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Articolo metodologico

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

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DOI:

10.3791/51481

⸱

5 maggio 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

In questo articolo

Sommario

In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.

Abstract

Espressione efficace dei transgeni in vivo è di fondamentale importanza nello studio funzione del gene e lo sviluppo di trattamenti per le malattie. Negli ultimi anni, la consegna del gene idrodinamico (HGD) è emersa come un metodo semplice, veloce, sicuro ed efficace per la consegna di transgeni in roditori. Questa tecnica si basa sulla forza generata dalla iniezione rapida di un gran volume di soluzione fisiologica per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari di organi perfusi e quindi consegnare DNA nelle cellule. Uno dei principali vantaggi del HGD è la possibilità di introdurre transgeni in cellule di mammifero usando nuda DNA plasmidico (pDNA). L'introduzione di un gene esogeno utilizzando un plasmide è minimamente laborioso, altamente efficiente e, contrariamente ai vettori virali, notevolmente sicuro. HGD è stato inizialmente utilizzato per trasportare i geni nei topi, è ora utilizzato per fornire una vasta gamma di sostanze, tra cui oligonucleotidi, cromosomi artificiali, RNA, proteine ​​e piccole molecole in topi, rattie, in misura limitata, altri animali. Questo protocollo descrive HGD nei topi e si concentra su tre aspetti fondamentali del metodo che sono fondamentali per eseguire la procedura correttamente: corretto inserimento dell'ago nella vena, il volume di iniezione e la velocità di consegna. Esempi sono forniti per mostrare l'applicazione di questo metodo per l'espressione transiente dei due geni che codificano proteine ​​secrete, specifico primate-, apolipoproteina LI (APOL-I) e proteine ​​aptoglobina correlata (HPR).

Introduzione

Fin dalla sua prima descrizione da Liu et al. Ed Zhang et al., Consegna del gene idrodinamico (HGD) è diventato uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene in sistemi modello roditore 1, 2. La tecnica prevede l'iniezione rapida (5-7 sec) di un grande volume (8-12% del peso corporeo) di soluzione nella vena caudale di topi per facilitare l'assorbimento di DNA plasmidico da cellule di organi bersaglio 1, 2. Queste condizioni portano ad espressione genica robusta nel fegato e meno espressione genica nel rene, milza, polmone e cuore.

Iniezione di 10 mg pCMV-LacZ plasmide può trasfettare fino al 40% degli epatociti, rendendo il HGD non virale in vivo metodo più efficiente, il trasferimento genico ad oggi 1. A differenza di vettori virali, pDNA è facile da preparare, non suscitare una risposta immunitaria nell'ospite roditore 3 e non costituisce un rischio per la salute ricombinando con finevirus esogeni. Inoltre, poiché le molecole di DNA forniti da HGD non necessitano imballaggio, questo metodo è adatto per la consegna dei cromosomi batterici artificiali (BAC) grandi come 150 kb 4. Altri tipi di molecole che sono state fornite da un metodo idrodinamico includono RNA 5-10, Morpholinos 11, proteine ​​12, 13 e altre piccole molecole 12, 14. I vantaggi e gli svantaggi di HGD rispetto ad altri metodi di consegna sono stati discussi in eccellenti recensioni in letteratura 15-20 e un certo numero di autori hanno fornito una descrizione dettagliata della procedura 21-23.

Introdurre transgeni in topi da HGD è sicuro ed efficace 1-3, 24 e il metodo è stato utilizzato in ratti con successo paragonabile 25. Con alcune modifiche, proof of concept esperimenti sono stati condotti in polli 26, rabi bit 27 e 28 suini, anche se, l'applicazione in vivo di questa tecnica in animali più grandi rimane una sfida. Quando si utilizza questo metodo, un altro limite comune è che molti dei vettori di espressione di mammifero disponibili mancano i componenti per realizzare una persistente, elevato livello di espressione genica. Utilizzando un plasmide, espressione genica pCMV-Luc in organi bersaglio è evidente già dieci minuti dopo HGD, tuttavia, il livello di espressione iniziale elevato scende bruscamente nella prima settimana dopo l'iniezione 1. Espressione del transgene a lungo termine è possibile a seconda del promotore e introni utilizzato nella progettazione plasmide 3, 24 iniezioni tuttavia, manutenzione di espressione genica di alto livello spesso richiede ripetuti. Per questo motivo, HGD potrebbe essere meno adatto per studiare le malattie croniche che sono il risultato di esposizione a lungo termine alle proteine ​​dannose o prodotti proteici. Con queste limitazioni, HGD è uno strumento estremamente potente per studiare il Poziale ruolo di un gene e l'effetto di essa mutanti in vivo, così come gli effetti terapeutici e regolazione delle proteine ​​e per la creazione di modelli animali di malattia (per una rassegna, si veda 15). Ad esempio, HGD può essere utilizzato per assegnare funzioni ai domini e aminoacidi di proteine ​​introducendo singolarmente vari costrutti genici in topi che hanno i rispettivi geni messo fuori. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata in qualsiasi ceppo di topi.

