche di ottenere immagini di alta qualità.

Sezionare il tessuto stelo è il primo passo nella visualizzazione delle pareti cellulari e forme cellulari. Anche se le sezioni tagliate a mano sono poco costosi e richiedono meno tempo per preparare, l'uso di un vibratome offre coerenza eproduce immagini di alta qualità. Utilizzando una vibratome permette di produrre una migliore qualità dei dati generando anche sezioni con lo stesso spessore, che aiuta a produrre immagini nitide e riduce significativamente il rischio di produrre differenze inesatti tra campioni che deriverebbe semplicemente da una cattiva preparazione del campione. Utilizzando resine di fissare campioni freschi può essere una sfida per principianti e può essere ancora molto tempo, anche per gli esperti quando l'analisi deve essere fatto in fretta. Inoltre, diventa impossibile misurare qualsiasi attività biologica con il campione quando è stato incorporato in una resina. Una semplice tecnica che impiega uno stampo agarosio e fatta in casa è utile per l'incorporamento tessuti dello stelo, e può anche essere utilizzato in altre applicazioni che richiedono dissezione dei tessuti molli. Rispetto al incorporamento esemplari in resina, questo metodo ha il vantaggio di mantenere i tessuti vivi e riducendo la manipolazione dei campioni. Sezionamento dei tessuti attraverso un vibratome è molto preciso e genera homogensezioni unità organizzative, che, a seconda della porta dello studio, possono poi essere utilizzati con diverse tecniche di colorazione diverse.

I metodi più semplici per visualizzare lignina e altri aromatici impiegano raggi ultravioletti (UV). Eccitazione delle molecole aromatiche basate sulla luce UV è una vecchia tecnica, ma è ancora uno dei metodi più veloci per la visualizzazione di lignina. Tuttavia, la visualizzazione UV in realtà non è l'ideale per il rilevamento della lignina, perché la luce UV ecciterà altri aromatici. La lignina è costituito principalmente da tre blocchi, i monolignols (alcoli hydroxycinnamyl: alcool coniferilico, alcol sinapyl, e alcool p-coumaryl) 1-3. Macchia Phloroglucinol può fornire indizi per la misura di cinnamaldehydes presenti nello xilema, fibre e tessuti tracheali 4. Phloroglucinol è un buon indicatore di cinnamaldehydes generali e può distinguere tra cinnamaldehydes e altri composti aromatici. I monomeri alcol sinapyl possono essere rilevatie differenziato dall'uso di macchia Maule. Blu di toluidina O è un colorante policromatico e quindi ha la capacità di macchiare diversi elementi della parete cellulare in diversi colori 5,6. L'uso primario di blu di toluidina O è rilevare pectina e lignina 5,6. Il vantaggio di usare blu di toluidina O è che molti elementi della parete cellulare possono essere visualizzati in un unico passaggio. Sia calcofluor bianco e congo rosso sono facili da lavorare e può essere utilizzato per visualizzare cellulosa. Macchie bianche calcofluor cellulosa, callosio, e altri β-glucani non sostituiti o debolmente sostituiti 6-9, mentre congo macchie rosse direttamente al β-(1 → 4)-glucani e in particolare alla cellulosa 10,11. L'obiettivo di questo studio è fornire semplici linee guida per l'utilizzo delle tecniche di colorazione di cui sopra per ottenere immagini di alta qualità da A. thaliana steli.

