Strato sottile cromatografica (TLC) Separazioni e Bioassays di estratti vegetali per identificare composti antimicrobici

Sommario

I metodi sono descritti per cromatografia su strato sottile (TLC) separazione di estratti vegetali e contattare bioautografia per identificare i metaboliti antibatterici. I metodi sono applicati alla proiezione del trifoglio composti fenolici che inibiscono iper-ammoniaca batteri che producono (HAB) native del rumine dei bovini.

Abstract

Uno schermo comune per i composti antimicrobici vegetali consiste nel separare estratti vegetali da carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC), esponendo i cromatogrammi di sospensioni microbiche (ad esempio funghi o batteri in brodo o agar), dando il tempo per i microbi di crescere in un ambiente umido, e la visualizzazione zone senza crescita microbica. L'efficacia di questo metodo di screening, noto come bioautografia, dipende sia dalla qualità della separazione cromatografica e la cura con condizioni di coltura microbica. Questo articolo descrive i protocolli standard per TLC e contattare bioautografia con una nuova applicazione di aminoacidi batteri dell'acido fermentazione. L'estratto viene separata su flessibili (alluminio-di appoggio) lastre TLC silice, e le bande sono visualizzati sotto luce ultravioletta (UV). Le zone sono tagliati fuori e incubate a faccia in giù su agar inoculato con il microrganismo test. Bande inibitorie sono visibili con la colorazione della piastra di agars con tetrazolio rosso. Il metodo è applicato alla separazione di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland), composti fenolici e la loro selezione per attività contro il Clostridium sticklandii, un batterio che produce ammoniaca iper (HAB), che è nativo del rumine dei bovini. I metodi TLC applicano a molti tipi di estratti vegetali e altre specie batteriche (aerobici o anaerobici), così come funghi, può essere utilizzato come organismi di prova se le condizioni della coltura vengono modificate per adattarsi alle esigenze di crescita della specie.

Introduzione

Saggio di composti antimicrobici nelle piante richiede separare i componenti di un estratto vegetale, esponendo un microrganismo di prova per tali componenti, e determinare se la crescita del microrganismo è inibita da qualsiasi dei composti. Separazioni di carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC) sono convenienti perché molti composti possono essere separati su una superficie planare. La separazione è basata sulla polarità, con alcuni composti vincolante strettamente al adsorbente (cellulosa nel caso di PC, e una varietà di adsorbenti nel caso di TLC) e la migrazione meno di altri ^1. Figura 1 fornisce un esempio delle posizioni relative composti fenolici polari e apolari dopo separazione su una piastra TLC silice.

Figura 1. Diagramma che illustra le distribuzioni di composti di diverse polarità dopo la separazione su una silice per cromatografia su strato sottile (TLC) piastra. Composti fenolici di trifoglio rosso (Trifolium pratense L.) vengono utilizzati come esempio. Composti polari, come clovamide, hanno una forte affinità per un adsorbente polare come silice e rimangono vicino all'origine (OR), mentre i composti polari meno, come le tre isoflavoni vicino al fronte del solvente (SF), partizione più facilmente in solventi (che sono meno polare silice meno acqua, acidi o basi sono incluse) e migrare lontano sulla piastra.

Dopo separazione di un estratto su una piastra TLC, microrganismi di prova possono essere esposti a tutti i composti sulla piastra, accelerando così l'identificazione dei componenti attivi di un estratto ^2. Se una coltura fungina o batterica è esposto al cromatogramma, crescita microbica avverrà ovunque tranne su aree con incremento-inibitoreComposti y. Zone di inibizione quindi possono essere visualizzate osservando il contrasto tra la crescita del micelio e le zone di libero crescita se i funghi sono stati applicati ³ o spruzzo con composti che cambiano colore quando ridotto o idrolizzato dalle cellule viventi ^4. Sebbene l'uso di carta o sottile strato cromatogrammi per saggi antimicrobici è stata applicata in primo luogo agli antibiotici ⁵ e fungicidi ^3,6, estratti di piante sono ora spesso sottoposti a screening per composti antimicrobici con questo metodo, spesso definito come bioautografia. I protocolli descritti nel presente documento si applicano a bioautografia di cromatogrammi a film sottile. TLC è ampiamente utilizzato perché è relativamente rapida e può essere eseguita su diversi adsorbenti (ad esempio silice, amido, allumina), oltre a fornire una buona risoluzione e sensibilità ^1.

