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Articolo metodologico

Imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri

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⸱

DOI:

10.3791/51461

⸱

20 maggio 2014

 ,  , 
1Chemical and Biomolecular Engineering Department, University of Houston

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La microscopia confocale viene utilizzato per immagini miscele colloide-polimero quiescenti e fluenti, che vengono studiati come sistemi modello per sospensioni interessanti. Algoritmi di analisi dell'immagine sono utilizzati per calcolare le metriche strutturali e dinamici per le particelle colloidali che misurano le variazioni dovute al confino geometrica.

Abstract

Il comportamento di sospensioni colloidali confinati con interazioni interparticellari attraenti è fondamentale per il disegno razionale di materiali per il montaggio diretto 1-3, drug delivery 4, 5-7 migliorato recupero di idrocarburi, e elettrodi fluidi di immagazzinamento 8. Sospensioni contenenti colloidi fluorescenti e polimeri non adsorbenti sono interessanti sistemi modello, come il rapporto tra il raggio di girazione polimero al raggio delle particelle e la concentrazione del controllo polimero rispettivamente l'intervallo e la forza di attrazione interparticellare,. Sintonizzando le proprietà del polimero e la frazione volumetrica dei colloidi, fluidi colloidali, fluidi di cluster, gel, cristalli e vetri possono essere ottenuti 9. Microscopia confocale, una variante di microscopia a fluorescenza, permette un campione otticamente trasparente e fluorescente da acquisire con elevata risoluzione spaziale e temporale in tre dimensioni. In questa tecnica, un piccolo foro o fessura blocca la luce fluorescente emessa dalle regioni del campione che sono al di fuori del volume focale del sistema ottico del microscopio. Di conseguenza, solo una sezione sottile del campione nel piano focale viene esposta. Questa tecnica è particolarmente adatta per sondare la struttura e la dinamica in sospensioni colloidali dense a scala singola particella: le particelle sono abbastanza grandi da essere risolto utilizzando luce visibile e diffondono abbastanza lentamente da catturare a velocità di scansione tipiche dei sistemi confocali commerciali 10 . Miglioramenti nella velocità di scansione e algoritmi di analisi hanno inoltre consentito confocale imaging quantitativo di sospensioni fluide 11-16,37. In questo lavoro, dimostriamo esperimenti di microscopia confocale per sondare il comportamento di fase confinata e fluidità di miscele colloide-polimero. Per prima cosa prepariamo collmiscele oid-polimero che sono densità e indice di rifrazione abbinati. Poi, riportiamo un protocollo standard per l'imaging miscele colloide-polimero densi quiescenti sotto diversi confinamento nelle cellule a forma di cuneo sottili. Infine, dimostriamo un protocollo per l'imaging miscele colloide-polimero durante il flusso microcanali.

Introduzione

Questo documento dimostra (a) confocale di miscele colloide-polimero quiescenti e fluenti confinati in due e tre dimensioni e (b) particelle di monitoraggio e correlazione analisi delle immagini risultanti per ottenere informazioni quantitative sul comportamento di fase e proprietà di flusso.

Sospensioni colloidali con interazioni interparticellari interessanti appaiono ubiquitariamente in applicazioni tecnologiche come materiali per il montaggio diretto 1-3, la consegna della droga 4, migliorato 5-7 il recupero di idrocarburi e stoccaggio di energia 8. Una caratteristica comune di queste applicazioni è che le particelle devono essere attraversati geometrie pregiati, quali ugelli, testine di stampa, microcanali o supporti porosi, e / o essere trasformati in film sottili o aste. Le tecniche utilizzate per sondare la struttura di colloidi micron di dimensioni in geometrie confinate, comprese microscopia elettronica 17,18, microscopia a raggi X 19, e diffrazione laser microscopy 20, può essere utilizzato per misurare la struttura e la dinamica di particelle su microscala. Queste tecniche, tuttavia, non consentono l'accesso alle traiettorie delle singole particelle, da cui metriche strutturali e dinamiche possono essere calcolati per confronto diretto simulazioni numeriche 21,22.

Microscopia confocale è una variante di microscopia a fluorescenza che permette l'imaging di sezioni sottili di un campione fluorescente. Per la scienza colloidale 10, questa tecnica è particolarmente utile per l'imaging in profondità all'interno sospensioni dense o in tre dimensioni. Algoritmi di Particle-tracking 23 applicati a due o serie temporali tridimensionale di micrografie confocali cedere le traiettorie di tutte le particelle visibili. Di conseguenza, la combinazione di microscopia confocale e particella-inseguimento è stato applicato per studiare il comportamento di fase, la struttura e la dinamica di sospensioni colloidali, compresi cristalli ordinati 24-27 e disturboed occhiali 28-31 e 32-35 gel.