Questo protocollo descrive HGD in topi con un focus sugli aspetti tecnici necessari per raggiungere trasfezione di successo: corretto inserimento ago nella vena, volume di iniezione e la velocità di consegna. L'applicazione di questo metodo è dimostrato in un modello murino di tripanosomiasi africana, una malattia fatale di esseri umani e animali 29, 30. Mentre diverse specie di trypanosomes causano malattie nel bestiame, la maggior parte non può causare malattie negli esseri umani a causa di complessi immuni innate in blood chiamate fattori litici tripanosoma (TLFs) 29, 31, 32. Questi, lipoproteine ​​ad alta densità formanti pori (HDL) contengono due uniche, specifiche primate-proteine:. HPR, il ligando, che facilita l'assorbimento di TLFs in trypanosomes e APOL-I, la componente litica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense è in grado di infettare gli esseri umani a causa di espressione di una resistenza associata proteine ​​del siero (SRA) che si lega e neutralizza umano APOL-I 34, 39. Baboon TLF non è neutralizzato da SRA grazie alla sua divergente APOL-I proteica 40. Come riportato in precedenza, utilizzando un vettore di espressione di mammifero (pRG977), espressione transgenica di babbuino componenti TLF nei topi conferisce protezione contro trypanosomes umane-infettivi 40. I dati rappresentativi presentati dimostrano come gene delivery idrodinamico può essere applicato per studiare gli effetti terapeutici di una proteina.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal Comitato di Hunter College Institutional Animal Care ed uso, City University of New York.

1. Preparazione privo di endotossine plasmide DNA

  1. Scegliere una singola colonia di batteri contenenti il ​​gene di interesse in un vettore di espressione di mammifero da una piastra selettiva appena striato.
  2. Seguire le indicazioni fornite nel manuale di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio per la coltivazione e la raccolta dei batteri.
  3. Purificare il privo di endotossine DNA plasmidico da cellule batteriche seguendo il protocollo di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio.
  4. Utilizzare privo di endotossine plastico e maneggiare DNA con cura per assicurare che endotossine non è re-introdotto nel campione di DNA dopo la fase di rimozione.
  5. Misurare la concentrazione di endotossina senza plasmide DNA determinando la sua assorbanza a 260 nm utilizzando un micrspettrofotometro o volumi UV come descritto di seguito o uno standard, spettrofotometro basato cuvetta.
    1. Pulire le superfici ottiche inferiori e superiori del sistema di ritenzione del campione spettrofotometro micro come segue. Dispensare 1 ml di acqua deionizzata pulita sul sistema ottico inferiore. Chiudere il braccio di leva e toccare un paio di volte a fare il bagno al sistema ottico superiore, quindi leva di apertura e pulire con un panno.
    2. Aprire il software del micro spettrofotometro e selezionare il modulo acidi nucleici.
    3. Mettere 1 ml di acqua pulita deionizzata sul sistema ottico inferiore, abbassare il braccio di leva e selezionare "inizializzare" dal programma software. Una volta che l'inizializzazione è superfici completi, puliti sia ottici con un tessuto ..
    4. Eseguire la misurazione in bianco caricando 1 ml di privo di endotossine tampone TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) e selezionando "vuoto" dal programma software. Una volta che la misurazione in bianco è fatto, superfici pulite sia ottiche contessuto.
    5. Eseguire la misurazione del campione caricando 1 ml di privo di endotossine campione di DNA e selezionando "misura" dal programma software. Registrare la concentrazione di DNA. Valutare la purezza del DNA registrando il rapporto di assorbanza 260/280 nm che appare sullo schermo. Poiché l'uso di DNA puro (260/280 rapporto di 1,8) per HGD è altamente auspicabile, evitare di utilizzare un campione di DNA con un rapporto 260/280 sotto 1.7. Una volta misurazione viene effettuata, pulire entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto.

2. Pesatura dei topi

  1. Mark topi in modo appropriato per il ceppo. Nota: la marcatura della coda non è raccomandato per questa procedura.
    1. Specie di topo Mark che hanno pelliccia bianca (es. Swiss Webster) sulla schiena con un pennarello nero. Riapplicare marchi nel tempo necessario.
    2. Mark specie di topo che hanno pelliccia nera (ad es C57BL / 6) a orecchio punzonatura diversi giorni di anticipo.
  2. Pesare topi individually mettendoli delicatamente in un piatto animale o secchio posto su una bilancia da laboratorio digitale. Registrare il peso di ciascun topo utilizzato nell'esperimento, il giorno dell'esperimento.