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Protocollo

1. Stelo Embedding

  1. Fare una soluzione di agarosio 7% in acqua (7 g di agarosio-grade in 100 ml di acqua distillata). Sciogliere l'agarosio in autoclave per 20 minuti o nell'apparecchiatura a microonde per 20 minuti a più bassa intensità (ad esempio, intensità 10% di un forno a 1.250 watt).
  2. Preparate uno stampo casalingo per incorporare i gambi con fiale di plastica.
    1. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il fondo conico di 2 ml con tappo a vite provetta (Parte A). Con una siringa con ago, forare un foro nel tappo della provetta leggermente maggiore del diametro dello stelo da incorporare. Quindi, tagliare 0,5 centimetri dal fondo di un 0,6 ml provetta (Parte B).
    2. Aggiungere la porzione di 0,5 centimetri cut-off della provetta 0,6 ml nella provetta ml pretagliati 2 microcentrifuga. Sigillare le due parti usando Parafilm (Figura 1). NOTA: La parte inferiore del tubo è tagliato per facilitare la rimozione del campione incorporata dopo l'agarosio si è solidificato. Tegli foro nel tappo sarà di aiuto nel tenere il gambo fisso quando lo stelo è incorporato in agarosio. Lo stampo servirà a tenere l'agarosio e tenere premuto il dritto gambo quando incorporamento. Parafilm terrà le due parti A e B, finché l'agarosio è impostato e lo stelo è incorporato.
    3. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare una sezione stelo dalla zona di interesse, (ad esempio metà del primo internodo stelo). NOTA: Idealmente, lo stelo deve essere tagliato poco prima di incorporamento per evitare la distruzione da disidratazione. In alternativa, lo stelo può essere memorizzato temporaneamente in una piastra contenente una carta da filtro inumidita con acqua. Questa piastra può essere posizionato in ghiaccio fino a essere incorporato per prevenire la disidratazione dei tessuti e deformazione. Memorizzazione lo stelo per periodi più lunghi di 30 minuti senza elevata umidità farà sì che lo stelo si asciughi.
  3. Sciogliere l'agarosio nel microonde a bassa intensità. ATTENZIONE: il flacone contenente agarosio potrebbe essere calda. Utilizzare un guanto per prendere la bottiglia. Lasciate che i fusi s agarosiotand a temperatura ambiente (tra 20 ° C e 25 ° C) finché non si raffredda a circa 50 ° C.
  4. Lentamente pipettare 5 ml di agarosio nello stampo plastica premade per riempire la fiala. NOTA: Accertarsi che non ci siano bolle d'aria negli stampi. Le bolle d'aria possono causare lacune nello stampo agarosio e non coprire completamente il campione stelo, che porterà al taglio irregolare delle sezioni campione.
    1. Lasciare che il agarosio raffreddare per 30-60 secondi per diventare semisolido. Provare con un piccolo stuzzicadenti, facendo in modo che possa penetrare e stare in piedi, ma non galleggiano nel agarosio. NOTA: Se lo stelo è posto quando l'agarosio è ancora caldo danneggerà il campione shriveling stelo, distruggendo la morfologia cellulare.
    2. Posizionare il gambo in questa fiala agarosio-riempita. Accertarsi che lo stelo rimane diritta. Posizionare il tappo forato in modo tale che la punta dello stelo è tenuta dal tappo. Non ruotare il tappo a vite. A volte più di uno stelo (di un unico tipo) può essere embedded in un singolo flaconcino; ma in quel caso particolare, non utilizzare il tappo. NOTA: Se il tappo a vite è attivata, lo stelo otterrà contorto.
  5. Lasciare il flaconcino a temperatura ambiente oa 4 ° C per 10-30 minuti, fino a che solidifica.
  6. Rimuovere lo stampo scorrendo fuori del tubo. Aprire il Parafilm. Spingere la parte inferiore della parte B dello stampo delicatamente con il pollice per liberare l'agarosio solidificato dalla parte A su un vetrino da microscopio in vetro.
  7. Tagliare il gambo incorporato agarosio in tre parti approssimativamente uguali di 1,2 cm di lunghezza. Ritagliare la parte dello stelo che non era in agarosio e scartarla.
    1. Conservare questi pezzi di agarosio con incorporato steli in ermetico 2 provette da microcentrifuga ml in una scatola buio a 4 ° C fino al momento di sezione. In alternativa, conservare le provette a 4 ° C per un massimo di una settimana. NOTA: Lo storage è possibile, ma lo sperimentatore deve essere consapevole che il incorporato steli sono ancora vivi e, a seconda dell'esperimento, Artefatti potrebbero potenzialmente essere introdotti.

