I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.
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Articolo metodologico
Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo l'uso di Bio-strato interferometria per studiare le interazioni inibitorie della subunità ε con il complesso catalitico di Escherichia coli ATP sintasi. Batterica di tipo F ATP sintasi è l'obiettivo di un nuovo antibiotico approvato dalla FDA per combattere la tubercolosi resistente ai farmaci. Capire specifici batteri-auto-inibizione della ATP sintasi dal dominio C-terminale della subunità ε potrebbe fornire un nuovo mezzo per indirizzare l'enzima per la scoperta di farmaci antibatterici. Il dominio C-terminale di ε subisce un drastico cambiamento conformazionale quando le transizioni tra gli stati di enzimi attivi e inattivi, e ligandi catalitica-portale possono influenzare quale delle conformazioni di ε è predominante. Le cinetiche di saggio misura di ε legante / dissociazione con il complesso catalitico, e indirettamente meaSures lo spostamento di ε enzima legato alla e dalla conformazione inibitorio apparentemente nondissociable. Il segnale interferometria Bio-strato non è eccessivamente sensibili composizione della soluzione, in modo che possa essere utilizzato anche per monitorare gli effetti dei ligandi allosterici catalitica-portale sulle variazioni conformazionali di ε.
Introduzione
Interazioni proteina-proteina sono importanti per molti processi biologici e metodi ottici label-free come Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati in vitro per studiare la cinetica di legame e di dissociazione 1. La maggior parte dei metodi di label-free immobilizzare uno biomolecole su una superficie del sensore e utilizzare un segnale ottico per rilevare un partner di legame dalla soluzione in quanto si associa con la biomolecola immobilizzata 1. Mentre SPR è un metodo altamente sensibile, è soggetta a interferenze dovute a variazioni dell'indice di rifrazione della soluzione scorre sopra il sensore 2. Anc....
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Protocollo
1. Programmare lo strumento per la BLI Assay
Accendere lo strumento almeno un'ora di anticipo per permettere alla lampada di riscaldarsi, questo è necessario per minimizzare il rumore e la deriva in segnale ottico durante l'esperimento. Impostare la temperatura desiderata tramite la scheda strumento per preriscaldare il supporto piastra del campione. Quindi impostare il disegno sperimentale nel software di acquisizione dati. Selezionare "Nuovo Kinetics Experiment" nella scheda Wizard Experiment. Questo presenta un menu a schede con tutti i passi che devono essere definiti.
1.1. Definizione Piatto
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Risultati
Vincolante in tempo reale e la cinetica di dissociazione BLI sono mostrato in Figura 3. Questo esperimento è stato fatto con tampone di saggio in associazione e di dissociazione. Questo esperimento è stato avviato con una fase basale 10 min poiché i sensori sono stati prewet solo brevemente. Successivamente, ε biotinilato è stato caricato sui sensori. Nessuna dissociazione rilevabile di ε si è verificato in tutti i passaggi rimanenti come si è visto dalla curva di riferimento (G) che non aveva partner d.......
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Discussione
Strumenti attualmente disponibili per BLI permettono di throughput e di flessibilità nella saggi per interazioni biomolecolari. Vari campioni di soluzione vengono dispensati in pozzetti della micropiastra nero, e una serie di sensori BLI parallele sono programmati per muoversi avanti e indietro tra colonne di pozzetti sulla piastra. I campioni vengono mescolati agitando orbitale durante tutta la seduta. Il sistema utilizzato qui ha 8 sensori e utilizza una piastra campione di 96-bene, ma un altro sistema utilizza 16 sen.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo FortéBio per fornire grafica utilizzata in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM083088 a TMD
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ottetto-RED96 | Pall/Forté Bio | 30-5048 | |
| Siero Bovino Albumina Sigma | A6003-10G | Biosensore senza acidi grassi | |
| /Palla di streptavidina | /Forté Bio | 18-5019 | Vassoio da 96 sensori |
| Piastra per microtitolazione | Greiner Bio-one | 655209 | Nero, Polipropilene |
| Software di acquisizione dati | Pall/Forté Bio | Versione 6.4 | Versioni più recenti disponibili |
| Software di analisi dei dati | Pall/Forté Bio | Versione 6.4 | Versioni più recenti disponibili |
Riferimenti
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 5....
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Ristampe e permessi