Altri algoritmi di analisi dell'immagine possono essere applicati per misurare la dinamica delle particelle di serie temporali di micrografie confocale. Ad esempio, la dinamica delle particelle diffusiva possono essere studiati analizzando le fluttuazioni di intensità nel tempo utilizzando differenziale microscopia confocale dinamico 36. Quando gli spostamenti delle particelle sono più grandi della spaziatura interparticellare, immagine correlazione 37 basato su particelle immagine velocimetry 38-40 può essere applicato per misurare profili di velocità delle particelle. La combinazione di algoritmi di localizzazione e di correlazione ha permesso dinamiche colloidali da misurare nei sistemi sottoposti a lento e veloce il flusso 11-16,41-45.

Usiamo miscele colloide-polimero come modelli per interessanti sospensioni colloidali 9. In queste miscele, la copertura e il livello della interessante potenziale interparticellare sono controllati tramite il rapportodel raggio di girazione polimero al raggio delle particelle e la concentrazione del polimero e la repulsione elettrostatica è controllata tramite l'aggiunta di un sale organico monovalente 46. Poiché le interazioni interparticellari possono essere messi a punto, la solidificazione di queste miscele è stata ampiamente studiata con microscopia confocale 34,47-51.

Qui mostriamo confocale e analisi di immagine 37 di miscele colloide-polimero quiescenti e scorre, in cui la frazione di volume colloide è tenuta fissa a Φ = 0,15, che sonda l'effetto di contenimento sul comportamento di fase e proprietà di flusso di queste miscele. Queste tecniche sono ampiamente applicabili a sistemi particellari che sono indice di rifrazione-coincidenti ed in cui le particelle e / o solvente possono essere marcate con un colorante fluorescente.

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Protocollo

1. Preparazione di miscele colloidali e polimeri

Nota: Questo protocollo utilizza poli (metilmetacrilato) (PMMA) particelle, stericamente stabilizzati usando poli (acido 12-idrossistearico) e marcato con un colorante fluorescente (come Nilo Rosso, rodamina B, o fluoresceina), che sono stati sintetizzato seguendo uno standard ricetta 52.

  1. Preparare un w / w miscela di cicloesil bromuro (CXB) e decaidronaftalene (DHN) come uno stock di solvente 3:1. Questa miscela corrisponde quasi la densità e l'indice di rifrazione delle particelle. Aggiungere un sale organico, cloruro di tetrabutilammonio (TBAC) 46, a solvente ad una concentrazione di 1,5 mM per schermare parzialmente le cariche sulle particelle.
  2. Per determinare con precisione la densità delle particelle, preparare una sospensione in frazione approssimativa volume di particelle Φ = 0,10 nel CXB: solvente DHN. Centrifugare la sospensione a 800 xg per 75 minuti e aggiungere CXB o DHN goccia a goccia per migliorare la galleggiabilitàcorrispondenza. In questi esperimenti, la densità delle particelle di PMMA è stata misurata da ρ = 1.223 g / ml.
  3. Preparare uno stock sospensione concentrata di particelle di PMMA (qui, Φ = 0,40) nel CXB: miscela di solventi DHN.
  4. Preparare una soluzione concentrata di polistirene lineare (PS) nel CXB: miscela di solventi DHN. Qui, una soluzione di PS di peso molecolare M w ≈ 3.000.000 (raggio di girazione r g = 15 nm) viene preparato in concentrazione c p ≈ 50 mg / ml.
  5. Mescolare pesi adatti della particella, polimero, e miscele di solventi archivi formulare sospensioni alle concentrazioni desiderate di particelle e polimeri.
    Nota: Qui, sospensioni di particelle monodisperse sono predisposti alla frazione di volume colloide costante Φ = 0,15 e concentrazione di polimero variabile nel volume libero 53 c p = 0,25 mg / ml, e bidispersed sospensioni contenenti due dimensioni di particelle colloidali, with ogni formato muniti di una etichetta fluorescente distinta, sono preparati a frazione volumetrica colloide fisso totale Φ = 0,15, rapporto frazione volumetrica di piccole particelle r = 0,50, e la concentrazione di polimero nel volume libero di 5 o 25 mg / ml.
  6. Dopo ogni sospensione è disposta, aggiungere CXB o DHN goccia a goccia e centrifugare i campioni a 800 xg per almeno 75 minuti per confermare che le particelle e cluster all'interno della sospensione rimangono galleggiabilità abbinato.
  7. Equilibrare tutti i campioni per almeno 24 ore prima di esperimenti di imaging.

