Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Sommario

In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.

Abstract

Espressione efficace dei transgeni in vivo è di fondamentale importanza nello studio funzione del gene e lo sviluppo di trattamenti per le malattie. Negli ultimi anni, la consegna del gene idrodinamico (HGD) è emersa come un metodo semplice, veloce, sicuro ed efficace per la consegna di transgeni in roditori. Questa tecnica si basa sulla forza generata dalla iniezione rapida di un gran volume di soluzione fisiologica per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari di organi perfusi e quindi consegnare DNA nelle cellule. Uno dei principali vantaggi del HGD è la possibilità di introdurre transgeni in cellule di mammifero usando nuda DNA plasmidico (pDNA). L'introduzione di un gene esogeno utilizzando un plasmide è minimamente laborioso, altamente efficiente e, contrariamente ai vettori virali, notevolmente sicuro. HGD è stato inizialmente utilizzato per trasportare i geni nei topi, è ora utilizzato per fornire una vasta gamma di sostanze, tra cui oligonucleotidi, cromosomi artificiali, RNA, proteine ​​e piccole molecole in topi, rattie, in misura limitata, altri animali. Questo protocollo descrive HGD nei topi e si concentra su tre aspetti fondamentali del metodo che sono fondamentali per eseguire la procedura correttamente: corretto inserimento dell'ago nella vena, il volume di iniezione e la velocità di consegna. Esempi sono forniti per mostrare l'applicazione di questo metodo per l'espressione transiente dei due geni che codificano proteine ​​secrete, specifico primate-, apolipoproteina LI (APOL-I) e proteine ​​aptoglobina correlata (HPR).

Introduzione

Fin dalla sua prima descrizione da Liu et al. Ed Zhang et al., Consegna del gene idrodinamico (HGD) è diventato uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene in sistemi modello roditore ^{1, 2.} La tecnica prevede l'iniezione rapida (5-7 sec) di un grande volume (8-12% del peso corporeo) di soluzione nella vena caudale di topi per facilitare l'assorbimento di DNA plasmidico da cellule di organi bersaglio ^{1, 2.} Queste condizioni portano ad espressione genica robusta nel fegato e meno espressione genica nel rene, milza, polmone e cuore.

Iniezione di 10 mg pCMV-LacZ plasmide può trasfet....

Protocollo

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal Comitato di Hunter College Institutional Animal Care ed uso, City University of New York.

1. Preparazione privo di endotossine plasmide DNA

1. Scegliere una singola colonia di batteri contenenti il ​​gene di interesse in un vettore di espressione di mammifero da una piastra selettiva appena striato.
2. Seguire le indicazioni fornite nel manuale di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio per la coltivazione e la raccolta dei batteri.
3. Purificare il privo di endotossine DNA plasmidico da cellule batteriche seguendo il ....

Risultati

Il corretto posizionamento dell'ago nella vena della coda del topo (come illustrato nella Figura 1) è un prerequisito per ottenere con successo un transgene mediante trasfezione basato idrodinamica. Spesso la parte più impegnativa della tecnica, tuttavia, è il mantenimento dell'ago all'interno della vena caudale senza movimento in modo che l'intero volume di iniezione può essere formulato entro 6-8 s. Piccoli errori durante il processo di iniezione possono causare notevolmente ridotta ef.......

Discussione

Quando eseguito correttamente, HGD è un mezzo straordinariamente efficace e sicuro di consegna transgene. I passaggi critici di successo HGD sono: 1) fornire la giusta quantità di DNA in un grande volume di soluzione salina veicolo 2) nella vena della coda del topo 3) in meno di 8 sec.

Sebbene il processo di iniezione stesso richiede innegabilmente una certa destrezza manuale, il successo di questa procedura sei secondi si trova spesso in preparazione accurata dell'esperimento. La quanti.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Salvietta imbevuta di alcol	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetrico	AAT Bioquest	13801
Tubo conico, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Illuminatore per coda di topo	Braintree Scientific	Ago MTI RST	o equivalente
, 20 Gx 1 (0,9 mmx25 mm)	Ago	305175
27 Gx 1/2 (0,9 mmx25 mm)	BD	305109
pRG977 (vettore di espressione dei mammiferi)	Contratto di trasferimento materiale	Regeneron Pharmaceuticals
Cloruro di sodio, 0,9% INJ USP 10 ml, Hospira		Fisher NC9054335
, 3 ml, punta Luer-Lok	BD	309657	Luer Lock necessaria per resistere alla pressione dell'HGD

BD, richiestoSiringa