Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Sommario

Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.

Abstract

Mammiferi sicuro nel recupero sensoriale e motoria seguente lesione del midollo spinale per mancanza di ricrescita assonale sotto del livello della lesione e l'incapacità di reinizializzare neurogenesi spinale. Tuttavia, alcuni Anamni tra cui il zebrafish Danio rerio mostre sia sensoriali e recupero funzionale anche dopo la completa resezione del midollo spinale. Lo zebrafish adulto è un organismo modello stabilito per studiare la rigenerazione dopo la lesione del midollo spinale, con recupero sensoriale e motorio da 6 settimane post-infortunio. Per usufruire di analisi in vivo del processo rigenerativo disponibile in zebrafish larvale trasparente così come strumenti genetici non accessibile nell'adulto, usiamo il zebrafish larvale di studiare la rigenerazione dopo resezione del midollo spinale. Qui mostriamo un metodo per riproducibile e verificabile sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, dai dati risulta recupero sensoriale inizio a due giorni post-infortunio (dpi), with il movimento di C-bend rilevabile da 3 dpi e la ripresa di nuoto libero da 5 dpi. Così proponiamo zebrafish larvale come strumento guidata al zebrafish adulti per lo studio di recupero dopo lesione del midollo spinale.

Introduzione

Grave trauma al midollo spinale umano si traduce spesso in paralisi permanente e perdita di sensibilità al di sotto del livello della lesione, a causa della incapacità di ricrescere assoni o iniziare nuovamente neurogenesi ^1,2. In contrasto con i mammiferi, tuttavia, Anamni tra cui salamandre e zebrafish (Danio rerio) mostrano robusta ripresa anche dopo la completa del midollo spinale recisione ^3,4.

Lo zebrafish adulto è un modello ben consolidato per studiare il processo di recupero dopo lesione del midollo spinale ^5-7. Dopo resezione completa del midollo spinale, ripristino della funzione sensoriale e locomotiva è osservata nel zebrafish adulto per 6 settimane post-infortunio ^8. Al fine di esaminare il processo di rigenerazione in vivo, ci siamo rivolti al zebrafish larvale trasparente ^9.

Qui vi presentiamo un metodo per transetto midollo spinale di un 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) larvale zebrafish USIng una pipetta microiniezione smussato come un bisturi, modificato da Bhatt, et al. ¹⁰ Questo metodo supporta throughput elevato, bassa mortalità e riproducibilità. Con la pratica, 300 larve / h può essere sezionato, e oltre 6 mesi di transections, di cui oltre 3.600 animali, 98,75% ± 0,72% sopravvisse entro 7 giorni post-infortunio (dpi). I nostri dati mostrano un rapido recupero di locomozione sensoriale e così: a 1 dpi, tutti i movimenti dai pesci feriti è guidata da un solo pettorale locomozione pinna. Tuttavia, le larve iniziano a rispondere al tungsteno ago tocco caudale a resezione del 2 dpi, ristabilire il movimento C-bend da 3 dpi, e visualizzare il nuoto predatori del 5 dpi ^11. Utilizzando la colorazione anticorpi contro tubulina acetilata, abbiamo confermato che gli assoni sono assenti dal sito di lesione a 1 dpi, ma abbiamo attraversato il sito di lesione da 5 dpi. Crediamo che questo protocollo fornirà una valida tecnica per lo studio di ricrescita assonale e neurogenesi nel midollo spinale dopo la lesione.

Protocollo

Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard; esperimenti sono stati approvati dalla University of Utah Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.

1. Preparazione di piatti Chirurgia

1. Fai piastre di chirurgia con 60 millimetri Petri e Sylgard 184 Kit di silicone elastomero, seguendo le istruzioni del produttore. Riempire i piatti non più di mezzo pieno e lasciare polimerizzare. Conservare coperto a temperatura ambiente.

2. Preparazione di Micropipette

1. Realizzare micropipette da riscaldamento e tirando a parete sottile tubo borosilicato capillare in un estrattore micropipetta utilizzando le stesse impostazioni per rendere aghi microiniezione.
2. Sotto un microscopio dissezione, snap off punta della micropipetta a circa 200 micron di diametro con pinza.
3. Smusso bordo spezzato con un microgrinder inizialmente a 35 °, seguita da una seconda smussatura a 25 °. Assicurarsi che la punta è tagliente e SMOOTH. Conservare finito micropipetta smussato in una capsula di Petri su una piccola quantità di argilla.

3. Preparazione di Zebrafish larve

1. 7 giorni prima della chirurgia, istituito serbatoi di accoppiamento di zebrafish maschile e femminile.
2. Raccogliere gli embrioni la mattina seguente, 3 ore dopo che le luci si accendono per garantire la massima resa. Se si utilizza una linea giornalista transgenica come Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, embrioni fecondati liste 100/100 mm Piastra in 25 ml di E3 a 28,5 ° C. In caso di utilizzo di tipo selvatico, specie fecondato embrioni mm piastra 25/100 in 25 ml di E3 a 28,5 ° C.
3. Se si utilizza una linea di giornalista, lo screening degli embrioni per l'espressione fluorescente a 48 HPF. Lasciare embrioni individuati a maturare ad una densità di mm piastra 25/100 in 25 ml di E3 a 28,5 ° C.
4. Quando le larve sono 5 dpf, preparare piastra chirurgia coprendo Sylgard con E2 + 10 mg / L Gentamicina solfato (GS) + Tricaine.
   1. Preparare piatto di recupero con l'aggiunta di 25 ml E2 + GS ad un 100 millimetri dis Petrih.
   2. Preparare bisturi con nastro adesivo insieme tre tamponi. Questo sarà un utensile triangolare con tre scanalature.
   3. Montare una micropipetta preparato sui tamponi con nastro adesivo in una delle scanalature.
5. In caso di riutilizzo micropipette, a filo fino chiari con E2 + GS utilizzando una siringa da 1 ml e un ago G 27 prima del montaggio su tamponi.