. 2 Esperimenti campione quiescenti: Fase di Comportamento

  1. Per determinare il comportamento di fase bulk, fabbricare camere rettangolari da vetrini (Figura 1a). Per le miscele colloide polimeriche in questo studio, camere di spessore h = 1 mm (impostato dallo spessore di un vetrino da microscopio) danno comportamento rinfusa.
  2. Per accedere a più confini in un singolo esperimento microscopia, fabbricare sottile cuneocamere di forma, utilizzando un unico coprioggetto da distanziatore su un cuneo (Figura 1b). L'angolo della camera di apertura è <0,5 °, in modo che in un unico campo visivo le pareti sono quasi parallele. Una camera di rappresentante consente l'accesso a spessori di confinamento di h = 6> 100 micron.
  3. Costruire delle camere su una base coprioggetto per l'esposizione su un microscopio invertito e sigillare con resina epossidica UV, che non si scioglie nella miscela solvente CXB-DHN.
  4. Campioni di immagini utilizzando un microscopio confocale. Questo protocollo dimostra l'imaging confocale con una scansione lineare collegato ad un microscopio invertito dotato di una lente immersione in olio 100X di apertura numerica NA = 1,40.
  5. Eccitare i coloranti utilizzando una sorgente laser. Qui lunghezze d'onda λ = 491 o 561 nm sono usati per eccitare la fluoresceina e rodamina coloranti / Nilo Rossi, rispettivamente.
  6. Nel sistema punto-scansione, generare un'immagine mediante una rapida scansione del punto focale attraverso il campione (in x-y piano) utilizzando il software confocale. Una immagine bidimensionale di 512 pixel x 512 pixel, che coprono circa il 50 micron x 50 micron, possono essere acquisiti in 1/32 sec. Migliorare la qualità dell'immagine media più immagini o aumentando il tempo di acquisizione.
  7. Individuare il fondo della camera (z = 0), ad esempio concentrando sulle particelle attaccate al suo fondo. In questa configurazione, l'altezza (z) aumenta con l'aumentare fuoco nella camera.
  8. Come esempio, caratterizzare l'effetto di confinamento sulla dinamica delle particelle con l'acquisizione di una serie temporale 2-D di immagini (nel piano xy) al piano medio della camera. In un tipico esperimento, 500 immagini di dimensione 512 pixel x 512 pixel vengono acquisiti ad un frame rate di 1 frame / sec (tempo di spaziatura At = 1 sec).
  9. Come secondo esempio, caratterizzare la struttura 3-D di particelle acquisendo una serie tridimensionale di immagini (x, y, z). In un tipico esperimento, le immagini bidimensionali (512 pixel x 512 pixel) sonoacquisita in più posizioni z all'interno della camera, con un passo costante di Az = 0,2 micron tra immagini consecutive stabiliti da un piezo. Una pila di volume copre spessore h = 30 um contiene quindi 151 immagini.
  10. Individuare e particelle di pista nel corso del tempo in 2-D e 3-D utilizzando il software di particelle di monitoraggio scritto in IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, 60 o Python. Questi algoritmi permettono generalmente centri delle particelle da risolvere entro 40-50 nm. Particle tracking successo richiede che le particelle si muovono meno la spaziatura interparticellare tra fotogrammi consecutivi.
  11. Dalle posizioni delle particelle, calcolare le metriche strutturali e dinamiche. Tre metriche convenienti qui indicati sono la funzione paio di correlazione 3-D g (r) 61, lo spostamento 2-D quadratico medio (MSD) 58,62, e l'auto parte 2-D della funzione di correlazione van Hove G s ( x, t) 58. Gli ultimi due parametri possono essere calcolati anche in 3-D.