Estratti vegetali possono essere preparati per TLC in molti modi. I metodi più comuni includono materiale vegetale di estrazione in alcmiscele ohol in acqua come etanolo 80% ^7,8, eventualmente con l'aggiunta di acido o di base ^9. A seguito un'estrazione in tali solventi, che contengono acqua e sono eventualmente acida o basica, estratti devono essere concentrate in modo che possano essere applicati alle piastre TLC in un volume minimo. La concentrazione di estratti alcol-acqua può essere ottenuto partizionando con solventi organici immiscibili in acqua ⁸ o con una miscela di tali solventi, quali acetato di etile-etere etilico (1:1 v / v) ^10,11. Diversi metaboliti vegetali vengono estratti in solventi organici diversi, a seconda della loro polarità. Per assicurarsi che l'impianto acidi organici o basi vengono estratti in solventi organici, in questa fase, il pH di un estratto alcolico-acqua può essere sollevato o abbassato con un acido solubile in acqua o base per convertire analiti dissociate nelle loro forme nondissociated, che sono poi solubile in solventi organici neutri ^9. La fase organica può quindi essere postavaporated sotto pressione ridotta o sotto azoto e regolato il volume desiderato per TLC. Il pH dell'estratto è improbabile che sia letale per i microrganismi di prova biologica dovuti all'isolamento di analiti in solventi neutri, piccolo volume finale, e l'evaporazione dell'estratto sulla piastra TLC prima della separazione.

Entrambi i funghi e batteri sono impiegati come microrganismi prova in bioautografia di estratti vegetali ^2. Spore di alcuni funghi, come Cladosporium cucumerinum, germinano su piastre di TLC (a parte le zone con composti inibitori) se spruzzato su piastre in una soluzione nutritiva e incubate in un ambiente umido per diversi giorni ^3. Il micelio scuro di C. cucumerinum sulle zone noninhibitory fornisce un netto contrasto con le zone franche di crescita del micelio. Anche se i batteri sono stati applicati per cromatografia su strato sottile (TLC) piastre nello stesso modo ^4,12, i batteri si riversano anche su TLCsuperfici delle piastre di agar si sovrappone ^13,14. Lieviti, come Candida albicans, può essere applicato in sovrapposizioni agar e ^14. In alternativa, le piastre TLC possono essere posizionati a faccia in giù su agar inoculato con batteri o lieviti ^{10,15 8,} un metodo noto come contatto bioautografia ^2.

Descriviamo un metodo per contatto bioautografia per schermare per i composti fenolici antimicrobici di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland). Il microrganismo test è Clostridium sticklandii, a-ammoniaca produce iper batterio ruminale (HAB) e obbligano anaerobi. Sebbene le separazioni utilizzati non risolvono tutti i componenti dell'estratto, facilitano l'individuazione delle zone di attività antimicrobica, riducendo così il numero di possibili composti antimicrobici. Il protocollo utilizza procedure standard per TLC ^1. Il protocollo descrive anche alcune delle tecniche necessarie per la coltura obblighianaerobi cancello per tale saggio, un ciclo di contatto bioautografia ¹⁵ e un metodo di visualizzazione con un sale di tetrazolio, che colora le cellule viventi ^2,4.

Protocollo

1. Preparazione di Estratto di piante

1. Per l'estrazione di composti fenolici da Trifolium pratense cv vedere Kagan e Flythe ^10. Kenland.
2. Per estrarre altri composti in altre piante, cercare la letteratura analisi fitochimici per metodi di estrazione-vegetali o specifico metabolita (molti sono descritti), o per cercare protocolli come quelli di Khurram et al. ^7,8 che isolano molti composti ad un'ampia gamma di polarità.