4. Chirurgia

1. Anestetizzare 1 piatto di larve in un momento (25 pesci) con Tricaine. I pesci sono sufficientemente anestetizzati quando si mostrano più risposta al tocco. È importante che i pesci sono completamente anestetizzati prima dell'intervento, altrimenti si contrarsi quando il bisturi li tocca. La chirurgia è eseguita al microscopio di dissezione.
2. Trasferimento larve piastra intervento chirurgico.
   1. Sotto massimo ingrandimento, ruotare una larva alla volta in modo che giace su un fianco con la schiena più vicino alla mano che tiene il bisturi.
   2. Posizione pinza in modo che essi appoggiano sul Sylgard,angolata tutta la larghezza della larva.
   3. Rinforzo il bisturi vetro contro uno dei bracci della pinza, tagliate a faccia laterale dorsale della larva a livello del poro anale, assicurandosi di non tagliare oltre il bordo ventrale della notocorda. Ruotare il bisturi per recidere il midollo spinale.
   4. Ripetere l'operazione con il restante larve.
      Nota: se una larva sanguina, ma non si riprenderà dalla chirurgia. Rimuovere immediatamente la larva dalla piastra chirurgia e eutanasia tramite overdose Tricaine.
3. Dopo l'intervento chirurgico sul lotto di larve è completa, trasferimento ferito animali alla piastra recupero. Questo è sostenere la compensazione di anestesia.
   1. Attenzione: quando si raccolgono le larve feriti per il trasferimento, assicurarsi che siano raccolti capo né coda prima: non sottolineare il sito di lesione piegando le larve.
      Nota: Tutti i dispositivi usati per la chirurgia possono essere riutilizzati, compresi i micropipette.

5. Recovery

1. Transfer ferito larve dalla piastra recupero a 100 lastre mm riempite con 25 ml E2 + GS con una densità di 25/plate. Permette di recuperare in un incubatore 28,5 ° C.
2. Controllare piatti ogni giorno, eliminando gli animali malati o morti. Non cambiare il supporto fino Coleps (acqua dolce protozoi) sono visibili nei media. Quando si cambia il supporto, non trasferire il pesce ad una nuova piastra; invece, rimuovere quanto più mezzi di comunicazione possibile e inondare la stessa piastra con i nuovi media. Ripetere se necessario per ridurre la popolazione Coleps.
3. Alimentare ogni giorno con una piccola quantità di cibo avannotti in polvere.
   Nota: cibo vivo (ad esempio, paramecia o rotiferi), non possono essere alimentati da larve ferito solo dopo aver recuperato locomozione. In caso contrario, il cibo vivo sarà colonizzare il sito di lesione e uccidere le larve.

Risultati

Per ridurre la gravità dei danni ai tessuti circostanti il sito di lesione, la corretta smussatura della micropipetta è critica. Figura 1A mostra una punta smussata correttamente. Utilizzando una punta che è troppo ampia (Figura 1B) tende a provocare incidenti mortali più elevate a causa della maggiore probabilità di intaccare l'aorta dorsale, mentre una punta che è troppo stretto (Figura 1C) tende a colpo d'occhio fuori la pelle piuttosto che il taglio dei tess...

Discussione

Quando inizialmente imparare questa tecnica, si consiglia di tentare non più di 50-100 transections in una singola sessione. Dopo aver imparato questa tecnica, siamo in grado di transetto fino a 300 embrioni per ora; Tuttavia, questo livello di velocità richiede pochi mesi di pratica settimanale. Consigliamo inoltre praticare con una linea giornalista e la verifica completa resezione finché l'incidenza di incompleta recisione del midollo spinale è ridotto a meno dell'1%.

Recisione de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri da 60 mm	VWR	82050-544
Piastra di Petri da 100 mm	VWR	89038-968
PDMS, kit elastomero siliconico Sylgard 184	Scientific	NC9644388
tubo capillare in borosilicato: OD 1,00 mm, ID 0,78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Pinze	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Microscopio di dissezione	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	sciogliere in acqua 10 mg/ml, conservare a -20 gradi C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Applicatore con punta in cotone, legno, 6 pollici	Fisher Scientific	23-400-101
Siringa da 1 ml	BD	309625
ago da 27 G	BD	305109
Friggere cibo	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	negozio a -20 ° C
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument Co.	Modello P-97	Scatola Filamento FB330B
20x E2 (1 L); conservare su RT
17,5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0,75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2,90 g CaCl2· 2H2O	Sigma	C7902-500G
4,90 g MgSO4· 7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); preparare fresco, scartare
0,35 g in più di NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); conservare da RT
50 ml 20x E2
2 ml fresco 500x NaCO3