Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Time-lapse imaging di tessuto vivente fornisce l'accesso visivo dinamici relazioni struttura-funzione che non può essere apprezzato in preparazioni fissi o che vivono impressi in un unico punto nel tempo. Spesso, tuttavia, il compromesso per l'accesso alle informazioni temporali è una diminuzione della risoluzione ottica. Obiettivi ad immersione in olio ad alta apertura numerica sono impraticabili nel tessuto vivo a causa della loro ristretta gamma di messa a fuoco, lasciando immersione in acqua o obiettivi a secco come le uniche alternative. Inoltre, la maggiore risoluzione ottenibile con ottica confocale non può essere utilizzato in alcune preparazioni vivere a causa della fototossicità dai livelli relativamente alti di illuminazione richiesti ^1,2. Infine, mentre diverse real-time o time-lapse tecniche ottiche sono disponibili che offrono una maggiore risoluzione, la loro applicabilità è limitata a preparazioni in cui le strutture di interesse possono essere posizionati a poche centinaia di nanometri dell'obiettivo ^1. Il metodo descritto, a strumenti relativamente a basso costo, è versatile, ma offre una migliore risoluzione rispetto alle tecniche time lapse più comunemente usati. Esso è destinato all'uso nei laboratori individuali nonché strutture di imaging.

Il metodo utilizza epifluorescenza convenzionale, combinato con una fotocamera digitale sensibile e con hardware progettato per acquisire rapidamente gruppi di immagini a leggermente differenti piani focali (Z-stack). Ogni z-stack è digitalmente deconvolved per aumentare la risoluzione. Una caratteristica del 3D time-lapse (4D) imaging è tracciamento preciso di organelli o altre strutture in movimento. Se correttamente impostato, strutture impressi non vanno fuori fuoco, e il movimento in tutte e tre le direzioni possono essere osservati e quantificati. Così è impossibile per una struttura macchiato eliminata nell'arco di uno o più frame time lapse semplicemente alla deriva sopra o al di sotto di un piano focale stretta. Il metodo serve anche come strumento sensibile per valutare le interazioni e possibile fusione di piccole strutture. Epifluorescenza convenzionale o immagini confocali di strutture in prossimità del limite di diffrazione (a poche centinaia di nm) non confermano la fusione anche se le immagini mostrano unite sovrapposizione delle rispettive etichette ^3. Fusion è suggerito, ma rimane la possibilità che gli oggetti sono separati orizzontalmente o verticalmente da una distanza che è inferiore al limite di diffrazione. Tre o immagini quadridimensionale, al contrario, consente la visualizzazione degli oggetti in ciascuna delle tre direzioni ortogonali. L'aspetto della fusione in tutte e tre le viste aumenta il livello di certezza. E, in alcune preparazioni viventi, diretto o moto browniano di oggetti ipoteticamente fuse fornisce un'ulteriore prova quando entrambi i marchi si muovono insieme nel tempo. Naturalmente, quando in prossimità del limite di diffrazione il livello di certezza in strutture esigenti da sfondo, o mostrando che esse contengono due coloranti (fusione), non è assoluto. Se, tecniche specializzate, ad esempio la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET)^4, sono più appropriato.

1. Colorare la preparazione con sopravitale Coloranti

1. Per il protocollo dissezione serpente giarrettiera vedere Stewart et al. ⁵ e Teng et al. ⁶ tessuto Reptilian resta fisiologica per tempi più lunghi, e con meno contaminazione batterica, conservato a basse temperature (vedi sotto). Tessuti di mammiferi, di solito è mantenuta a temperatura ambiente o superiore.
2. Per lisosomiale colorante vitale colorazione, sciogliere il colorante in rettili freddi 1:5.000 soluzione Ringers (0,2 micron). Incubare a 4 ° C per 15 min. Lavare più volte con Ringers freddi. Immagine appena possibile.
3. Per FM1-43 colorazione utilizzando la stimolazione KCl, diluire il colorante in alto KCl Ringers 1:500 (7 micron). Incubare a 4 ° C per 30-60 sec massimo. Lavare rapidamente tre volte con Ringers fredde, ~ 1 min / risciacquo. Immagine appena possibile.
4. Per FM1-43 colorazione utilizzando la stimolazione ipertonica (saccarosio), diluire il colorante in 0,5 M Ringers saccarosio come sopra. Incubare a 4 & #176, C per 2-5 min. Lavare come al punto 1.3 con Ringers freddi. Immagine appena possibile.
5. Per FM1-43 colorazione tramite stimolazione elettrica, vedere Teng et al. ⁶ Brevemente, la preparazione è posto un recipiente contenente soluzione salina fisiologica e il colorante. Il nervo viene stimolato con un treno programmato di 200 msec impulsi rettangolari (~ 7 V, 30 Hz, 18 msec). Lavare come al punto 1.3 con Ringers freddi. Immagine appena possibile.

