Strato sottile cromatografica (TLC) Separazioni e Bioassays di estratti vegetali per identificare composti antimicrobici

Sommario

I metodi sono descritti per cromatografia su strato sottile (TLC) separazione di estratti vegetali e contattare bioautografia per identificare i metaboliti antibatterici. I metodi sono applicati alla proiezione del trifoglio composti fenolici che inibiscono iper-ammoniaca batteri che producono (HAB) native del rumine dei bovini.

Abstract

Uno schermo comune per i composti antimicrobici vegetali consiste nel separare estratti vegetali da carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC), esponendo i cromatogrammi di sospensioni microbiche (ad esempio funghi o batteri in brodo o agar), dando il tempo per i microbi di crescere in un ambiente umido, e la visualizzazione zone senza crescita microbica. L'efficacia di questo metodo di screening, noto come bioautografia, dipende sia dalla qualità della separazione cromatografica e la cura con condizioni di coltura microbica. Questo articolo descrive i protocolli standard per TLC e contattare bioautografia con una nuova applicazione di aminoacidi batteri dell'acido fermentazione. L'estratto viene separata su flessibili (alluminio-di appoggio) lastre TLC silice, e le bande sono visualizzati sotto luce ultravioletta (UV). Le zone sono tagliati fuori e incubate a faccia in giù su agar inoculato con il microrganismo test. Bande inibitorie sono visibili con la colorazione della piastra di agars con tetrazolio rosso. Il metodo è applicato alla separazione di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland), composti fenolici e la loro selezione per attività contro il Clostridium sticklandii, un batterio che produce ammoniaca iper (HAB), che è nativo del rumine dei bovini. I metodi TLC applicano a molti tipi di estratti vegetali e altre specie batteriche (aerobici o anaerobici), così come funghi, può essere utilizzato come organismi di prova se le condizioni della coltura vengono modificate per adattarsi alle esigenze di crescita della specie.

Introduzione

Saggio di composti antimicrobici nelle piante richiede separare i componenti di un estratto vegetale, esponendo un microrganismo di prova per tali componenti, e determinare se la crescita del microrganismo è inibita da qualsiasi dei composti. Separazioni di carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC) sono convenienti perché molti composti possono essere separati su una superficie planare. La separazione è basata sulla polarità, con alcuni composti vincolante strettamente al adsorbente (cellulosa nel caso di PC, e una varietà di adsorbenti nel caso di TLC) e la migrazione meno di altri ^1. Figura 1 fornisce un esempio delle posizioni ....

Protocollo

1. Preparazione di Estratto di piante

1. Per l'estrazione di composti fenolici da Trifolium pratense cv vedere Kagan e Flythe ^10. Kenland.
2. Per estrarre altri composti in altre piante, cercare la letteratura analisi fitochimici per metodi di estrazione-vegetali o specifico metabolita (molti sono descritti), o per cercare protocolli come quelli di Khurram et al. ^7,8 che isolano molti composti ad un'ampia gamma di polarità.

2. Preparazione delle piastre di strato sottile

1. Piastre TLC Clean di sviluppo in uno o più solventi polari, neutri, in modo da spostare i ....

Risultati

Rappresentante separazioni TLC silice di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland) estratti, contenenti composti fenolici, sono illustrati nella Figura 2. Separazione di estratto di trifoglio rosso in acetato di etile-esano (9:1, v / v), oltre 8,5 cm provocato cinque bande, una incompleto risolto dall'origine (Figura 2A). Tuttavia, la Figura 2B mostra che circa il doppio delle bande sono stati rivelati quando un altro campione di estratto di trifogli.......