2. Preparazione delle piastre di strato sottile

1. Piastre TLC Clean di sviluppo in uno o più solventi polari, neutri, in modo da spostare i contaminanti adsorbiti dalla zona di sviluppo.
   1. In una cappa aspirante, preparare abbastanza solvente (es 15-100 ml di acetato di etile-metanolo 2:1, v / v) per coprire il fondo della camera di sviluppo TLC, così come il bordo inferiore di una piastra TLC quando insieme all'interno della camera.
   2. Utilizzare commervetro cialmente disponibili TLC sviluppare camere (diverse dimensioni disponibili, con coperchi) o foglio coperto di Pyrex bicchieri o vasi da conserva.
   3. Usare le forbici per tagliare (flessibili) lastre di gel di silice di plastica-backed, che sono disponibili in varie dimensioni (20 cm x 20 cm e più piccoli), per adattarsi alla camera di sviluppo disponibili in alluminio o. (Attenzione: silice può causare danni ai polmoni se inalato funziona in una cappa aspirante, e di gestire le piastre TLC con i guanti per evitare di ottenere oli per la pelle sulla silice.).
   4. Inserire le piastre nella camera, con le cime appoggiati contro le pareti della camera. Piatti non devono toccarsi. Coprire la camera e lasciare che il solvente spostare la piastra per azione capillare.
   5. Quando il solvente ha raggiunto la cima delle piastre, rimuovere le piastre dalla camera e disporre in una posizione eretta all'interno della cappa fino solvente è evaporato.
   6. Verificare se le impurità sono migrati vicino alla parte superiore della piastra TLC cercando una banda gialla sotto visibileluce, o una banda fluorescenti ai raggi ultravioletti (UV) (vedere "fronte impurità" o IF in Figura 2B). Se la maggioranza della piastra presenta ancora una sfumatura giallastra, ripetere il processo di pulizia.
   7. Dopo aver rimosso le piastre TLC dalla camera, scartare il solvente. Lasciare solvente residuo evaporare completamente prima di utilizzare la camera di protocollo 2.
   8. Per rimuovere l'umidità residua che può influenzare la migrazione dei composti su silice ^16, prop le piastre in posizione verticale in forno a 100 ° C (10-15 min per 20 cm x 20 cm Piatto, e 5 min per 7 cm x 10 cm piastre ).
   9. Se un 100 ° C forno di essiccazione non è disponibile, piastre di calore per un periodo di tempo più lungo a temperature più basse (cioè 40 min a 60 ° C).
   10. Dopo le piastre sono asciutti, lasciarli raffreddare a temperatura ambiente prima del caricamento.

3. Preparazione di Sviluppo Chambers per estratto Separation

1. Utilizzare le forbici per tagliare un pezzo di carta da filtro leggermente inferiore Altezza della camera, e circa la metà del perimetro camera in larghezza. Questo documento funge da stoppino di elaborare solvente fino parete della camera e saturare la camera con i vapori di solvente, migliorando così la riproducibilità delle separazioni ^1.
2. In una cappa aspirante, miscelare solventi (acetato di etile-metanolo 4:1, v / v, per questo studio). Versare il composto di solvente nella camera e coprire. Attendere che l'intero stoppino è bagnato con del solvente, indica la saturazione della camera, per mettere le piastre nella camera.

4. Caricamento e Sviluppo di piastre TLC

1. Leggermente segnare l'origine con la matita. Se la piastra assorbente TLC è morbido e facilmente danneggiati, fare segni ai bordi. Composti dovrebbero essere sopra la superficie del solvente di sviluppo quando piastre vengono inseriti nella camera di TLC.
2. Sciogliere estratti in solvente organico sufficiente (in questo caso, metanolo) per avere una soluzione concentrata invece di una torbidasospensione.
3. Caricare i campioni e gli standard come bande strette con una siringa microlitro o micropipette capillari, lasciando un bordo di 1 cm sui lati della piastra. Lasciare le bande asciugare (sfogliare la targa o caricarlo in una cappa aspirante aiuta).
4. Se è necessaria una maggiore concentrazione di campione su un piatto, "overspot" di caricare i campioni di nuovo sulle bande secchi.
5. Con pinze o tenaglie, impostare piatto (s) all'interno della camera di TLC saturo. Piastre non dovrebbero toccare lo stoppino perché può fornire solvente alle piastre nei punti di contatto, modificando così il percorso di migrazione composto. Coprire camera e lasciare le piastre si sviluppano.