2. Configurare la preparazione di Imaging

1. Orientare la preparazione in modo che le strutture di interesse siano il più vicino possibile all'obiettivo microscopio.
2. Se viene utilizzato un microscopio invertito, utilizzare una camera il cui fondo contiene un sottile giro copertura di slittamento. Tipicamente, la camera di imaging dovrebbe avere un fondo sottile in acciaio inossidabile con un diametro # 1 vetro spessore copertura antiscivolo 25 mm a centro. Se viene utilizzato un microscopio verticale, un coprioggetto inferiore non è necessaria ma è utileper consentire di imaging con luce trasmessa (ad esempio il contrasto di interferenza differenziale, DIC) per orientare il campione e localizzare oggetti di interesse.
3. Scegliere un obiettivo appropriato per ottenere la massima risoluzione 3D possibile. Ci sono dei compromessi tra apertura numerica (na), distanza di funzionamento, l'ingrandimento e il tipo di lente (a secco, ad immersione in olio-acqua). Per i preparati sottili come colture di tessuti, gli obiettivi del petrolio sono i migliori. Utilizzando un microscopio verticale, mobile un vetrino sul bagno acquoso, e utilizzare olio per immersione tra la parte superiore del vetrino e l'obiettivo.
4. Se si utilizza il software di deconvoluzione, il venditore potrebbe fornire funzioni di punto di spread predeterminati (PSF) per determinati obiettivi. Se tale informazione è fornita, o se si sceglie un obiettivo non supportato determinare il PSF da imaging di micropunti fluorescenti o oggetti di diffrazione limitata analoghi ^7,8.

3. Stabilire la profondità di campo desiderata e numero di Images desiderati per Time-lapse con cornice

1. Selezionare la profondità totale del campo in modo che lo spostamento o interagendo strutture di interesse non scompaiono o andare fuori fuoco, come si muovono nella direzione z. La z-campo dovrebbe superare leggermente la dimensione verticale del processo cellulare o la cellula viene esposta. Per i terminali del motore vertebrati, 15-20 micron è tipico.
2. Calcolare il passo asse z necessaria per ogni incremento di messa a fuoco. Risoluzione lungo l'asse z varia a seconda proprietà del obiettivo; è circa un quarto della risoluzione piano xy. Se viene utilizzato sia confocale o software di deconvoluzione, risoluzione z è migliorata. Migliorare la risoluzione finale oversampling deliberata nella direzione z ^5, ma si veda anche passo 3.3. Un intervallo tipico passo è nell'intervallo da 400-1,500 nm per obiettivi 40-100X. Luce dovrebbe essere coperto off tra ogni immagine z-step.
3. Selezionare il numero di immagini per z-stack, cioè la profondità di campo desiderata divisodall'intervallo passo. Tempo per completare una tipica z-stack è 1-10 sec. Oggetti in rapido movimento (100 nm / sec) possono apparire sfocata in una pila di immagini 3D perché ogni piano dell'immagine corrisponde ad un punto temporale leggermente diverso. Inoltre, ogni immagine aggiuntiva contribuisce al photobleaching e fototossicità possibile (vedi discussione). Se una situazione riguarda, sceglierebbe una più grande z-passo per raccogliere un minor numero di immagini per stack. Compensare successivamente utilizzando il software di interpolazione dell'immagine (fase 6.3).

