Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Sommario

Targeting cellule cerebrali residente per discendenza diretta-riprogrammazione offre nuove prospettive per la riparazione del cervello. Qui si descrive un protocollo di come preparare le culture arricchito da pericytes cervello residente da adulto corteccia cerebrale umana e convertirli in neuroni indotti dall'espressione retrovirus-mediata dei fattori di trascrizione Sox2 e Ascl1.

Abstract

Diretto lignaggio riprogrammazione di cellule non neuronali nei neuroni indotti (INS) può fornire approfondimenti sui meccanismi molecolari alla base neurogenesi e attivare nuove strategie per la modellazione in vitro o la riparazione del cervello malato. Identificazione dei tipi di cellule non neuronali cerebrali residente suscettibili di conversione diretta in Ins potrebbe consentire per il lancio di un tale approccio in situ, cioè all'interno del tessuto cerebrale danneggiato. Qui si descrive un protocollo sviluppato nel tentativo di identificare cellule derivate dal cervello umano adulto che soddisfano questa premessa. Questo protocollo prevede: (1) la coltura di cellule umane dalla corteccia cerebrale ottenuto da biopsie cerebrali adulte umane; (2) l'espansione in vitro (approssimativamente richiede 2-4 settimane) e caratterizzazione di coltura mediante immunocitochimica e citofluorimetria; (3) l'arricchimento da cellule fluorescenza-attivato (FACS) usando anti-recettore PDGF-β e anticorpi anti-CD146;(4) il retrovirus trasduzione mediata con la trascrizione neurogenica fattori Sox2 e ascl1; (5) e, infine, la caratterizzazione della risultante neuroni indotti periciti-derivato (PdiNs) mediante immunocitochimica (14 giorni a 8 settimane dopo trasduzione retrovirale). In questa fase, in possono essere sondato per le loro proprietà elettriche mediante registrazione patch-clamp. Questo protocollo prevede una procedura altamente riproducibile per la conversione in vitro stirpe di pericytes cervello residente in Ins umane funzionali.

Introduzione

Al contrario di riprogrammazione di cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che a loro volta sono dotati di una pletora di potenziali di differenziazione, riprogrammare diretto mira per conversione diretta di uno specifico tipo cellulare in un altro. Per quanto riguarda la loro applicazione nel contesto della modellazione malattie e potenziali terapie a base di cellule, entrambi gli approcci di riprogrammazione hanno vantaggi e svantaggi specifici. Riprogrammazione in iPSCs (i) fornisce una fonte pressoché infinita di cellule; (Ii) consente di ingegneria genetica; (Iii) conferisce con un potenziale di differenziazione quasi illimitate. Tuttavia, principali svantaggi di iPSCs comportano il rischio di tumorigenicità delle cellule indifferenziate (formazione teratoma in vivo) e la necessità di coltura ex vivo e successivo trapianto se queste cellule devono essere utilizzati per terapie cellulari. Viceversa, diretto lignaggio riprogrammazione è limitata dalla minore resa delle cellule desiderateche correla direttamente con il numero di cellule bersaglio della popolazione di partenza, ma possiede il vantaggio che cellule della linea-riprogrammato sembrano mostrare alcun rischio oncogeno dopo trapianto ^1,2; Inoltre, riprogrammazione diretta può anche essere realizzato in situ, cioè all'interno dell'organo dove sarebbero necessarie queste cellule, evitando così la necessità di trapianto.

Con questo in mente, il nostro laboratorio ha perseguito la possibilità delle cellule cerebrali residente-lignaggio riprogrammazione in Ins come un nuovo approccio verso terapie cellulari delle malattie neurodegenerative. Le cellule cerebrali residente che possono essere potenzialmente considerati bersagli cellulari per lignaggio riprogrammazione comprendono diversi tipi di macroglia (astrociti, cellule NG2 e oligodendrociti), microglia e cellule dei microvasi associate (cellule endoteliali e periciti). Abbiamo ampiamente studiato il potenziale riprogrammazione in vitro della astroglia del cor cerebraletex dei primi topi postnatale ^3-5. Alla ricerca di fonti di cellule simile adatti per lignaggio riprogrammazione diretta nel cervello umano adulto, abbiamo incontrato una popolazione di cellule che può essere riprogrammato con successo in Ins e caratteristiche espositive di periciti. Qui si descrive un protocollo di come raccogliere queste cellule adulte da biopsie del cervello umano, per espandere e arricchire queste cellule in vitro, e infine riprogrammare successo una frazione sostanziale di queste cellule espanse in vitro (nell'intervallo 25-30%) in Ins. Riprogrammazione può essere ottenuto mediante simultanea retrovirus-mediata co-espressione di due fattori di trascrizione, Sox2 e ascl1. Questi PdiNs sono stati trovati per acquisire la capacità di azione ripetitiva potenziale di cottura e servire bersagli sinaptici per altri neuroni che indicano la loro capacità di integrare nelle reti neurali. Il nostro protocollo prevede una procedura semplice per l'isolamento e lignaggio conversione di adulti pericytes cervello umano in Ins.

