La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Summary

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

Abstract

Etichettatura isotopi stabili di peptidi di dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un metodo per quantificare con precisione le differenze di espressione proteica tra campioni utilizzando la spettrometria di massa. Etichettatura Redi viene eseguita utilizzando sia regolare (luce) o deuterati (pesanti) forme di formaldeide e sodio cianoboroidruro di aggiungere due gruppi metilici ad ogni ammina libera. Qui mostriamo un protocollo robusto per l'etichettatura Redi e comparazione quantitativa di miscele di proteine ​​complesse. Campioni di proteine ​​di confronto vengono digeriti in peptidi, etichettati a portare luce o tag metilici pesanti, mescolato, e co-analizzati mediante LC-MS/MS. Abbondanze relative di proteina sono quantificate confrontando le aree di picco di ioni cromatogramma delle versioni etichettate pesanti e leggeri del peptide costituente estratto dalla piena MS spettri. Il metodo qui descritto comprende la preparazione del campione mediante estrazione in fase solida in fase inversa, etichettatura Redi on-column di peptidi, peptide frazionamento da pH rev basefase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip depurazione peptide. Discutiamo vantaggi ei limiti di etichettatura Redi rispetto ad altri metodi per isotopi stabili incorporazione. Evidenziamo nuove applicazioni utilizzando etichettatura Redi come un metodo rapido, economico e preciso per confrontare le abbondanze di proteine ​​in quasi ogni tipo di campione.

Introduction

Misurare differenze di concentrazione di molte proteine ​​tra i campioni complessi è una sfida centrale in proteomica. Sempre più spesso, questo viene fatto etichettando le proteine ​​in ogni campione con diversi tag isotopiche, mescolando i campioni, e l'utilizzo di spettrometria di massa per quantificare le differenze di concentrazione. Esistono diversi metodi per l'etichettatura isotopica stabile di proteine ​​e peptidi. ¹⁵ N etichettatura ¹ e ² SILAC introdurre etichette isotopiche metabolicamente in vivo, che iCAT ^3, iTRAQ ^4, e la riduzione dimethylation ⁵ aggiungere tag isotopi s....

Protocol

NOTA: Questo metodo è stato descritto in precedenza ^12.

1. Proteina Isolamento

Preparare 1 mg di proteina cellulare da parte delle cellule di lisi, preferibilmente con metodi fisici come stampa francese, perlina percosse, o ultrasuoni. Evitare di lisozima-lisi cellulare mediata perché l'enzima si confondono misure di spettrometria di massa.

2. TCA precipitazione delle proteine

Aggiungere acido tricloroacetico 1 volume (TCA) a 4 volumi di proteine ​​e freddo in ghiaccio per 10 minuti per precipitare le proteine. Centrifugare a 12.000 xg per 5 ....

Results

Abbiamo valutato l'accuratezza, la precisione e riproducibilità di etichettatura Redi utilizzando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisati cellulari interi. In primo luogo abbiamo quantificato l'efficienza etichettatura Redi di un mix di C. phytofermentans lisati proteici da cellulosa (pesante etichetta, H) e glucosio (etichetta luce, L) culture. Quando filtrato per un peptide tasso di scoperta di falsi 1%, questo campione conteneva 11.194 sequenze peptidiche unici con una.......

Discussion

Numerosi punti fanno etichettatura isotopo stabile di peptidi utilizzando un metodo interessante per la proteomica quantitativa dimethylation riduttiva (etichettatura Redi): reagenti poco costosi di etichettatura (reagenti costano meno di $ 1 per esempio), velocità di reazione rapida (~ 10 min), assenza di prodotti collaterali, alte riproducibilità (figure 3, 4), prodotti di reazione stabili, capacità di utilizzare qualsiasi proteasi e ad alta efficienza di ionizzazione dei peptidi marcati. Etichettatur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido tricloroacetico	Sigma-Aldrich	T9159	precipitazione proteica
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	precipitazione proteica
Sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	71736	denatura, ridurre la proteina
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S8045	denaturare, ridurre la proteina
DL-Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	43816	denaturare, ridurre, alchilare la proteina
Inibitore della proteasi Mini Cocktail completo	Roche	4693124001	denaturare, ridurre la proteina
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	proteina alchilata
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	risospensione, estratto, etichettare la
proteina Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C5670	risospendere la proteina
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	digestione delle proteine
Tripsina di grado sequenziale	Promega	V5111	digestione delle proteine
Acido acetico	Sigma-Aldrich	320099	digestione delle proteine
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	299537	Estrazione di peptidi in fase inversa
tC18 Sep-Pak C18 cartucce	Waters	WAT054960	Estrazione di peptidi in fase inversa
Collettore di estrazione	Acque	WAT200609	Estrazione di peptidi in fase inversa
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	vari
Formaldeide	Sigma-Aldrich	252549	" luce" marcatura di peptidi
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	" luce" Etichettatura dei peptidi
Formaldeide deuterata	Sigma-Aldrich	492620	" pesante" marcatura di peptidi
Isotopi CDN	cianoborodeuteruro di sodio	D-1797	" pesante" marcatura di peptidi
MES	Sigma-Aldrich	M3671	marcatura di peptidi
colonna C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 &; m granulometria)	Agilent	770450-902	cromatografia a fase inversa pH basico
Acido formico	Sigma-Aldrich	399388	vari
dischi Empino C18	3M	14-386-3	Suggerimenti per la fase
Methanol	Sigma-Aldrich 494437		punte STAGE