2. Stelo Sezioni

  1. ATTENZIONE: Leggere attentamente il manuale vibratome e seguire tutte le istruzioni di sicurezza.
  2. Assicurarsi che il disco di preparato sia pulita e completamente asciutta (priva di qualsiasi solido o liquido). Pulire il disco campione con una lama di rasoio per rimuovere eventuali residui di colla da esperimenti precedenti e lavare con acqua. Poi asciugare con un tovagliolo di carta. NOTA: Questo farà sì che l'adesivo funziona bene e si lega al modello di agarosio. Se questo passaggio non viene effettuato correttamente, è possibile che il campione non possono aderire al disco e saranno successivamente causare il campione per cadere il disco durante il sezionamento.
    1. Utilizzare carta morbida salviette per rimuovere l'umidità dal blocco di agarosio contenente i campioni.
    2. Mettere una piccola goccia di adesivo tessuto sul disco di preparato. Consecutive l'adesivo per coprire la zona al centro della lastra, con la punta del flacone adesivo. Rapidamente postoil blocco di agarosio in modo che i campioni sono o perpendicolari o in parallelo con la piastra per trasversali o longitudinali sezioni, rispettivamente. Lasciare l'adesivo per fissare il campione al disco di preparato a temperatura ambiente oa 4 ° C per 10-30 min. NOTA: Questo è un passo time-sensitive.
  3. Fissare il disco di preparato in posizione sul vassoio tampone o depressione. I blocchi / s di agarosio con le sezioni devono essere in parallelo con la lama di rasoio. Riempire la vaschetta tampone con acqua distillata a temperatura ambiente fino a quando i campioni sono completamente sommerse.
  4. Tagliare una lama di rasoio a metà e poi tagliare le estremità con un paio di forbici robuste in modo che la lama rimane completamente piatta. Fissare la metà della lametta pretaglio sul portalama.
    1. Impostare l'angolo sul portalama a 84 °, la velocità a 0,90 mm / sec (posizione 8 sul vibratome) e la frequenza di 50 Hz (posizione 5 sul vibratome). Tagliare sezioni di spessore 100 micron. Utilizzare la modalità continua. NOTE: Questo spessore è stato scelto per assicurare che il tessuto può sopportare i vari trattamenti di acido e base utilizzati in alcuni dei protocolli di colorazione. Impostare la finestra per il sezionamento e consentire 15-20 min in modo continuo per vibratome sezione un blocco di agarosio di circa 1,2 cm.
  5. Raccogliere le sezioni utilizzando una pipetta di plastica usa e getta durante il sezionamento nel cassetto buffer. In alternativa, le sezioni possono essere trasferiti dalla vasca del buffer in un bicchiere di vetro e poi ad una piastra Petri chiaro. Trasferire alcune sezioni di tubi microcentrifuga 2,0 ml. Nota: I campioni sono raccolti da una piastra di Petri, perché è più facile vedere le sezioni su un fondo chiaro, e perché la vasca del buffer può essere innescato per i prossimi campione.
  6. Le sezioni possono essere memorizzati in un tubo da 50 ml o raccolti e conservati in provette da 1,5 a 2 ml microcentrifuga a 4 ° C per 30 a 60 min. NOTA: Memorizzazione delle sezioni per periodi più lunghi si tradurrà in una scarsa qualità dell'immagine.

3. Microscopio e Camera Setting for Imaging

  1. Regolare l'illuminazione Koehler sul microscopio. Scegli un obiettivo. Concentrarsi sul campione in primo luogo. Portare l'intensità della luce alla metà o inferiore. Chiudere il diaframma di campo (FD) e l'apertura (AP) o portare al valore più basso possibile in quel particolare obiettivo.
    1. Maggiore è l'ingrandimento, maggiore sarà l'anello. Usare la manopola di messa a fuoco del condensatore a fuoco l'iride dei campi come acutamente possibile.
    2. Lentamente portare l'immagine del diaframma di campo (piccolo anello a forma di esagono) al centro utilizzando le manopole del condensatore-centraggio (viti a forma di pin che circondano il condensatore). Aumentare lentamente la membrana (FD) tale che il diaframma di campo raggiunge il bordo. Arrestare l'aumento della FD subito dopo il diaframma di campo ha superato il bordo.
    3. Lentamente aumentare l'apertura (AP) per regolare il contrasto. Regolare l'intensità della luce, come richiesto. NOTA: illuminazione Koehler deve essere adattata per ogni oggettivo, ogni giorno sperimentale. Prendere nota dei numeri ottenuti dopo aggiustamento per la giornata. Questi numeri saranno riutilizzati ogni volta che obiettivi vengono commutati avanti e indietro per quel particolare giorno.
  2. Regolare l'apertura, l'intensità, tempo di esposizione, guadagno e filtri come descritto nella Tabella 1. Queste informazioni devono essere utilizzate solo come guida.
  3. Utilizzare una fotocamera digitale ad alta risoluzione con una grande chip CCD formato interline senza otturatore meccanico per catturare le immagini di fluorescenza; e ad alta risoluzione, telecamera ad alta velocità per immagini in campo chiaro.
  4. Elaborare le diapositive utilizzando software standard. Caricare il software. Fare clic su "Acquisisci" e "Impostare la fotocamera / scheda", quindi selezionare la telecamera da utilizzare. Fare clic su "OK". Clicca su "Acquisisci" seguito da "scheda Colore." Alla voce "scheda Colore," scegliere "metodo Bayer", seguito da "Average quattro". Aggiungi il guadagno suggerito (rosso, verde, blu) from Tabella 1. Selezionare la scheda "Set salva" e fare clic sulla directory in cui le immagini devono essere memorizzati. Impostare "Tempo di esposizione" dalle suggestioni nella Tabella 1. Impostare "categorizzazione" a "1" e "Live binning" a "1". Focus sulla regione di interesse e quindi fare clic su "Salva dal vivo."
  5. Immagini di uscita sul software della fotocamera sono in formato "TIF". Analizzare le immagini per istochimica dei tipi cellulari. Utilizzare software standard per usi a valle della presentazione e pubblicazione.