Protocollo

1. Isolamento e Coltura di cellule adulte cervello umano

Gli esperimenti che coinvolgono il tessuto umano devono essere eseguite in conformità a tutte le normative governative e istituzionali pertinenti riguardanti l'uso di materiale umano per scopi di ricerca. Il presente protocollo è stato sviluppato in conformità con l'approvazione da parte del comitato etico della Facoltà di Medicina della LMU di Monaco di Baviera e il consenso informato per iscritto da tutti i pazienti.

Questo protocollo di culture preparazione dell'adulto corteccia cerebrale umana è stata stabilita utilizzando campioni di pazienti di entrambi i sessi affetti da epilessia del lobo temporale o di altre lesioni profonde non traumatiche, non maligne. Il tessuto ottenuto dalla sala chirurgica composto esclusivamente il canale di accesso alla lesione cerebrale e quindi è considerato sano. La fascia d'età dei pazienti era di 19-70 anni.

1. Preparare mezzo di crescita aggiungendo siero di vitello fetale inattivato al calore(FCS) ad alto glucosio DMEM con GlutaMAX per ottenere una concentrazione finale di 20% FCS. Aggiungere 5 ml di penicillina / streptomicina per un totale di 500 ml mezzo di crescita. Eseguire questa e di tutte le fasi successive che richiedono condizioni di coltura sterile in una cappa a flusso laminare adeguata.
2. Mantenere la biopsia del cervello umano adulto ottenuto dalla sala operatoria in soluzione salina bilanciata Hanks 'con CaCl ₂ e MgCl ₂ (HBSS) medio compreso HEPES (10 mM concentrazione finale) sul ghiaccio fino al trattamento. Avviare l'elaborazione il più presto possibile.
3. Per avviare la dissociazione in celle singole, trasferire il tessuto in una capsula di Petri 65 millimetri e tritare a pezzetti utilizzando due sterili monouso bisturi. Per digestione enzimatica usare 3-6 ml TrypLE in un tubo da 15 ml ed incubare per 15-30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua.
4. Aggiungere 1 volume di mezzo di crescita preriscaldato ad agevolare dissociazione e triturare lentamente la soluzione contenente pezzi di tessuto su e giù utilizzando primauna pipetta monouso 5 ml, seguita utilizzando una pipetta Pasteur di vetro fino omogeneizzazione della sospensione cellulare. Tipicamente, alcuni pezzi di tessuto residui, per lo più costituiti da materia bianca, rimarranno in sospensione.
5. Centrifugare a 157 xg per 5 min e risospendere il pellet in quantità appropriata di mezzo di crescita (10 ml per non rivestito pallone di coltura T75). Utilizzare un pallone di coltura T75 per una biopsia di 5-10 mm di diametro dimensioni e estrapolare da questo nel caso di campioni più grandi.
6. Posizionare cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ e 5% O _2.
7. Sostituire metà del mezzo ogni 3-4 giorni finché le cellule hanno raggiunto la confluenza. Questo richiede di solito fino a due settimane (di seguito il passaggio 0 [P0]).

