Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

Sommario

Per ottenere immagini ad alta risoluzione di cellule marcate in fluorescenza all'interno di tessuti di grandi dimensioni, idealmente, i campioni biologici dovrebbero essere ripresi senza sezionamento. 3DISCO è una semplice procedura di pulizia dei tessuti basata sull'incubazione sequenziale con solventi organici. Dopo l'eliminazione, gli organi diventano trasparenti consentendo una scansione laser end-to-end del campione.

Abstract

La pulizia dei tessuti e la successiva imaging di organi trasparenti è un metodo potente per analizzare cellule e molecole marcate in fluorescenza in 3D, in organi intatti. A differenza dei metodi istologici tradizionali, in cui il tessuto di interesse viene sezionato per l'imaging fluorescente, l'imaging 3D del tessuto pulito consente l'esame delle cellule e delle molecole marcate nell'intero campione. A tal fine, i tessuti otticamente opachi devono essere resi trasparenti facendo corrispondere gli indici refrattari in tutto il tessuto. Successivamente, il tessuto può essere immediatamente visualizzato utilizzando microscopi a scansione laser per ottenere un'immagine 3D completa ad alta risoluzione del campione. Un elenco crescente di protocolli di pulizia dei tessuti, tra cui 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 e SeeDB, offre ai ricercatori nuovi modi per visualizzare il loro tessuto di interesse nel suo insieme. Tra questi, 3DISCO è un metodo altamente riproducibile e semplice, in grado di pulire diversi tipi di tessuti e può essere utilizzato con varie tecniche di microscopia. Questo protocollo descrive questa semplice procedura e ne presenta le varie applicazioni. Discute anche i limiti e le possibili difficoltà e come superarli.

Introduzione

L'esame istologico di tessuti biologici è un approccio fondamentale per comprendere la natura di molecole / cellule nel loro contesto naturale. Idealmente, imaging ad alta risoluzione dell'intero organo è più informativo e desideri. Poiché la luce ha una profondità di penetrazione limitata, a causa della dispersione ^1, organi fissi devono essere sezionato al fine di eseguire immagini ad alta risoluzione microscopica. Quindi, la maggior parte degli studi istologici sono realizzate su alcune sezioni di tessuto che costituiscono solo una piccola porzione dell'organo. In alcuni studi, ad esempio, tutti coloro che amano tracciare connessioni neuronali del cervello o del midollo spinale, tutte le sezioni di tessuto da organi bersaglio sono raccolti e ripreso per una ricostruzione in 3D. Tuttavia, sezionamento dei tessuti e la successiva rappresentazione delle singole sezioni ha varie limitazioni. Queste includono la lunga e portando ad una ricostruzione 3D incompleta del tessuto, dovuto a distorsioni meccaniche e difficileies nell'allineamento delle immagini risultanti.

Recentemente, di compensazione e di imaging intatti gli organi trasparenti è stato sviluppato come una soluzione significativa per questa lacuna ^2,3. Su di compensazione, l'intero organo è reso trasparente che consente alla luce di imaging di viaggiare end-to-end (Figura 1) per produrre immagini ad alta risoluzione dell'organo non sezionato utilizzando un microscopio a scansione laser, come un fotone o la luce fogli microscopio multi ( Figura 2). Vari gruppi di ricerca hanno sviluppato nuovi protocolli di compensazione tessuto poter immagine loro tessuto di interesse per scopi diversi. Questi includono solvente organico ^{2-5, 6,7} di acqua ed elettroforesi a base ^{di 8} protocolli di compensazione. Tra questi, l'imaging 3-dimensionale di solvente riesce organi o 3DISCO è un protocollo facilmente applicabile su una varietà di campioni biologici compreso il sistema nervoso centrale (SNC) organi, organi immunitarie e tumori solidi. In Additione, può essere combinato con le diverse tecniche di microscopia come foglio leggero microscopia a fluorescenza (LSFM), più fotoni e microscopio confocale a scansione laser. 3DISCO si basa sulla compensazione con reagenti facilmente disponibili e poco costosi come tetraidrofurano (THF) e dibenzil etere (DBE) ^4. L'intero protocollo può prendere più breve di 3-4 ore. Così, 3DISCO è una tecnica robusta e veloce rispetto ai metodi istologici tradizionali che possono richiedere settimane o mesi per completare ^9.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con IACUC (Institutional Animal Care ed uso commissione) norme sui topi ~ 3-5 mesi di età. L'autore dichiara interessi finanziari concorrenti.