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo semplice per separare un estratto in sottoinsiemi di composti e saggiando i sottoinsiemi per contatto bioautografia. Il metodo è molto simile a quello utilizzato da Chomnawang et al. ¹⁵ per lo screening per i metaboliti vegetali inibitori di batteri che causano la gonorrea. Il tipo di bioautografia impiegato per lo screening composti vegetali antimicrobici dipende da molti fattori, tra cui il microrganismo prova, il setup di laboratorio, e le preferenze della pers.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lastre TLC F254, con retro in alluminio, spessore 0,2 mm, 20 cm x 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	Queste piastre sono rivestite con silice che contiene un indicatore fluorescente a 254 nm. I composti che assorbono a quella lunghezza d'onda appaiono scuri su uno sfondo verde fluorescente. Le fonti alternative includono Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Potrebbero essere necessari adsorbenti diversi dalla silice. Le piastre con supporto in plastica possono essere adatte, a seconda dei solventi da utilizzare.
Forbici affilate e resistenti	qualsiasi azienda di forniture per cucire	simile a Fiskars 175800-1002	Per il taglio di lastre TLC. È possibile utilizzare anche un tagliacarte con una lama affilata. Non inalare la polvere di silice.
Forno di essiccazione a 100 gradi C (convezione meccanica)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC camera	Kimble Chase	416180-0000	Fonti alternative:  Aldrich. I bicchieri in pyrex o i barattoli per conserve possono essere utilizzati per piccoli piatti (ad esempio 5 cm x 10 cm).  Coprire con un foglio di alluminio (i coperchi dei barattoli possono contenere materiale estraibile dai vapori di solvente).
50 µ l Siringa con punta piatta dell'ago	Hamilton	80965	Per il caricamento di quantità di standard o campione superiori a 5-10 µl.  Le fonti alternative sono equivalenti.
Micropipette	Drummond	2-000-001	Per il caricamento di piccole quantità di standard o campioni. Fonti alternative:  VWR.  Inoltre, le pipette Pasteur possono essere allungate a un diametro più sottile con una torcia a butano.
Carta da filtro (grado #1)	Whatman	1001 917	Funge da stoppino da camera. Altri tipi di carta da filtro sono OK. Questa dimensione può essere tagliata per le camere che contengono piastre da 20 cm x 20 cm.
Pinze per becher	Fisher Scientific	15-186	Per inserire e estrarre le piastre da una grande camera TLC. Fonti alternative: VWR
Pinze a lama piatta	Fisher Scientific	10-275	Per inserire e sfilare le piastre da una piccola camera. Fonti alternative: VWR
Piccola lampada UV portatile con lampadine da 4 W o 6 W per illuminazione a luce UV a onde corte e lunghe (254 e 365 nm, rispettivamente)	Ultraviolet Products	95-0271-01	Fonti alternative: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Visore per l'uso con lampada UV portatile	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	Le bande attive ai raggi UV sono più facilmente cerchiate se le piastre possono essere inserite qui. Fonti alternative: Spectronics Corporation.
Sistema di fotodocumentazione con lampada UV a soffitto e lampada a vista	Kodak	Gel Logic 200	Fonti alternative: Prodotti ultravioletti (www.uvp.com).  Vedi il protocollo per l'alternativa fatta in casa.
Camera anaerobica, tipo A, vinile	Coy	7150000	Questa camera è adatta per batteri anaerobi, come Clostridium sticklandii, come descritto. Tuttavia, le condizioni di crescita devono essere adattate all'organismo utilizzato nel test. Se si utilizzano organismi patogeni, è necessario adottare una cabina di biosicurezza e altre precauzioni. Fonti alternative: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, altri
Tetrazolio rosso	Sigma-Aldrich	T8877	Fonti alternative: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Per questo e per tutti gli altri reagenti in questa tabella, le fonti alternative sono equivalenti.
Riboflavina	Sigma-Aldrich	R4500
Tiamina HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376
Calcio D-Pantotenato	Sigma-Aldrich	C8731
Acido lipoico	Sigma-Aldrich	T5625
acido p-aminobenzoico	Sigma-Aldrich	A9878
Acido folico	Sigma-Aldrich	F8798
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamina	Sigma-Aldrich	C3607
Piridossale HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Piridossina	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Solfato di ferro · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Solfato di zinco · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Cloruro di manganese · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768
Cloruro di cobalto · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Cloruro di rame · 2H2O	Sigma-Aldrich
Cloruro di nichel · 6H2O	Sigma-Aldrich	203866
Molibdato di sodio · 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Tripticasi (digestato pancreatico della caseina)	Thermo Fisher	B11921
Fosfato di potassio monobasico anidro	Thermo Fisher	P284
Carbonato di sodio · H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Solfato di magnesio · 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Cloruro di calcio · 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Cisteina HCl	Thermo Fisher	19464780
Potassio fosfato bibasico anidro	Thermo Fisher	P290
Cloruro di sodio	Thermo Fisher	BP358

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