4. Selezionare il Frame Rate Time-lapse

Scegli sperimentazione un tasso che è appena sufficiente per risolvere agevolmente cambia con il tempo come il movimento, interazioni o eventi di fusione ^9. Sotto il campionamento può produrre artefatti da movimento (errori di campionamento), mentre sovracampionamento aumenta inutilmente l'esposizione alla luce. Raccogliere una singola sequenza lunga o più sequenze ripetute della stessa preparazione, ciascuno con un intervallo relativamente piccolo tempo totale (

5. Completa tutte le immagini dal vivo per una preparazione particolare

Preparazioni Rettiliani in genere rimangono robusto per ~ 1-2 ore, più a lungo se raffreddato.

6. Analizzare i dati in base all'uso desiderato

1. Conservare tutti i file di dati grezzi. Mentre memorizzazione digitale di solito non è un problema, tempo di elaborazione è significativo anche con personal computer o workstation veloci. Per questo motivo, ritagliare le immagini in una regione di interesse [ROI]. Assicurare che l'intera regione di interesse nella finestra ritagliata durante l'intero corso del tempo.
2. Deconvolve immagine pile utilizzando il software appropriato e la funzione di punto di diffusione corretta. Verificare che la risoluzione è migliorata e che nessun manufatto è stato generato dallaalgoritmo di deconvoluzione. Figura 3 mostra immagini di esempio.
3. Utilizzare un algoritmo di interpolazione per espandere z risoluzione apparente. Un'espansione 6X da un immagine reale di 1,5 micron piano di separazione di un apparente separazione 0,25 micron è suggerito. In alternativa, utilizzare una combinazione di sovracampionamento (punto 3.2) e l'interpolazione.
4. Eseguire il contrasto, la luminosità, il filtraggio del rumore, fotoscolorimento e altre regolazioni tipiche di elaborazione delle immagini, se lo desideri. Norme di manipolazione della fotografia impongono che per la maggior parte lavoro scientifico, è opportuno che le stesse correzioni da applicare a tutte le immagini, sia all'interno di uno stack e in diversi momenti. La conseguenza di una rettifica specifica dovrebbe essere valutata fra tutte le immagini ^9.
5. Selezionare una modalità di visualizzazione particolare per l'esportazione dei dati. Il display più semplice è video stereo utilizzando sia anaglifi rosso-verde o rosso-blu (esempi in figura 3), coppie stereo, o alternando sinistra / right occhio fotogrammi con occhiali. Anaglifi sono limitati a un solo colore. Migliorare la profondità dell'immagine evidente se lo si desidera migliorare z risoluzione visiva.
6. Esperimento con varie filtraggio e di immagine tecniche di miglioramento. Ad esempio, il filtro laplaciano è utile per aumentare il contrasto di piccole strutture sopra sfondo. La luminosità del pixel al centro di una finestra di esecuzione è migliorata mentre la luminosità delle zone circostanti è ridotto. Nota che alcuni metodi di filtraggio non funzionano bene in combinazione.
7. Applicare correzione della deriva se vi è sostanziale movimento della preparazione nel tempo. Tale movimento è comune nel muscolo vivente, anche con farmaci aggiunti per sopprimere potenziali d'azione e potenziali sinaptici. Un algoritmo di registrazione pixel (ad es. Imaris, Adobe AfterEffects, plug TurboReg per ImageJ) allinea le immagini time-lapse e può ridurre, ma di solito non eliminare completamente, tale movimento.