1. Perfusione animali e Tissue Preparazione

Timing: 30-60 min per il mouse + post-fissazione (poche ore a notte).

1. Pesare l'animale e anestetizzare utilizzando ketamina (80-200 mg / kg) e xilazina (7-20 mg / kg) o 2,5% avertin (0,5 ml/25 g di peso corporeo IP).
2. Attendere qualche minuto per l'anestesia abbia effetto completo.
3. Pizzicare la punta e la coda dell'animale per assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato.
4. Perfusione l'animale prima a temperatura ambiente con 0,1 M tampone fosfato (PB) o 0,1 M tampone fosfato salino (PBS) per 5-10 minuti finché il sangue non viene completamente rimosso dal tessuto.
5. Passare la perfusione di soluzione fissativa: 4% PFA in 0.1 M PB (o 0,1 M PBS) e proseguire perfusionecon 4% PFA per 30-40 min ad una velocità di 3 ml / min.
6. Sezionare l'organo / s di interesse con cura senza danneggiare, ad esempio, evitare la puntura e stringendo il tessuto che viene sezionato.
7. Rimuovere il tessuto in più che circonda gli organi (tessuto connettivo, meningi o di materia dura) in una capsula di Petri riempita con PBS.
8. Post-fissare gli organi in PFA 4% per alcune ore o durante la notte a 4 ° C. Evitare il lungo post-fissazione, perché PFA potrebbe placare il segnale o aumentare il lavoro straordinario autofluorecense ¹⁰ soprattutto per il canale GFP (che è un problema minore nei canali rosso e rosso lontano).
9. Lavare gli organi 2-3x con PBS a temperatura ambiente prima di iniziare la procedura di compensazione.

2. Clearing Tissue

Timing: 2-3 ore per i piccoli organi e 1-4 giorni per i grandi organi.

Note: L'etichettatura fluorescenza dei tessuti da parte espressione del transgene, trasfezione virale, tintura di analisi o di anti-etichettatura corpo dovrebbe essere completata prima della cancellazione. Tutte le fasi di compensazione tessuti vengono eseguite a temperatura ambiente. Le soluzioni di compensazione THF, DBE, Babb (alcool benzilico 1 parte 2 parte benzile benzoato) e diclorometano sono tossiche e per inalazione (condurre esperimenti in cappa adeguatamente ventilati) e il contatto diretto con la pelle deve essere evitato (utilizzare guanti di nitrile).

1. Preparare 50% (vol / vol), 70% e 80% diluizioni THF in acqua distillata in bottiglie di vetro separati come segue: per il 50% THF, ad esempio, miscelare 25 ml di THF e 25 ml di acqua distillata in una bottiglia di vetro con un volume di superare i 50 ml.
2. Mescolare le soluzioni agitando delicatamente la bottiglia per un 1-2 min.
3. Etichettare la bottiglia di vetro chiaro.
4. Chiudere bene le bottiglie e mantenere le soluzioni di lavoro in un armadietto buio. Per ottenere i migliori risultati, non utilizzare le stesse soluzioni di lavoro più lunghi di 1-2 settimane. Pertanto, ordina le soluzioni di compensazione come il più piccolo volume disponibile per essere in grado di utilizzare fresche stock reagenti.
5. Riempire i flaconi di vetro (ad esempio, 2-3 ml) con la prima soluzione di compensazione, il 50% THF, e trasferire gli organi da PBS in flaconi di vetro per avviare radura.
6. Chiudere bene i flaconi di vetro con i loro coperchi e utilizzare un rotatore (ad esempio, un agitatore ruota) per l'agitazione.
7. Utilizzare un foglio di alluminio per coprire e tenere le fiale di vetro nel buio. Avviare il rotatore per mescolare i campioni nei flaconi di vetro per il tempo indicato (Tabella 1) ad una velocità costante (~ 30 rpm).
8. Rimuovere la soluzione di compensazione e aggiungere il successivo nel protocollo quando il tempo in Tabella 1 è completato.
9. Raccogliere i rifiuti radura in contenitori per rifiuti in vetro che vengono tenuti in una cappa.
   Ripetere il passaggio precedente per ogni soluzione di compensazione nel protocollo fino alla fine. Usare una pipetta pasteur quando si aggiunge una nuova soluzione di compensazione (ad esempio passando da THF a DBE).
10. Al passaggio di compensazione finale con BABB o DBE, i tempi di incubazione possono essere estese o shortened finché i campioni diventano completamente trasparente alla luce visibile (o giallastro / trasparente se è molto grande come tessuto cerebrale).
11. Mantenere gli organi eliminato nella soluzione purificazione finale in ogni momento comprendente le fasi di imaging.