2. Espansione in vitro e caratterizzazione di cellule cervello umano adulto

1. Espansione in vitro:
   1. Aspirare il terreno di coltura e lavare con tampone fosfato salino (PBS), conservato a temperatura ambiente temperatura, prima di aggiungere 3 ml TrypLE.
   2. Incubare a 37 ° C per 5-10 minuti finché la maggior parte delle cellule staccate. Battere delicatamente i palloni per facilitare il sollevamento delle cellule; dopo l'aggiunta di 3 volumi di mezzo di crescita, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 157 xg per 5 min e risospendere le cellule in quantità appropriata di terreno di crescita.
   3. Passaggio le celle in un rapporto di 1:3 per la resa ottimale in nuove fiasche di coltura cellulare T75.
      Nota: Abbiamo diversi passaggi queste cellule fino a P5, senza alcun segno di ridotta efficienza riprogrammazione. Mentre a P0 la coltura contiene una considerevole frazione di cellule endoteliali (valutata mediante espressione CD34), a passaggi successivi il loro numero diventa trascurabile.
2. Caratterizzazione delle culture cervello umano adulto:
   1. Immunocytochemistry:
      1. Per la caratterizzazione delle cellule, seme ~ 60.000 cellule su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in 500 microlitri fresca Mediu crescitam in 24 pozzetti piastre di coltura tissutale e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ e 5% O _2.
      2. Per l'analisi immunocitochimica delle cellule coltivate cervello umano rimuovere il supporto e lavare 3x con 1 ml di PBS.
      3. Fix cellule aggiungendo 500 ml di paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
      4. Trasferire la copertura in vetro scivola in un apposito camera di colorazione umidificata e bloccare con 80 microlitri di PBS contenente il 3% di albumina di siero bovino (BSA) e 0,5% Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente.
      5. Aggiungere anticorpi primari diluiti nella stessa soluzione (per fattori di diluizione vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche) e incubare una notte a 4 ° C o 1 ora a temperatura ambiente.
         Nota: Una frazione sostanziale ma variabile delle cellule in questa fase della coltura sono immunoreattivi per β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ), cluster di differenziazione 146 (CD146), NG2 condroitin solfato proteoglicani, e actina muscolo liscio (SMA), vale a dire i marcatori caratteristici pericytes microvasali associati. Solo una minoranza (<1%) esprimono il marker gliale fibrillare astrogliali proteina acida (GFAP) e S100β. Inoltre, in questa fase la coltura deve essere privo di cellule che esprimono il marcatore neuronale βIII-tubulina. Utilizzare più combinazioni di anticorpi primario per co-etichettatura dei diversi marcatori. Un'ulteriore conferma dell'espressione di gliali, neuronali, endoteliali e periciti marcatori può essere ottenuto mediante trascrizione inversa e tempo reale PCR quantitativa (non descritto in questo protocollo).
      6. Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario lavata tre volte con 1 ml di PBS e aggiungere i corrispondenti anticorpi secondari (nelle opportune diluizioni) alla soluzione colorante e incubare 1 ora a temperatura ambiente al buio. Lavare le cellule 3 volte con PBS. Se necessario, prima del montaggio includono colorazione con DAPI per 5 min a temperatura ambientetemperatura.
      7. Utilizzare antifading mezzo di montaggio e analizzare i vetrini coprioggetto utilizzando un microscopio a epifluorescenza o un microscopio confocale.
   2. Citometria a flusso:
      1. Per l'analisi di espressione marcatore di superficie con citometria a flusso, crescere le cellule a confluenza in T25 non rivestito o T75 fiasche di coltura cellulare.
      2. Staccare celle utilizzando TrypLE come descritto prima e risospendere in soluzione colorante costituito da PBS + 0,5% BSA. Per reazione a colorazione, risospendere 100.000-200.000 cellule in 100 ml di soluzione colorante. Preparare le reazioni di colorazione singoli per anticorpi utilizzati (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, rispettivi anticorpi di controllo isotipo).
      3. Aggiungere anticorpi coniugati con fluorocromi per ogni soluzione colorante (per diluizioni vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche) direttamente nella sospensione cellulare e incubare a 4 ° C per 30 minuti al buio.
      4. Lavare le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS e spin giù tra ognifase di lavaggio a 157 xg per 5 min.
      5. Risospendere il pellet di cellule in 0,5-1 ml di soluzione di colorazione e le cellule di trasferimento attraverso un colino cella (70 micron) per tubi FACS. Proteggere il campione dall'esposizione alla luce.
      6. Campioni Vortex prima di metterli in strumento FACS.
      7. Per analizzare le cellule viventi ed escludere detriti e di cella aggregati, cancello per FSC-A e SSC-A. Duine cellulari sono specificamente gated da FSC-A e FSC-W. Per determinare le condizioni gating giuste per i marcatori di superficie cellulare impostare le porte con il controllo isotipo-abbinato coniugato al rispettivo fluorocromo. Quindi determinare la proporzione di cellule anticorpo-bound.