5. Preparazione di piatti per Bioassay

1. Rimuovere piastra (s) dal serbatoio TLC prima il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra, e segnare l'altezza del fronte del solvente con una matita. Lasciate monodisco a secco in cappa.
   1. Sviluppare i rimanenti piastre TLC nella stessa camera TLC, che è generally utilizzabile per un giorno intero se tenuto chiuso. Rifare miscela solvente per camera TLC se la quantità di solvente nella camera diminuisce notevolmente.
2. Dopo le piastre sono a secco, visualizzare le bande sotto la luce visibile o UV, e delineare le bande con una matita. Una camera di osservazione con una lampada UV portatile è conveniente, soprattutto se la lampada può rilevare composti sia a 254 nm (UV ad onde corte) e 365 nm (onda lunga UV).
   Nota: A questo punto o dopo la fase successiva, le piastre possono essere avvolte in pellicola trasparente, coperto con un foglio, e conservati a -20 ° C. Periodo massimo di conservazione dipende dalla stabilità composto. Poiché la silice non è neutrale, alcuni composti possono degradare mentre sulla piastra TLC.
3. Fotografare o disegnare piatti.
   1. Utilizzare un sistema gel foto documentazione, se uno dotato di UV spese generali e / o le luci visibili è disponibile.
   2. Se nessun sistema di foto documentazione commerciale è disponibile, piatti fotografia all'interno di una scatola foderata con carta o panno scuro, wi° Un set fotocamera su un treppiede e una luce UV portatile bloccato per un anello di supporto ^17. Quando si fotografa piatti che non hanno indicatore fluorescente, utilizzare un filtro luce blu sopra l'obiettivo della fotocamera per migliorare banda aspetto ^17.
4. Per facilitare bande caratterizzazione, calcolare valori del fattore di ritenzione (R _f) per distanze percorse dai composti e fronte del solvente misurazione, e dividendo il primo dal (Figura 2A) quest'ultimo.

6. Batterica cultura e Assay

1. Preparare e inoculare i terreni in condizioni anaerobiche. La lingua utilizzata in questo caso è stato Clostridium SR ceppo sticklandii, che è stato ottenuto dalla raccolta cultura di James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
   1. Vedere Flythe e Kagan ¹³ e l'elenco dei materiali per una descrizione di HAB media.
2. Far crescere la cultura fase esponenziale o stazionaria. Utilizzare sterile anaerobica techniques quando si lavora con microrganismi anaerobici.
3. Inoculare la cultura (1% v / v) in agar fuso dopo che la temperatura della agar (0,75% w / v) è diminuita a meno di 60 ° C. Mescolare delicatamente e portare subito in una camera anaerobica (95% di CO ₂ -5% H ₂ atmosfera per HAB media) a versare.
4. Versare in 15 millimetri x 100 millimetri di plastica Petri e lasciare solidificare.
5. Con le forbici, tagliare la piastra TLC in zone contenenti band (s) di interesse. Lay bande a faccia in giù su piastre di agar, bande sul supporto targhetta di marcatura per tenere traccia di orientamento originale su piastra TLC. Lay una striscia TLC inutilizzato su una piastra di agar come controllo.
6. Incubare le piastre di agar agar, lato verso il basso, nella camera anaerobica (24 hr, 39 ° C).

7. Visualizzazione dei piatti Bioassayed Agar

1. Con pinze, eliminare le bande da piastre di agar mentre sono nella camera anaerobica.
2. Aggiungere 1% (w / v) terosso trazolium, preparato in acqua, a gocce sulle superfici delle piastre di agar. Lasciare che il sviluppare il colore per almeno 20 minuti, o fino a quando la piastra di controllo diventa completamente rossa, prima di rimuovere dalla camera anaerobica. I batteri anaerobici inizieranno a perdere vitalità subito dopo la rimozione dalla camera anaerobica, ma il colore è stabile per più di 24 ore.
3. Fotografare in luce visibile.