3. Preparazione Organi sgomberati per Imaging

Timing: 5-15 min.

Nota: L'immagine degli organi liquidati non appena una radura completo è raggiunto. A tal fine, seguire i prossimi passaggi per preparare i campioni per la microscopia ottica fogli (ad esempio, ultramicroscopy) o confocale / multi-fotone immagini di microscopia.

Nota: gli organi sgomberati perderanno la loro forza fluorescenza nel tempo (soprattutto proteine ​​fluorescenti ad esempio, GFP, etichettatura anticorpo è più resistente e può anche dare risultati migliori con incubazione più lunghi). Per l'imaging, varie tecniche di microscopia a fluorescenza possono essere utilizzati a condizione corretta movimentazione degli organi in CleaSoluzione anello è realizzato.

1. Per la microscopia ottica fogli
   1. Posizionare o montare il campione in modo appropriato.
   2. Fissare l'organo eliminato ruotando manualmente la vite del supporto del campione ^4.
   3. Immergere il campione nella camera di imaging (preferibilmente di vetro) di thelight fogli microscopio che viene riempito con BABB o DBE, se è stato utilizzato nella fase di compensazione finale.
2. Per più di microscopia fotone / confocale
   1. Montare il campione su un vetrino per immagini (o una camera di imaging) con la soluzione di imaging finale per poter un'immagine con un fotone più o microscopia confocale, che utilizzano in genere olio o acqua immersi obiettivi.
   2. Utilizzare cemento dentale per fare un bordo intorno al tessuto.
   3. Riempire la piscina con BABB o DBE appena prima di cemento dentale diventa completamente rigida.
      Nota: Il cemento dentale solidifica rapidamente; praticare un paio di volte per acquisire familiarità con esso prima di provare i campioni reali.
   4. Porre immediatamenteil campione eliminato nel centro della piscina e coprire con un vetro di copertura.
   5. Premere il vetro di copertura finché non è completamente sigillato da cemento dentale e tocca la superficie dell'organo eliminato, che consentirà a raggiungere la profondità massima di imaging confocale / microscopia multi-fotone.
      Note: Questo assicura che nessuna soluzione di compensazione sarà versato durante l'imaging. Evitare immergendo la lente di immagini direttamente nella soluzione di compensazione, che può danneggiare la lente se non è resistente a BABB / DBE o ha una copertura di protezione.

Organi 4. Imaging sgomberati

Timing: 15-45 min.

1. Raccogliere un z-scan che copre l'intero tessuto cancellato (se l'obiettivo utilizzato consente) con la risoluzione migliore che il microscopio in grado di fornire.
2. Ingrandite sulle regioni di interesse per raccogliere immagini ad alta risoluzione.

5. Esame dei dati con il software Amira

1. Caricare la serie di immaginis al software Amira con modulo ResolveRT.
2. Immettere le dimensioni voxel corrette nella finestra di "Immagine Read Parameter" e premere ok.
3. Selezionare l'opzione "Multi Planer View" sub-applicazione. Quindi utilizzare il cursore "spessore" per scegliere la soglia ottimale per i valori di grigio, regolando i valori 2D e 3D.
4. Visualizza il campione sfogliando le fette in diversi orientamenti 2D e utilizzando il modulo di colture angolo in vista 3D.
   Nota: Una guida dettagliata risoluzione dei problemi del protocollo può essere trovato in Ertürk et al ^4.

Risultati

I neuroni sono altamente polarizzate cellule con morfologia estremamente lungo. La loro funzione dipende dalle connessioni che formano tra loro e con altri tessuti. Quindi, mappando l'organizzazione strutturale dei neuroni è estremamente importante per capire come funzionano in salute e malattia. Tuttavia, tracciando tali enormi connessioni neuronali in tutto il nervoso denominato sistema recentemente connectomics ¹¹ - rimane una delle sfide più difficili nel campo delle neuroscienze. A tal fine, sia UE ¹² e USA ¹³ hanno avviato grandi progetti per mappare il cervello umano.