I dati riportati sono da terminali serpente neuromuscolari (vedi visite basse e alte ingrandimento nella figura 3, il colorante endocitica (FM1-43) assorbimento crea una nebbia che riempie ogni bouton) e, in particolare, macroendosomes (MES) e endosomi acidi (AES) all'interno di questi terminali 5. ME sono creati da endocitosi massa durante l'attività neuronale 10 e il loro numero declina esponenzialmente con il tempo dopo l'attività è cessata 6. L'uso di 4D imaging dal vivo era di determinare se ME muovono verso la membrana plasmatica e scomparire rapidamente, suggerendo che il loro numero diminuisce perché alcuni di loro esocitosi. Tutti questi ME erano presenti a un certo punto volta (e quelli prima) e completamente andati al successivo punto di tempo (e di quelli dopo). Così il tempo richiesto per la scomparsa era inferiore al nostro intervallo telaio (più corto 30 sec) e coerente con esocitosi. Una teoria alternativa, non avvalorati da dati 4D, è che ME lentamente dissipare tramite gemmazione di vesicles fino a che non svaniscono. Erba vescicola si verifica 6, ma almeno qualche ME sono exocytosed durante o dopo erba 5. Figura 1 e Movie S1 illustrano la scomparsa di un ME tra due fotogrammi time-lapse. ME destinati a svanire non cambiano forma o la luminosità su due o più fotogrammi (N = 16), che sarebbe stato coerente con la lenta dissipazione durante il periodo del film (che inizia diversi minuti dopo la stimolazione breve). ME scomparsa è stata osservata in precedenza in convenzionale time-lapse, ma era possibile che le strutture hanno semplicemente lasciato il piano di messa a fuoco. Inoltre, la visualizzazione da una varietà di prospettive (Movie S1) ha confermato che la scomparsa ME è stata improvvisa. Con convenzionale l'imaging dal vivo (guardando da un unico punto di vista, ad esempio, il piano immagine xy) la presenza di rumori limitano la capacità del ricercatore di confermare che una struttura è rimasta invariata. Tali manufatti sono spesso presentiin una vista, ma non altri.

Studi di microscopia elettronica hanno dimostrato che gli endosomi a morsetti del motore sono di piccole dimensioni, in prossimità del limite di diffrazione della luce 10. Quindi fusione di questi endosomi non può essere distinto assolutamente da stretta associazione territoriale a livello di luce. ME sono stati etichettati con FM1-43 (verde fluorescente) e AES con un colorante vitale lisosomiale (rosso fluorescente). Strutture che fluoresced in entrambi i colori (che appare giallo) sono state occasionalmente notato in 4D record di immagine. Utilizzando il software appropriato, viste queste endosomi doppio etichettati e quindi apparentemente fusi da una varietà di prospettiva sono stati generati per esaminare la coincidenza delle due etichette in voxel vicino e all'interno della struttura apparente. Figura 2 mostra un putativo fuso AE-ME come visto da tre direzioni ortogonali. Un punto di vista è il piano xy; le altre viste sono ortogonali a tale piano e tra di loro. Usando questo metodo si è constatato che voxelo sovrapposti, come in questo esempio, o che evidentemente non in uno o più piani di visualizzazione. Film S2 mostra lo stesso putativo fuso AE-ME presentato come un display di realtà virtuale interattivo (completamente ruotabile in 3 dimensioni).

Deconvoluzione digitale è uno strumento utile per migliorare la risoluzione di 3D e 4D immagini, sia convenzionali e microscopi confocali 11. Deconvoluzione numerica è un processo iterativo che compensa, in parte, per risoluzione spaziale limitata dell'obiettivo utilizzato. Questa risoluzione è caratterizzato come punto spread funzione del volume del obiettivo 3D occupata dall'immagine di un punto infinitesimale. In teoria, deconvoluzione ripristina l'immagine che deriverebbe se l'obiettivo fosse perfetto. Figura 3 è una vista volume 3D di due diverse serie di dati, ciascuna visualizzati come una coppia di anaglifi rosso-verde. Le immagini a destra mostrano tipica miglioramento della nitidezza dopo de digitaleconvoluzione della pila di immagini.