3. Arricchimento per le celle pericyte-derivate da cellule Fluorescence Activated Ordinamento

1. Purificare la popolazione di cellule periciti (risospese in terreno di crescita) prima trasduzione tramite FACS classificare usando un ugello di 70 micron. Utilizzare CD34-APC in combinazione con la CD140b-PE e CD146-FITC per selezionare per pericytes. Ordina per, cellule CD140b-e CD146-CD34 positivi-negativi.
2. Raccogliere le cellule filtrate in mezzo di crescita e piastra su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ e 5% O _2.
3. 48 ore dopo l'ordinamento sostituire il supporto con mezzo di crescita fresco ed eseguono trasduzione come descritto nel protocollo 4.

4. Retrovirale trasduzione delle cellule pericyte-derivati ​​e Riprogrammazione in neuroni indotti

Nota: Fare riferimento alle linee guida di biosicurezza locali durante la manipolazione di particelle retrovirali. In Germania l'uso dei retrovirus impiegati qui richiede livello di biosicurezza 2. Per la produzione di particelle retrovirali riferimento al protocollo ^6. Per costrutti retrovirali usati per la riprogrammazione, fare riferimento a Karow et al. (2012). I retrovirus sono stati pseudotyped con VSV-G (stomatite vescicolare virus-glicoproteina) ^5. Per la produzione di consultare Gavrilescu et al ^6.

1. 24 ore prima della trasduzione retrovirale seme ~ 60.000 cellule su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in 500 microlitri terreno di coltura fresco in piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ e 5% O ₂ .
2. Il giorno seguente, sostituire il mezzo di crescita con 500 microlitri fresco mezzo di crescita preriscaldata, e aggiungere 1 ml di rispettivi surnatanti concentrati contenenti particelle retrovirali (pCAG-IRES-DsRed per il controllo, specialmente durante stabilisce il protocollo in laboratorio), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
3. Un giorno dopo, rimuovere il mezzo comprese le particelle virali dalle cellule e aggiunge 1 ml freschi, preriscaldata medio B27-differenziazione, composto da 49 ml DMEM con elevato glucosio GlutaMAX e 1 ml integratore privo di siero B27. Mantenere le cellule in coltura a 37 ° C in 5% CO ₂ e 5% O ₂ per 4-8 settimane senza cambiare il mezzo come variazioni medie ripetitive diventano dannose come INS maturare.

5. Caratterizzazione dei neuroni indotta da Immunocytochemistry

1. Per determinare l'identità cellulare delle cellule trasdotte, in particolare per dimostrare l'acquisizione di un fenotipo neuronale, effettuare immunocitochimica contro antigeni neuronali come bIII-tubulina, MAP2, e NeuN (per gli anticorpi e le loro rispettive diluizioni, vedere tabella di reagenti specifici e attrezzature; seguire la stessa procedura indicata al punto 2.2.1).
2. Per migliorare la maturazione di PdiNs, co-coltura queste cellule con neuroni derivati ​​da E14 topo cortecce cerebrali. A tal fine, sezionare la corteccia cerebrale e dissociare il tessuto meccanicamente con una pipetta Pasteur di vetro lucidati a fuoco. Aggiungi 10,000-50,000 neuroni murini di colture di cellule pericyte derivate da 2-3 settimane dopo trasduzione con re-Sox2 e ascl1 di codificatroviruses e continuare la coltura. Cellule trasdotte possono essere distinte dai neuroni murini per la loro reporter (GFP e DsRed) espressione, sia per epifluorescenza dal vivo o in seguito immunocitochimica per la GFP e DsRed.
3. Per valutare la formazione di sinapsi su PdiNs di neuroni murini, eseguire immunocitochimica contro recettori per i neurotrasmettitori vescicolari come vescicolare del glutammato trasportatore 1 (VGLUT1).
4. Sonda cellule trasdotte per le loro proprietà elettriche (cioè la capacità di generare potenziali d'azione) e la creazione di sinapsi funzionali da patch-clamp elettrofisiologia. Per i dettagli della procedura vedi Heinrich et al. (2011).