Mentre 3DISCO può essere impiegato in vari organi, è stato particolarmente utile per rintracciare lunghe connessioni neuronali nel midollo spinale e nel cervello. Ad esempio, utilizzando scansioni Ultramicroscopy di ampi segmenti del midollo spinale eliminato, i collegamenti assonale possono essere seguiti nel corso centimetri nel midollo spinale di roditori (Figura 2). In modo simile, l'intero cervello azzerato mouse (Figura 3a) e nell'ippocampo (Figura 3b) possono essere esposte a seguire connessioni neuronali nel cervello.

Quando la microscopia confocale fotone o più viene utilizzato sugli organi eliminato, la risoluzione delle immagini può essere notevolmente migliorata, soprattutto in z-dimensione. Per esempio, più fotoni imaging midolli spinali eliminato da topi linea GFP-M (Figura 4a) raggiunge una immagine seamless tutta la profondità (~ 1,5-2 mm) del midollo spinale. Microcopy confocale sul midollo spinale eliminato garantisce una migliore risoluzione in modo simile (figure 4b e c). Multi microscopia Photon Imaging di cervelli eliminato offre immagini ad altissima risoluzione per visualizzare i dettagli fini su strutture neuronali tra cui spine dendritiche (Figura 5). I campioni per 3DISCO possono essere etichettati in vari modi, tra cui l'espressione del transgene, viral trasfezione, colorante tracciamento e l'etichettatura degli anticorpi. Ad esempio, è possibile etichettare l'intero sistema vascolare del cervello (figure 6a e b) e del midollo spinale (figure 6c e d) utilizzando lectine coniugate traccianti fluorescenti ^4, che può essere usato per studiare il sangue-cervello-barriera (BBB ), nella salute e nella malattia.

Entrambe le microglia e astrociti sono altamente implicati nella patologia della neurodegenerazione comprese le malattie di Alzheimer e le lesioni traumatiche ^14,15. Utilizzando 3DISCO, la loro densità e distribuzione nel midollo spinale (Figura 7) o cervello possono essere studiate.

Tessuti non neuronali possono anche essere ripreso. Per esempio, cellule Clara nell'intera polmoni roditori possono essere immunolabeled con anticorpi e ripreso senza sezionamento a livello di singola cellula (Figura 8). Analogamente, è possibile cancellare e celle di immagine ad esempiocellule alfa del pancreas tessuto non sezionato (Figura 9).

Figura 1. 3DISCO compensazione tessuto rende i tessuti non sezionato trasparenti per l'imaging dei tessuti profondi. (A) Uncleared e liquidati (b) i tessuti del midollo spinale come si vede dalla luce visibile. Su di compensazione, profonda scansione laser microscopio il tessuto diventa possibile. (C) i tessuti del midollo spinale Uncleared e liquidati sono stati ripresi al microscopio 2-fotone. Barre di scala in a, b = 0.5 mm ed in c = 100 pm.

Figura 2. 3DISCO imaging midollo spinale a seguire le estensioni assonale. Il midollo spinale sezionato da Thy-1 linea di topi transgenici GFP (GFP-M) è divisa in parti più piccole (~4 mm). Dopo aver seguito il protocollo di compensazione per i piccoli tessuti (Tabella 1) midolli spinali trasparenti sono state visualizzate utilizzando ultramicroscopy. Ricostruzioni 3D di 4 mm segmento ~ midollo spinale in orizzontale (a), coronale (b) e sagittale (c). (D) Rappresentante fatta assoni (rosso) sono mostrati nella vista in scala di grigio trasparente. (E) Vista Alto ingrandimento della regione indicata in (d). Barre di scala in a, b, c, d = 0.5 mm ed in e = 20 micron.

Figura 3. 3DISCO imaging cerebrale eliminato e ippocampo. Esempi di cervello e dell'ippocampo dei topi GFP-M liquidati sono stati ripresi con una ultramicroscopio. Visualizzazioni 3D dell'intero cervello (a) e ippocampo (b) che dimostrano la GF neuronaleRKS nei tessuti impressi trasparenti. Barre di scala in a = 2 mm e in b = 20 micron.

Figura 4. Tissue compensazione migliora la risoluzione ottenuta da più fotoni e microscopia confocale. Trasparenti segmenti del midollo spinale di topi GFP-M ripresi dal più fotoni (a) o la microscopia confocale (b, c). Si noti che la compensazione sostanzialmente migliora la risoluzione e la profondità delle immagini rivelando la struttura fine degli assoni e dendriti. Barre di scala in un = 100 pm e in b, c = 20 micron.