. 3 Esperimenti Flowing: proprietà di flusso

  1. Fabbricare una cella di flusso semplice mediante un microcapillare vetro con sezione quadrata (100 micron x 100 micron) che viene apposto al tubo in Teflon. Utilizzare vetrini per sostenere il capillare e fornire rigidità meccanica, come mostrato nello schema di figura 7.
  2. Caricare la miscela colloidale-polimero in una siringa di vetro. Attaccare la siringa pompa a siringa o un sistema di erogazione di fluido pneumatico.
  3. Montare la configurazione della cella di flusso sul microscopio invertito. Conservare la siringa, cella di flusso, e la presa alla stessa altezza per minimizzare l'effetto della gravità sul profilo di flusso.
  4. Controllare la portata della sospensione attraverso la cella di flusso dalla portata volumetrica (per la pompa a siringa) o la pressione applicata (per la casella pressione). La velocità media della sospensione nei microcanali dipende anche suformulazione spension. Valori tipici della velocità massima dei microcanali quadrati misurati qui sono 200-2.000 micron / sec.
  5. Durante il flusso, acquisire una serie temporale confocale 2-D a frame rate veloci. Qui, 500 immagini di dimensione 512 pixel x 512 pixel vengono acquisiti a 32 fotogrammi / sec (tempo spaziatura Δ t = 1/32 sec) a diverse altezze sopra il fondo della microcanali (z = 0 micron) vanno da z = 5 - 50 pm. Ogni immagine copre circa la metà della dimensione laterale (y) dei microcanali, come mostrato nel riquadro alla Figura 7. Se le particelle appaiono ellittica, aumentare il frame rate di acquisizione.
  6. Come negli esperimenti quiescenti, individuare le particelle in 2-D utilizzando algoritmi standard per la localizzazione e il monitoraggio di particelle in IDL e MATLAB. Per flussi lenti, in cui le particelle si muovono meno della distanza media tra i fotogrammi interparticellare, utilizzano algoritmi di monitoraggio avere le traiettorie.
  7. Utilizzare l'immagine correlazione calcUlate i profili di velocità per i flussi veloci.
    1. Suddividere l'immagine in immagini orizzontali di altezza costante (y) lungo la direzione del flusso (x). Per due immagini sequenziali I 1 (x, y) e 2 (x, y) spostare quest'ultima immagine di un fattore Ax e quindi calcolare il cross-covarianza tra I 1 (x, y) e 2 (x + Dx, y).
    2. Identificare la posizione picco dell'istogramma dei valori Ax che massimizzano il cross-covarianza tra ogni coppia di immagini per avere la velocità avvezione medio in ciascuna posizione laterale y. Se questa distribuzione non è fortemente raggiunto il picco, acquisire immagini ad un frame rate più veloce.

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Risultati

Per dimostrare confocale e particelle-tracking, abbiamo studiato l'effetto del confinamento sul comportamento di fase di miscele colloide-polimero 63-65. Per questi esperimenti il diametro colloide era 2 a = 0,865 micron. La frazione di volume colloide è fissato a Φ = 0,15 e la concentrazione del polimero c p è stata variata 0-23,6 mg / ml. Immagini confocali rappresentativi sono riportati nella Figura 2 63, colonna a sinistra. Dalle posizioni delle...

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Discussione

Sospensioni colloidali sono ampiamente studiati come modelli di comportamento di fase limitata, perché le particelle colloidali micron di dimensioni mostrano dinamiche notevolmente più lento di atomi e molecole e quindi possono essere facilmente esposte e monitorati nel tempo 10. Per questi studi fondamentali, capire l'effetto delle attrazioni interparticellari sul comportamento di fase confinata offre l'opportunità di esplorare fenomeni come la condensazione capillare ed evaporazione 21,22,67.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto da una Università di Houston Nuova Facoltà Grant, una sovvenzione seme dal Centro Texas per la superconduttività e la Petroleum Research Fund American Chemical Society (52537-DNI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bromuro di cicloesileSigma Aldrich135194Numero CAS: 108-85-0, Peso molecolare = 163,06, Utilizzato in magazzino solvente
DecaidronaftaleneSigma AldrichD251Numero CAS 91-17-8, Peso molecolare = 138,25, Utilizzato in magazzino solvente
Nile RedSigma Aldrich72485Colorante fluorescente
Fluoresceina 5(6)-isotiocianatoSigma AldrichF3651Colorante fluorescente
Rodamina BSigma Aldrich83689Colorante fluorescente
Diffusione dinamica della luce Brookhaven InstrumentsApparecchiature BI-APDDLS utilizzate per la misurazione della dimensione delle particelle
PolistireneVarian/AgilentPL20138-23Polistirene (polimero) per indurre l'attrazione per l'esaurimento
Tetrabutil(cloruro di ammonio) (TBAC)Sigma Aldrich86870sale monovalente
Adesivo UVAdesivo Norland NOA68TCodice 68T01 (adesivo polimerizzato UV)
VT EyeVisitechVT Scanner confocale per occhi
VT InfinityVisitechVT Microscopio scanner confocale
Infinity LeicaDMI3000BCentrifuga per microscopio invertito
Thermo ScientificSorvall ST 161-5.000 giri/min
Tubi in teflonpiccole partiSLTT 26-72Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0,016" ID x 0,003"
Wall Epoxy DevconDA051Siringa epossidica da 5 min
SiringaMicromate/Cadence5004con luer in metallo punta di blocco
Punte per siringhe Nordson701846232 GA 
Pompa a siringa Sistema di pompaggio New Era Inc.NE1002XPompa microfluidica programmabile (syringepump.com)
BilanciaMettler ToledoAB204-S0,0001-220 g
Particelle di PMMAParticelle colloidali sintetizzatepoli(metilmetacrilato)
, in vetro Punte di precisione in

Riferimenti

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