Risultati

Il primo risultato di questo protocollo dopo aver stabilito con successo una cultura da un esemplare di umano adulto corteccia cerebrale consiste nell'identificazione della composizione cellulare della cultura. Immunocitochimica di proteine ​​specifiche di tipo cellulare rivela un notevole grado di eterogeneità tra culture derivati ​​da esemplari di diversi pazienti (Figura 1A). Quantificata mediante citometria di flusso vi è sempre una frazione sostanziale di cellule che esprimono PDGFRβ (in media ...

Discussione

Il presente protocollo descrive l'espansione in vitro e l'arricchimento di cellule pericyte-derivate a seguito isolamento dal adulta corteccia cerebrale umana e la successiva conversione in Ins dall'espressione retrovirus-mediata della trascrizione neurogena fattori Sox2 e Ascl1. Tale protocollo prevede un sistema sperimentale in vitro per studiare la stirpe di conversione delle cellule cerebrali residente in neuroni e potenzialmente anche glia, con l'obiettivo in mente di tradurre in u...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anti-CD140b-PE	BD Biosciences	558821	uso 1:100
anti-CD146-FITC	AbD Serotec	MCA2141FT	uso 1:100
anti-CD13-FITC	AbD Serotec	MVA1270A488T	uso 1:100
anti-CD34-APC	BD Biosciences	560940	uso 1:100
anti-PDGFRβ	Cell Signaling	3169S	uso 1:200
anti-CD146	Abcam	Ab75769	uso 1:400
anti-NG2	Millipore	AB5320	uso 1:400
anti-SMA	Sigma-Aldrich	A2547	uso 1:400
anti-β III-tubulina	Sigma-Aldrich	T8660	uso 1:400
anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M4403	uso 1:200
anti-GFAP	Sigma-Aldrich	G3893	uso 1:600
anti-GFP	Aves Labs	GFP 10-20	uso 1:1.000
anti-RFP	Chromotek	5F8	uso 1:500
anti-S100β	Sigma-Aldrich	S2532	uso 1:300
anti-NeuN	Millipore	MAB377	uso 1:200
anti-GABA	Sigma-Aldrich	A2052	uso 1:500
anti-Calretinina	Millipore	AB5054	uso 1:500
anti-vGluT1	SYnaptic SYstems	135511	uso 1:1.000
Controllo dell'isotipo di Rat IgG1 FITC	AbD Serotec	11-4301-81	uso 1:100
Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto PE	AbD Serotec	12-4301-81	uso 1:100
Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto APC	AbD Serotec	17-4301-81	uso 1:100
TrypLE	Invitrogen	12605-010
DMEM, glucosio alto, GlutaMAX	Invitrogen	61965
B27 integratore senza siero	Invitrogen
siero fetale di vitello	Invitrogen	10106-169	esegue l'inattivazione del calore mediante incubazione a 56 ° C per 30 min
Penicillina-streptomicina	Invitrogen	15140122
HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks)	Invitrogen	24020-091
PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)	Invitrogen	14190
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Poli-D-lisina bromidrato (PDL)	Sigma-Aldrich	P0899
PFA (paraformaldeide)	Sigma-Aldrich	P1648
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A9418
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenilindolo) dilattato	Sigma-Aldrich	042M4005
Aqua-Poly/ Monta	Polysciences	18606-20
Tubi a fondo tondo in polipropilene	BD Biosciences	352063
Tubi in polistirene a fondo tondo con tappo a filtro cellulare.	BD Biosciences	352235
Piastre a 24 pozzetti	Orange Scientific	5530305
Flaconi per coltura da 75 cm2	Greiner Bio-One	658175
Flaconi per coltura da 25 cm2	Greiner Bio-One	690175
Pipette monouso 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Glass Pasteur pipette (150 mm)	Fisherbrand	FB50251
Vetrini coprioggetti diametro 12 mm	Menzel	CB00120RA1
Bisturi chirurgici monouso	B. Braun	5518083
Piastre per coltura tissutale	Greiner Bio-One	633180
Provette coniche 15 ml	BD Biosciences	352095
			flusso laminare
Centrifuga e rotore oscillante con adattatori per provette da 15 ml e 50 ml	Hettich Lab Technology	1406
Selezionatore di cellule per citometria a flusso: FACSAria l con software FACSDiva	BD Biosciences Incubatore
per colture cellulari umificate	Eppendorf Galaxy 170R
Bagno d'acqua a 37 ° C
FACSFirto della guaina del fluido	BD Biosciences	342003
Microscopio a epifluorescenza BX61	Microscopio confocale Olympus
LSM710	Zeiss

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