Risultati

Rappresentante separazioni TLC silice di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland) estratti, contenenti composti fenolici, sono illustrati nella Figura 2. Separazione di estratto di trifoglio rosso in acetato di etile-esano (9:1, v / v), oltre 8,5 cm provocato cinque bande, una incompleto risolto dall'origine (Figura 2A). Tuttavia, la Figura 2B mostra che circa il doppio delle bande sono stati rivelati quando un altro campione di estratto di trifoglio ro...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo semplice per separare un estratto in sottoinsiemi di composti e saggiando i sottoinsiemi per contatto bioautografia. Il metodo è molto simile a quello utilizzato da Chomnawang et al. ¹⁵ per lo screening per i metaboliti vegetali inibitori di batteri che causano la gonorrea. Il tipo di bioautografia impiegato per lo screening composti vegetali antimicrobici dipende da molti fattori, tra cui il microrganismo prova, il setup di laboratorio, e le preferenze della pers...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lastre TLC F254, con retro in alluminio, spessore 0,2 mm, 20 cm x 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	Queste piastre sono rivestite con silice che contiene un indicatore fluorescente a 254 nm. I composti che assorbono a quella lunghezza d'onda appaiono scuri su uno sfondo verde fluorescente. Le fonti alternative includono Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Potrebbero essere necessari adsorbenti diversi dalla silice. Le piastre con supporto in plastica possono essere adatte, a seconda dei solventi da utilizzare.
Forbici affilate e resistenti	qualsiasi azienda di forniture per cucire	simile a Fiskars 175800-1002	Per il taglio di lastre TLC. È possibile utilizzare anche un tagliacarte con una lama affilata. Non inalare la polvere di silice.
Forno di essiccazione a 100 gradi C (convezione meccanica)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC camera	Kimble Chase	416180-0000	Fonti alternative:  Aldrich. I bicchieri in pyrex o i barattoli per conserve possono essere utilizzati per piccoli piatti (ad esempio 5 cm x 10 cm).  Coprire con un foglio di alluminio (i coperchi dei barattoli possono contenere materiale estraibile dai vapori di solvente).
50 µ l Siringa con punta piatta dell'ago	Hamilton	80965	Per il caricamento di quantità di standard o campione superiori a 5-10 µl.  Le fonti alternative sono equivalenti.
Micropipette	Drummond	2-000-001	Per il caricamento di piccole quantità di standard o campioni. Fonti alternative:  VWR.  Inoltre, le pipette Pasteur possono essere allungate a un diametro più sottile con una torcia a butano.
Carta da filtro (grado #1)	Whatman	1001 917	Funge da stoppino da camera. Altri tipi di carta da filtro sono OK. Questa dimensione può essere tagliata per le camere che contengono piastre da 20 cm x 20 cm.
Pinze per becher	Fisher Scientific	15-186	Per inserire e estrarre le piastre da una grande camera TLC. Fonti alternative: VWR
Pinze a lama piatta	Fisher Scientific	10-275	Per inserire e sfilare le piastre da una piccola camera. Fonti alternative: VWR
Piccola lampada UV portatile con lampadine da 4 W o 6 W per illuminazione a luce UV a onde corte e lunghe (254 e 365 nm, rispettivamente)	Ultraviolet Products	95-0271-01	Fonti alternative: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Visore per l'uso con lampada UV portatile	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	Le bande attive ai raggi UV sono più facilmente cerchiate se le piastre possono essere inserite qui. Fonti alternative: Spectronics Corporation.
Sistema di fotodocumentazione con lampada UV a soffitto e lampada a vista	Kodak	Gel Logic 200	Fonti alternative: Prodotti ultravioletti (www.uvp.com).  Vedi il protocollo per l'alternativa fatta in casa.
Camera anaerobica, tipo A, vinile	Coy	7150000	Questa camera è adatta per batteri anaerobi, come Clostridium sticklandii, come descritto. Tuttavia, le condizioni di crescita devono essere adattate all'organismo utilizzato nel test. Se si utilizzano organismi patogeni, è necessario adottare una cabina di biosicurezza e altre precauzioni. Fonti alternative: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, altri
Tetrazolio rosso	Sigma-Aldrich	T8877	Fonti alternative: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Per questo e per tutti gli altri reagenti in questa tabella, le fonti alternative sono equivalenti.
Riboflavina	Sigma-Aldrich	R4500
Tiamina HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376
Calcio D-Pantotenato	Sigma-Aldrich	C8731
Acido lipoico	Sigma-Aldrich	T5625
acido p-aminobenzoico	Sigma-Aldrich	A9878
Acido folico	Sigma-Aldrich	F8798
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamina	Sigma-Aldrich	C3607
Piridossale HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Piridossina	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Solfato di ferro · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Solfato di zinco · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Cloruro di manganese · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768
Cloruro di cobalto · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Cloruro di rame · 2H2O	Sigma-Aldrich
Cloruro di nichel · 6H2O	Sigma-Aldrich	203866
Molibdato di sodio · 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Tripticasi (digestato pancreatico della caseina)	Thermo Fisher	B11921
Fosfato di potassio monobasico anidro	Thermo Fisher	P284
Carbonato di sodio · H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Solfato di magnesio · 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Cloruro di calcio · 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Cisteina HCl	Thermo Fisher	19464780
Potassio fosfato bibasico anidro	Thermo Fisher	P290
Cloruro di sodio	Thermo Fisher	BP358