Figura 5. 3DISCO immagini delle spine dendritiche. Tessuto cerebrale trasparente da topi GFP-M ripresi dal più fotoni. Visualizzazioni 3D della regione di corteccia cerebrale acquisita presentati in verprospettive (a) ticali e orizzontali (b). (C) ~ 50 micron sporgenza rispetto ai livelli indicati in (a, b). (D) Alto ingrandimento della regione indicata in (c) dimostrare i piccoli dettagli delle strutture neuronali tra cui spine dendritiche (frecce). Barre di scala in un = 50 micron, in b, c = 25 micron, in d = 5 micron.

Figura 6. 3DISCO di vascolarizzazione. Per etichettare i vasi sanguigni negli organi interi, lectina-FITC colorante è stato utilizzato durante la perfusione (prima della compensazione) come descritto ^16. È degno di nota ricordare che abbiamo scoperto che l'iniezione coda vena del tracciante dà il segnale migliore rispetto perfusione cardiaca del tracciante. Dopo aver raccolto i cervelli fissi e midollo spinale, sono stati liquidati e homaged da ultramicroscopy. Visualizzazione 3D dell'intero sistema vascolare cervello di topo in heatmap (a) e scala di grigi (a). (B) visualizzazione 3D della vascolarizzazione di un segmento di midollo spinale di topo in heatmap (c) e scala di grigi (d). Le heatmaps stati generati in base all'intensità di lectina colorazione; blu: bassa intensità (sfondo) e rosso: ad alta intensità (vascolare). Barre di scala in a = 2 mm b = 1 mm, e in c, d = 250 pm.

Figura 7. 3DISCO delle cellule gliali nel tessuto del sistema nervoso centrale eliminato. Midollo spinale di topi transgenici che esprimono GFP in microglia tgh (CX3CR1-EGFP) o astrociti TGN (hGFAP-ECFP) sono stati liquidati e ripreso al microscopio multi fotone. Rendering 3D di microglia è indicata come volume di visualizzazione superficie (a) e vista trasparente ( (C) Una proiezione ottica (~ 50 micron) viene presentato per visualizzare i dettagli della microglia nel midollo spinale. Rendering 3D di astrociti è mostrata come visualizzazione del volume di superficie (a) e vista trasparente (b). (F) Una proiezione ottica (~ 50 micron) viene presentato per visualizzare i dettagli degli astrociti nel midollo spinale. Barre di scala in a, b, d, e = 100 pm e in C, F = 50 pm.

Figura 8. 3DISCO di un lobo polmonare tutto il montaggio con anticorpo colorazione di cellule Clara. Per la colorazione anticorpale tutto il montaggio di lobi polmonari, 10 settimane di età topi BALB / C femminili sono stati perfusi attraverso il ventricolo destro con PBS per rimuovere il sangue dai polmoni. I polmoni sono stati successivamente gonfiati con 4% PFA e fissati O / N a RT nel fissativo di almeno tre volte il volume del secoloe tessuto. Il giorno dopo, i polmoni sono stati brevemente sciacquato con PBS e il lobo destro è stato messo in 5 ml di 1% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione per 48 ore o fino a quando il tessuto è affondata. Tutte le colorazioni sono state eseguite in 0,2% Triton X-100 in PBS contenente 5% FBS e 2% BSA e risciacqui erano in 0,2% Triton X-100 in PBS. Colorazione con anti-CC10 è stato per 72 ore a 4 ° C, seguita da ampi lava per circa 6 ore. Marcatura fluorescente dell'anticorpo primario è stato raggiunto con anti-capra-Alexa Fluor-594 anticorpo secondario notte a 4 ° C, seguita da ampi lavaggi per 6 ore a notte. Il giorno seguente, lobi macchiati sono azzerati e 50%, 70% e 80% THF per 30 minuti ciascuno seguito da tre lavaggi in 30 min al 100% THF, seguita da 20 minuti in DCM, seguiti da 30 min in DBE. Barre di scala in una e b = 1 mm e in c = 100 pm.

Figura 9. 3DISCO del pancreas. Dopo la perfusione di topi come sopra descritto nel protocollo, il pancreas è stato dissezionato e cancellato con il protocollo corto. La fluorescenza è derivato da Rosa26 LSL tdTomato ricombinazione indotta da Tamoxifene di topi portatori 200 kb BAC transgene attraversa il glucagone locus endogeno topo con CreERT2 inseriti nella ATG di glucagone. Le frecce indicano alcune delle cellule alfa fluorescenti marcato nel isolotto. Barre di scala in a, b, c = 1 mm e in d = 500 pm.