4. Ultraviolet and Bright campo Imaging

  1. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo che le sezioni possono essere pipettati facilmente. Delicatamente sezioni pipetta nella punta e su di un vetrino da microscopio. Coprire le sezioni con un vetrino. Osservare le sezioni sotto la luce UV o di illuminazione in campo chiaro.

5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) colorazione 12

  1. Sciogliere 0.3 g di floroglucinolo in 10 ml di etanolo assoluto per preparare una soluzione floroglucinolo 3%. Mescolare un volume di HCl concentrato (37 N) a due volumi di 3% floroglucinolo in etanolo; questa soluzione è floroglucinolo-HCl (Ph-HCl) o macchia Wiesner. NOTA: Questa soluzione deve essere effettuato fresco il giorno della colorazione e non può essere immagazzinata, perché la soluzione si degrada nel tempo e la colorazione diventa inefficace. ATTENZIONE: HCl è altamente corrosivo, in modo da utilizzare estrema cautela durante la manipolazione la macchia Ph-HCl.
  2. Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml della soluzione Ph-HCl al tubo contenente sezioni e dirla immediatamente perché l'HCl nella macchia Ph-HCl è altamente corrosivo. Spostare delicatamente il tubo per assicurare che tutte le sezioni sono macchiati. Un'alternativa a questa fase è quello di mantenere il tappo tubo aperto in modo che la soluzione Ph-HCl può pipettare su e giù, preferibilmente senza disturbare il seczioni. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta, in quanto ciò potrebbe danneggiare quelle sezioni.
    1. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio. Coprire le sezioni con polizza di copertura. Osservare le sezioni sotto illuminazione in campo chiaro. NOTA: La soluzione Ph-HCl asciuga in 5-10 minuti, provocando un deterioramento dei campioni. Pertanto, la rappresentazione deve essere completata entro tale periodo di tempo.