Figura 1. A macroendosome (ME) scompare dopo contatto apparente con la membrana plasmatica. Un serpente preparazione nervo-muscolo è stato stimolato elettricamente in presenza di FM1-43. I dati sono stati raccolti usando l'imaging 4D, come descritto in Metodi e vengono visualizzati come "viste volume 3D" in sei punti (60 intervallo sec) per illustrare la Z-profondità di un singolo bouton. Un ME possono essere osservati allontanandosi dalla Y (linea rossa tratteggiata) su più fotogrammi, prima di scomparire tra i punti di tempo 5 e 6. Poco prima scomparsa, ME sembra essere situato membrana plasmatica del bouton (delineato da FM1-43 vescicola colorazione o "foschia"; vedi Figura 3 leggenda). La ME non ricomparve insuccessivi punti temporali (dati non mostrati; vedere film S1). Barra della scala, 2 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

MOVIE S1:. Vista 4D time-lapse di ME scomparsa Clicca qui per vedere film. lo stesso insieme di dati grezzi visualizzato in figura 1 è indicata come una "vista del volume 4D" con un ingrandimento minore. La sequenza di time-lapse originale comprende 8 punti temporali, separati da 60 sec; riproduzione è a 4 fotogrammi / sec. La sequenza è breve pausa all'inizio di ciascuno dei 24 3D rotazione passi circa l'asse y (15 gradi / step) per attirare l'attenzione sul procinto di scomparire ME (freccia rossa). Si noti che la ME è visibile, si avvicina al bordo del bouton (membrana plasmatica), scompare, e non restituisce, intutte le prospettive di visualizzazione. A causa della bassa risoluzione asse z rispetto alla risoluzione xy, la forma della ME sembra allungare e accorciare seconda visione prospettica. Le immagini sono state esportate come filmato QuickTime, e annotati utilizzando QuickTime Pro. Barra della scala, 2 micron.

Figura 2. Vista ortogonale di un endosomi fuso putativo. Una preparazione muscolare nervo è stato sequenzialmente tinto con un colorante vitale lisosomiale (rosso) per etichettare AES e FM1-43 (verde) per etichettare ME con 0,5 M di stimolazione saccarosio come descritto nei metodi. I dati da un punto di tempo di un film 4D vengono visualizzati come viste di volume 3D in tre orientamenti. Al top (pannelli 1-3) è il punto di vista convenzionale dall'alto (piano xy). A medio (pannelli 4-6) è una vista perpendicolare al piano xy enella (arbitraria) direzione della grande freccia rossa. In fondo (pannelli 7-9) è una vista reciprocamente perpendicolare entrambe le viste sopra, in direzione della freccia grande blu. Un ME (verde) è contrassegnato da una freccia verde; due eventi avversi (rosso) sono contrassegnati da frecce rosse. Un endosomi contenenti entrambi i coloranti (giallo) è contrassegnato da una freccia gialla in pannelli di 3, 6 e 9. Notare che la sovrapposizione di rosso e verde è altrettanto completo in tutte e tre le proiezioni ortogonali. Barra della scala, 2 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

MOVIE S2:. Rotazione Interactive di un'immagine contenente ME e endosomi acidi EA . Clicca qui per vedere film Il set di dati di figura 2 è mostrata configurato come completamente ruotabile immagini 3D (QuickTime virtuale Reality formato; utilizzare il mouse per ruotare l'immagine per la visualizzazione da qualsiasi direzione). I putativo ME fusi / AE rimane gialla da tutte le prospettive.

Figura 3. Deconvoluzione migliora la risoluzione spaziale 3D. Due terminali tipici serpente nervose, mostrato a bassa (in alto) e alto (basso) di ingrandimento rispettivamente e macchiato durante la stimolazione con FM1-43. FM1-43 di fondo "foschia", a causa di etichettatura delle singole vescicole 50 nm, mostra la forma di boutons terminali, ai quali ME sono confinati. I dati vengono visualizzati come anaglifi rosso-verde di vista del volume 3D (profondità può essere visualizzato con vetri rosso-verde o rosso-blu, rosso occhio sinistro; nota assoni in alto a sinistra scende nel piano del terminale da sopra). Pannelli a sinistra: dati grezzi; Pannelli di destra: i dati dopodeconvoluzione. Si noti il ​​significativo miglioramento nella risoluzione di ME. Pannelli di testa: la stimolazione elettrica; intero terminale mostrato (~ 30 x 50 micron) (stessi dati grezzi come in figura 1 e Movie S1, barra della scala, 10 micron). Pannelli di fondo: stimolazione KCl; ingrandita per mostrare quattro boutons individuali (~ 3 x 5 micron; bar scala, 2 micron). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.