Tabella 1. Protocolli tessuto di compensazione per i vari tessuti. Esempi di protocolli di compensazione dei tessuti per i diversi tessuti. Si noti che il tempo di compensazione per ogni passaggio può essere ridotto o esteso come necessario per migliorare le prestazioni di compensazione. Il peso approssimativo di piccoli tessuti è ~ 20-100 mg e cervello è ~ 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Discussione

Metodi Tissue compensazione mirano a ridurre la dispersione di luce di imaging facendo corrispondere gli indici di rifrazione dei diversi strati di tessuto negli organi eliminato. Come risultato, la luce di imaging può penetrare in profondità nei tessuti e stimolare le cellule etichettate / molecole. Questo vecchio concetto di tessuto compensazione ¹⁷ ha guadagnato crescente attenzione dopo la prima sofisticata applicazione della tecnica su cervelli intatti topo da Dodt e colleghi ^2. Da allora, c'è una lista sempre crescente di nuovi metodi di compensazione tra cui 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY e SeeDB ^3,4,7,18-20. In sostanza, tutti mirano a rendere gli organi trasparenti per l'imaging dei tessuti profondi preservando l'etichetta fluorescente. Tra questi, 3DISCO distingue come uno dei metodi più semplici e riproducibili. E 'relativamente veloce rispetto ad altri metodi di compensazione di cui sopra (1-5 giorni vs 2-3 settimane per il cervello adulto, rispettivamente) ^21. E 'già stato successopienamente applicato a diversi organi quali il cervello, il midollo spinale, linfonodi, milza, polmone, tumori solidi, pancreas e ghiandole mammarie ^3,4,9. Inoltre, diverse pubblicazioni da parte di gruppi di ricerca indipendenti già usato questo metodo per ottenere risultati di imaging ^22,23. Tuttavia, diverse procedure di compensazione tessuto potrebbe essere vantaggioso per condizioni diverse. Per esempio, mentre Sca / e e SeeDB sono applicabili meglio sui tessuti embrionali ^6,7, sono i metodi di compensazione a base d'acqua, che potrebbe essere più facile da maneggiare durante l'imaging. Al contrario, la chiarezza è un complicato e costoso metodo di compensazione. Ma può essere vantaggioso nel contesto di etichettatura anticorpo, soprattutto nelle grandi tessuti come cervello ^8.

La fase più critica per ottenere i migliori risultati di imaging da 3DISCO è l'etichettatura dei tessuti, che si realizza prima la radura tessuto. È essenziale per iniziare con il segnale fluorescente forte possibile. Questo può be realizzato in vari modi, tra cui l'espressione transgenica di proteine ​​fluorescenti, tracciando da coloranti sintetici, trasfezione virale o l'etichettatura degli anticorpi. Va tenuto presente che qualsiasi procedura di compensazione ridurrà il segnale fluorescente dei tessuti. Quindi, se il segnale fluorescente non è abbastanza forte all'inizio - cioè non è facilmente rilevabile prima della compensazione-imaging dei tessuti eliminato fornirà scarsi risultati.