6. Maule colorazione 13,14

  1. Sciogliere 0.2 g di permanganato di potassio in 40 ml di acqua distillata per preparare una soluzione di permanganato di potassio 0,5%. Conservare in una bottiglia al buio a temperatura ambiente per un massimo di 7 giorni.
    1. Preparare una soluzione di HCl 3,7% con l'aggiunta di 1 ml di HCl concentrato (37 N) a 9 ml di acqua distillata (1:10). Preparare una soluzione fresca del 3,7% HCl sulgiorno dell'esperimento. Assicurarsi che la soluzione di riserva 37 N HCl utilizzato non è troppo vecchio. Soluzione di idrossido di ammonio concentrato (14,8 M) deve essere conservato a 4 ° C per evitare la molarità della soluzione satura diminuisca.
  2. Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml della soluzione di permanganato di potassio 0,5% per il tubo contenente sezioni.
    1. Pipettare la soluzione di permanganato di potassio allo 0,5% su e giù delicatamente, preferibilmente senza disturbare le sezioni. Incubare per 2 minuti e ripetere il pipettaggio. Lasciate che la provetta riposare fino a quando tutte le sezioni stabilirsi. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come le sezioni possono essere danneggiati. Può essere difficile vedere le sezioni staminali come la soluzione è scuro, in modo da mantenere il tubo con le sezioni su provetta rack e permettere loro di accontentarsi di 2 min.
    2. Usando una pipetta 1 ml, tirare fuori 700 ml di 0,5% soluzione di permanganato di potassio.Aggiungere 700 ml di acqua distillata per sciacquare la soluzione di permanganato di potassio. Ripetere 3-4x o fino a quando la soluzione di acqua rimane limpida.
    3. Eliminata l'acqua. Aggiungere rapidamente 1 ml di 3% HCl finché il colore marrone scuro viene scaricata dalle sezioni. Ciò può avvenire in 3-5 minuti o può richiedere 2 lavaggi di 5 minuti ciascuno. Pipettare su tutta la soluzione HCl 3% e procedere immediatamente alla fase successiva.
    4. Aggiungere 1 ml di soluzione di idrossido di ammonio concentrato. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio. Coprire le sezioni con un coprioggetto. Osservare le sezioni sotto illuminazione in campo chiaro. ATTENZIONE: Poiché idrossido di ammonio è estremamente corrosivo, richiede cura e attenzione per evitare di causare la corrosione alla fase del microscopio o lente. NOTA: I fumi di idrossido di ammonio possono nebbia del vetrino, che rende difficile osservare il campione. Quindi essere molto attenti prima di aggiungere il vetrino. La soluzione si asciuga in 5-10 minuti, quindi la rappresentazione deve essere completata entro tale periodo di tempo.

7. Congo Red colorazione 11,15

  1. Sciogliere 0,5 g di rosso Congo in 100 ml di acqua distillata per preparare una soluzione rosso congo 0,5%.
  2. Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml della soluzione rosso congo 0,5% al ​​tubo. Pipettare delicatamente la soluzione rosso congo 0,5% su e giù senza disturbare le sezioni. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come puo 'danneggiare le sezioni.
    1. Incubare a temperatura ambiente per 10 min e ripetere il pipettaggio. Seguire con un altro 3 min di incubazione a temperatura ambiente.
    2. Utilizzare una pipetta 1 ml di tirar fuori 700 ml di 0,5% soluzione di rosso congo. Aggiungere 700 ml di acqua distillata per sciacquare la soluzione rosso congo. Ripetere il lavaggio 3-4x finché la soluzione di lavaggioè chiaro.
    3. Utilizzare una pipetta 1 ml con il suo taglio punta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio, e coprire con coprioggetto. Osservare i campioni sul vetrino sotto blu-luce di eccitazione usando un filtro con una banda passante di 560/40. NOTA: Non conservare le sezioni in acqua per molto tempo prima dell'analisi microscopica, come l'acqua lavare la congo rosso in 10-30 min.

8. Calcofluor Bianco colorazione 9

  1. Sciogliere 0,02 g di sbiancante fluorescente 28 (calcofluor bianco M2R) in 10 ml di acqua distillata per preparare una soluzione madre dello 0,2%. La soluzione allo 0,2% può essere conservata per sei mesi in una bottiglia al buio a 4 ° C. Preparare una soluzione di lavoro di 0,02% diluendo la soluzione stock di 0,2% 10x con acqua distillata.
  2. Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere alla provetta 1 ml di calcof 0,02%Luor soluzione bianco. Pipettare delicatamente la soluzione bianco 0,02% calcofluor su e giù. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come puo 'danneggiare le sezioni.
    1. Incubare a temperatura ambiente per 5 min e ripetere il pipettaggio. Incubare la sezione per altri 3 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Le sezioni di depositarsi sul fondo della provetta per facilitare l'pipettare la soluzione senza danneggiare le sezioni.
    2. Utilizzare una pipetta 1 ml di tirar fuori 700 ml di soluzione di bianco 0,02% calcofluor e aggiungere 700 ml di acqua distillata; attendere 5 minuti per sciacquare la soluzione bianco calcofluor. Ripetere il lavaggio 3-4x. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo che, come le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni.
    3. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino. Osservare le sezioni sotto la luce UV.

