La composizione della parete cellulare vegetale varia tra i tipi di tessuto e può includere lignina, cellulosa, emicellulosa e pectina. Sono state sviluppate varie tecniche di colorazione per visualizzare le differenze a livello di tipo cellulare. Questo articolo è una raccolta di tecniche di colorazione della parete cellulare comunemente usate.
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Articolo metodologico
Colorazione istochimica di
In questo articolo
Sommario
Abstract
Arabidopsis thaliana è un organismo modello comunemente usato per comprendere e manipolare vari processi cellulari nelle piante, ed è stato ampiamente utilizzato nello studio della formazione della parete cellulare secondaria. La deposizione della parete cellulare secondaria si verifica dopo che la parete cellulare primaria è stata depositata, un processo eseguito esclusivamente da cellule specializzate come quelle che formano i vasi e i tessuti delle fibre. La maggior parte delle pareti cellulari secondarie è composta da cellulosa (40-50%), emicellulosa (25-30%) e lignina (20-30%). Sono state isolate diverse mutazioni che influenzano la biosintesi della parete cellulare secondaria e i mutanti corrispondenti possono o meno mostrare evidenti cambiamenti nella composizione biochimica o nei fenotipi visivi, poiché queste mutazioni potrebbero essere mascherate da risposte compensatorie. Le procedure di colorazione sono state storicamente utilizzate per mostrare le differenze su base cellulare. Questi metodi sono esclusivamente mezzi di analisi visivi; Tuttavia, il loro ruolo nell'analisi rapida e critica è di grande importanza. Il rosso Congo e il bianco calcofluor sono coloranti usati per rilevare i polisaccaridi, mentre il Mäule e il floroglucinolo sono comunemente usati per determinare le differenze nella lignina e il blu di toluidina O è usato per colorare in modo differenziale i polisaccaridi e la lignina. Le tecniche apparentemente semplici di sezionamento, colorazione e imaging possono essere una sfida per i principianti. A partire dalla preparazione del campione utilizzando il modello di A. thaliana, questo studio descrive in dettaglio i protocolli di una varietà di metodologie di colorazione che possono essere facilmente implementate per l'osservazione dell'organizzazione cellulare e tissutale nelle pareti cellulari secondarie delle piante.
Introduzione
La parete cellulare vegetale in possesso di una pletora di informazioni nelle sue varie componenti: la lignina, cellulosa, emicellulosa (silano, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxilano collegamento misto glucano, o glucomannano), e pectina. Tecniche istologiche forniscono importanti indicazioni visive a studiare le differenze all'interno delle pareti cellulari secondarie a livello organizzativo e cellulari. Varie tecniche istologiche sono stati sviluppati e sono disponibili in letteratura, ma queste tecniche può essere difficile e per principianti richiede tempo perché i protocolli molto dettagliate con semplici istruzioni visive sono quasi mai disponibili. L&#....
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Protocollo
1. Stelo Embedding
- Fare una soluzione di agarosio 7% in acqua (7 g di agarosio-grade in 100 ml di acqua distillata). Sciogliere l'agarosio in autoclave per 20 minuti o nell'apparecchiatura a microonde per 20 minuti a più bassa intensità (ad esempio, intensità 10% di un forno a 1.250 watt).
- Preparate uno stampo casalingo per incorporare i gambi con fiale di plastica.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il fondo conico di 2 ml con tappo a vite provetta (Parte A). Con una siringa con ago, forare un foro nel tappo della provetta leggermente maggiore del diametro dello stelo da incorporare. Quindi, tagliare 0,5 centimetr....
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Risultati
Stem Embedding e Sezioni:
L'uso dello stampo plastica casalingo per incorporare gli steli in 7% agarosio rivelata facile e veloce (Figura 1). Le due parti (A e B; la figura 1) del sistema flaconcino incorporato rendono semplice per rilasciare facilmente stelo incorporato in agarosio come l'agarosio non si attacca alle parti fiala che sono inerti, mantenendo il sistema pulito. Le fiale possono essere riutilizzati più volte per anni. La comodità di memorizzare stelo incorpo.......
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Discussione
Sezioni di gambo A. thaliana sono ampiamente utilizzati per studiare l'organizzazione delle cellule nella parete cellulare secondaria e di esaminare qualitativamente le differenze tra wild type e piante transgeniche. Le tecniche comunemente utilizzate per sezionare i campioni sono di taglio diretto a mano; o quando i campioni sono incorporati in agarosio o fissativo, sezionamento può essere fatto con un vibratomo o microtomo. In contrasto con il taglio manuale, gli ultimi due permettono riducendo il rischio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Sabin Russell per l'assistenza editing. Questo lavoro è stato parte del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), sostenuto dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Office of Science, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, attraverso il contratto di DE-AC02-05CH11231 tra il Lawrence Berkeley National Laboratory e il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | EMD | MERC2125 | Numero CAS: 9012-36-6 |
| Floroglucinolo | Sigma | P 3502 | 1,3,5-triidrossibenzene [Numero CAS: 108-73-6] |
| Acido cloridrico | EMD | HX0603-75 | Numero CAS: 7647-01-0 |
| Idrossido di ammonio | EMD | AX1303-6 | Numero CAS: 1336-21-6 |
| Blu di toulidina O | Sigma | T3260 | Cloruro di blutene, cloruro di tolonio [numero CAS 92-31-9] |
| Permanganato di potassio | Sigma | 223468 | numero CAS 7722-64-7 |
| Etanolo 190 proof | KOPTEC | V1401 | Numero CAS: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodio 3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-amminonaftalene 1-solfonato) [Numero CAS 573-58-0] |
| Sbiancante fluorescente 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | acido 4,4'-bis[[4-[bis(2-idrossietil)ammino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]ammino]stilbene-2,2'-disolffonico [numero CAS 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Microtomo a lama vibrante VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Articolo # 60-0139-0000 | Lama a doppio taglio in acciaio inox (Personna Super) |
| Provette per microcentrifuga con tappo a vite (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Provette per microcentrifuga (0,6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Guanto | Bel-Art | 3800000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector |
| Mitt Adesivo per tessuti | Ted Pella Inc | 10033 | Negozio a 4 ° C o 20 gradi C per 3 mesi o più di conservazione |
| Microonde | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Adesivo istantaneo per tessuti |
| Fotocamera con chip CCD senza otturatore meccanico | Hamamatsu | C4742-95 | |
| Telecamera a colori ad alta velocità | Software per fotocamera QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Molecular Devices | MetaMorph versione 7.7.0.0 | ||
| Immaginare l'analisi | Adobe | Occhiali Photoshop CS4 | |
| Micro Cover, quadrati, n. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Gli occhiali Cover sono resistenti alla corrosione e uniformemente spessi e piatti. Lo spessore n. 1 è compreso tra 0,13 e 0,17 mm. |
| Micro vetrini smerigliati, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan confezione | BRNDPM998 | |
| Cubo filtro TX2 Leica | 11513851/11513885 | Filtro utilizzato per l'analisi del rosso Congo con una banda passante di 560/40. |
Riferimenti
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
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Ristampe e permessi