Ci sono alcune limitazioni di compensazione metodi che sono in attesa di miglioramenti. Una limitazione importante è che, poiché i reagenti compensazione alterano la struttura degli organi eliminato, non possono essere utilizzati su tessuto vivo. Quindi, esperimenti come con mEos2 fotoattivabile ²⁴ devono essere eseguite prima di fissare e di compensazione. Su di compensazione, super-risoluzione di immagini del segnale fluorescente dalle proteine ​​luminose e fotostabili diventa possibile. Inoltre, poiché il protocollo di compensazione diminuisce l'intensità delle proteine ​​fluorescenti, gli organi eliminato non possono essere conservati per periodi prolungati. E 'importante notare che alcuni organi sono più difficili da cancellare. In particolare, se gli organi sezionati conservano grandi quantità di cellule del sangue (per esempio, milza, fegato), sono relativamente difficili da cancellare e di immagine. E 'anche relativamente più difficile da raggiungere una compensazione completa per grandi tessuti, come il cervello roditore adulto. Tali tessuti possono avere bisogno di tempi di incubazione più lunghi, che potrebbero, invece, ridurre il segnale fluorescente. Inoltre, lo sviluppo di metodi di microscopia che possa immagini di grandi dimensioni organi trasparenti in una sola volta ad una ad alta risoluzione è un attesa di necessità da affrontare. Un'altra importante limitazione della tecnica è etichettatura tessuto. Mentre un segnale fluorescente forte via di espressione genetica o virus è l'ideale, non ogni cellula o molecola possono essere etichettati geneticamente o virale. D'altra parte, etichettatura anticorpo di tessuti spessi non è una procedura semplice o addirittura non possible nella maggioranza dei casi. Si può avere bisogno di protocolli speciali permeabilizzazione e lunghi tempi di incubazione (diversi giorni a poche settimane) ^3. E 'anche importante tenere a mente che i tessuti si restringono ~ 20% in ciascuna dimensione (misurata per il tessuto del midollo spinale) dopo aver eliminato principalmente per disidratazione e delipidizzazione. Questa contrazione si verifica ratiometrically e dovrebbe essere corretto in passi di quantificazione. Come osservato nei risultati presentati, strutture fluorescente rimangono intatte, che è l'indicazione di integrità proteine ​​nei tessuti eliminato. A causa della natura idrofoba del tessuto finale eliminato, non può essere ulteriormente trattata con anticorpi o incorporato in soluzioni acquose contenenti ad esempio, Focusclear-che è utilizzato in purezza o 80% glicerolo. Infine, è una sfida per analizzare schiacciante dimensioni dei dati di imaging. Ad esempio, quando un intero cervello murino viene scansionato a una risoluzione cellulare, sarebbe molto difficile rintracciare e quantificare str desideriutture (ad esempio, le reti neuronali o gliali) e confronta su diversi campioni in modo automatico. In sintesi, mentre i ricercatori mirano a scoprire nuovi metodi di compensazione, le diverse sfide di cui sopra (difficoltà di compensazione diversi tessuti, imaging ad alta risoluzione delle aree più grandi, e l'analisi dei dati complicato) dovrebbe essere migliorata in parallelo.

In conclusione, recentemente sviluppate tecniche di compensazione dei tessuti tra cui 3DISCO, elegantemente dimostrano che ad alta risoluzione di immagini 3D di organi intatti è ora possibile. Usando questi metodi, scienziati possono ottenere informazioni anatomiche delle cellule e molecole nell'organo intatto. Questi studi pionieristici di imaging 3D su organi trasparenti ispirare un numero crescente di ricercatori di decifrare anatomica complessa e organizzazioni molecolari di tessuti / organi in salute e malattia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
		Thy-1 GFP (GFP-M)	può essere ottenuto da Jackson.
		GFP CX3CR1	può essere ottenuto dal laboratorio Littman della NYU.
TgN(hGFAP-ECFP) di topo			Può essere ottenuto da Jackson.
Paraformaldeide	Sigma	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromoetanolo	Sigma	T48402
2-Metil-2-butanolo	Sigma	152463	Usato per preparare la soluzione di avertina.
Soluzione salina	Braun
Tetraidrofurano	Sigma	186562-12X100ML
Diclorometano	Sigma	270997-12X100ML
Etere dibenzilico	Sigma	Sigma, 108014-1KG
Alcool benzilico	Sigma	305197-100ML
Benzoato benzilico	Sigma	B6630-250ML
Lectina FITC	Sigma	L0401-1MG
anti-CC10	Santa Cruz	SC-9772	0.388888889
Eparina	APP prodotti farmaceutici	504001	Utilizzato nella perfusione.
Fiale di vetro	VWR	548-0554
Pinze	FST	11251-10
Mini rotatore	VWR	100498-878
Foglio di alluminio	Fisherbrand	01-213-104
Flaconi per la conservazione dei terreni da 100 ml Flaconi	per terreni Kimax	EW-34523-00
Pompa di perfusione Minipuls evolution con testa della pompa a medio flusso MF4*	Gilson, Inc	F110701 e F117606
Vetrino per microscopia	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
Vetrino coprioggetto	Corning	2940-245
Piastra di Petri in vetro	Corning Pyrex	3160-101
Cemento dentale	Lang Dental	1223PNK
Test del perossido quantofix Strisce	Sigma	37206
Amira con modulo di microscopia RT resolve	analisi		Visage Imaging
Imaris Software di	analisi		delle immagini Bitplane
ImageJ	NIH	freeware