9. Toluidina Blue O colorazione 16,17

  1. Sciogliere 0,02 g di blu di toluidina O in 100 ml di acqua distillata per preparare una soluzione 0,02%. NOTA: La soluzione blu toluidina O può essere conservato per due settimane in una bottiglia scura a temperatura ambiente.
  2. Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di soluzione di blu di toluidina O 0,02% al tubo. Pipettare delicatamente la soluzione di blu O 0,02% toluidina su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 5 min e ripetere il pipettaggio volta. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come puo 'danneggiare le sezioni. Lasciate che la provetta si ferma fino a quando le sezioni stabilirsi. Questo può essere difficile da vedere, come la soluzione è scuro, in modo da mantenere il tubo contenente sezioni di provetta rack e permettere loro di accontentarsi di 2 minuti a temperatura ambiente.
    1. Utilizzare una pipetta 1 ml di tirar fuori 700 ml di soluzione di blu O 0,02% toluidina. Aggiungere 700 ml di acqua distillata per sciacquare il blu di toluidina O solution. Ripetere 3-4x o fino a quando la soluzione di lavaggio è chiaro. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danneggiarli.
    2. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino. Osservare le sezioni sotto illuminazione in campo chiaro.

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Risultati

Stem Embedding e Sezioni:
L'uso dello stampo plastica casalingo per incorporare gli steli in 7% agarosio rivelata facile e veloce (Figura 1). Le due parti (A e B; la figura 1) del sistema flaconcino incorporato rendono semplice per rilasciare facilmente stelo incorporato in agarosio come l'agarosio non si attacca alle parti fiala che sono inerti, mantenendo il sistema pulito. Le fiale possono essere riutilizzati più volte per anni. La comodità di memorizzare stelo incorpo...

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Discussione

Sezioni di gambo A. thaliana sono ampiamente utilizzati per studiare l'organizzazione delle cellule nella parete cellulare secondaria e di esaminare qualitativamente le differenze tra wild type e piante transgeniche. Le tecniche comunemente utilizzate per sezionare i campioni sono di taglio diretto a mano; o quando i campioni sono incorporati in agarosio o fissativo, sezionamento può essere fatto con un vibratomo o microtomo. In contrasto con il taglio manuale, gli ultimi due permettono riducendo il rischio...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati a Sabin Russell per l'assistenza editing. Questo lavoro è stato parte del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), sostenuto dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Office of Science, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, attraverso il contratto di DE-AC02-05CH11231 tra il Lawrence Berkeley National Laboratory e il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioEMDMERC2125Numero CAS: 9012-36-6
FloroglucinoloSigmaP 35021,3,5-triidrossibenzene [Numero CAS: 108-73-6]
Acido cloridricoEMDHX0603-75Numero CAS: 7647-01-0
Idrossido di ammonioEMDAX1303-6Numero CAS: 1336-21-6
Blu di toulidina OSigmaT3260Cloruro di blutene, cloruro di tolonio [numero CAS 92-31-9] 
Permanganato di potassioSigma223468numero CAS 7722-64-7 
Etanolo 190 proofKOPTECV1401Numero CAS: 64-17-5
Congo RedSigma C6277Disodio 3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-amminonaftalene 1-solfonato) [Numero CAS 573-58-0]
Sbiancante fluorescente 28/ Calcofluor White StainSigmaF3543 acido 4,4'-bis[[4-[bis(2-idrossietil)ammino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]ammino]stilbene-2,2'-disolffonico [numero CAS 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica Microtomo a lama vibrante VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Safety razor companyArticolo # 60-0139-0000 Lama a doppio taglio in acciaio inox (Personna Super)
Provette per microcentrifuga con tappo a vite (2 ml)VWR16466-044
Provette per microcentrifuga (0,6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
GuantoBel-Art3800000000SCIENCEWARE  Hot Hand Protector
Mitt Adesivo per tessutiTed Pella Inc10033Negozio a 4 ° C o 20 gradi C per 3 mesi o più di conservazione
MicroondePanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Adesivo istantaneo per tessuti 
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Micro vetrini smerigliati, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MAlcan confezioneBRNDPM998
Cubo filtro TX2 Leica11513851/11513885Filtro utilizzato per l'analisi del rosso Congo con una banda passante di 560/40.

Riferimenti

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