3. Preparazione di siringhe

  1. Preparazione della miscela di iniezione
    1. Calcolare la quantità di DNA necessaria assumendo 5-50 ug privo di endotossine DNA plasmidico per l'iniezione di ciascun topo.
      1. Determinare la quantità ottimale di DNA plasmidico sperimentalmente.
      2. Nel determinare la quantità di DNA necessaria, assumere l'iniezione di un mouse aggiuntivo per ogni gruppo, come il caricamento corretto delle siringhe richiederà un po 'di mix di iniezione supplementare. Per aiutare i calcoli, si consideri il seguente esempio: iniettare 4 topi sperimentali e 4 di controllo, ciascuno del peso di 25 g, con 50 microgrammi di plasmide DNA per mouse. Per determinare la quantità di DNA necessaria in questo caso, calcolare con 5 topi per gruppo: 5 x 50 mcg = 250 ug di DNA necessarie per ciascun gruppo.
    2. Determinare la quantità di soluzione fisiologica (0,9% cloruro di sodio) necessari assumendo il 10% del peso corporeo per l'iniezione di ciascun topo.
      1. Secondo l'esempio di cui sopra, iniettare ogni 25 g mouse con 50 pg di DNA plasmidico in 2,5 ml di soluzione fisiologica (2,5 g di liquido).
      2. Nel determinare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per un intero gruppo di topi, assumere l'iniezione di un mouse aggiuntivo per gruppo per consentire il caricamento corretto delle siringhe. Considerando l'esperimento data, calcolare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per 5 topi in ciascun gruppo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml di soluzione fisiologica per ogni gruppo (o 25 ml totale). Nota: Se topi dello stesso gruppo non sono lo stesso peso (differenza superiore al 10% del peso corporeo), preparare iniezione mescola separatamente.
    3. Utilizzare conservanti e privo di endotossine, soluzione salina sterile che è stato approvato per uso umano, in 10 ml, più flaconi di utilizzo.
    4. Utilizzando un ago calibro 20 (0,9 mm x 25 mm) attaccato ad una punta luer-lock di una siringa da 20 ml,prelevare il liquido da fiale saline e svuotare le siringhe in una provetta conica da 50 ml. Per aiutare pipettaggio accurata salina durante la preparazione delle miscele di iniezione di DNA-salina, soluzione salina raccogliere più del necessario per l'iniezione di tutti i topi nell'esperimento. Per l'esperimento di cui sopra, ritirarsi salina da 3, 10 ml fiale (per un totale di circa 30 ml), anche se l'importo calcolato di soluzione fisiologica necessari per l'esperimento è solo 25 ml.
    5. Pipettare la quantità calcolata di DNA in un tubo da 50 ml differente. Fate attenzione a non toccare il lato del tubo con il corpo pipetta per evitare l'introduzione di endotossine. Secondo l'esempio, pipettare 250 pg di controllo e 250 pg di DNA plasmidico sperimentale in provette coniche separati.
    6. Aggiungere la quantità richiesta di soluzione salina al DNA usando una pipetta sierologica. Considerando l'esperimento campione, pipettare 12,5 ml di soluzione salina a ciascuno dei Master Mix (sperimentale e di controllo).
    7. Consentire tutte le soluzioni per raggiungeretemperatura ambiente prima dell'iniezione.
  2. Preparazione di siringhe
    1. Per ciascun topo, riempire una sterile, 3 ml, siringa luer-lock con la miscela di DNA-salina sterile utilizzando una, ago 20 gauge (0,9 mm x 25 mm). Fare attenzione ad evitare bolle d'aria. Evitare di utilizzare siringhe volumi elevati, la portata di iniezione non può essere controllato molto bene, ed è difficile da manipolare siringhe più grandi in una mano. Espellere qualsiasi mix di DNA-salina in eccesso nel tubo conico in quanto questo può essere riutilizzato.
    2. Passare l'ago di una sterile, ago 27-gauge. Riempire l'ago con il liquido completamente senza introdurre bolle d'aria. Regolare il volume della miscela di DNA-salina calcolato sulla base del peso del mouse.
    3. Non permettere che l'ago senza cappuccio di toccare qualsiasi superficie non sterile. Se necessario, gli aghi possono essere nuovamente presenze con la tecnica con una sola mano: mettere il tappo su una superficie piana, inserire l'ago, senza trattenendo il tappo con l'altra mano e premere l'ago copertocontro un oggetto fermo per fissare il tappo sul dell'ago. Le siringhe sono ora pronti per iniezioni vena della coda.

4. Consegna del DNA idrodinamica

  1. Si noti che i topi anestetizzante può ridurre la vitalità. Evitare di eseguire HGD in una stanza che è troppo freddo, in quanto questo sarà anche ridurre la vitalità. Se la stanza ha una temperatura ambiente di 20 ° C o se si utilizza l'anestesia, posizionare il mouse su una piastra elettrica a 37 ° C procedura di post per evitare la perdita di qualsiasi animale. Se si utilizza l'anestesia, assicurarsi che la bocca e il muso del mouse mentre si libera sulla rampa di calore e osservare il mouse fino a che non si riprenda pienamente. Non trattenere cibo né acqua dai topi prima di HGD.
  2. Riscaldare i topi di dilatare i vasi sanguigni.
    1. Posizionare la gabbia del mouse (con letti preparati) su un tappetino di calore per 5 minuti in modo che la temperatura della lettiera è di circa 38-39 ° C. La temperatura deve essere sufficientemente bassa per mantenere i topi sul tappetino calore per unperiodo prolungato.
    2. In alternativa, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione accesso dorsale con moderazione minima. Riscaldare la coda del topo per 1 min tenendolo delicatamente con una garza bagnata in acqua calda. Lasciare mouse per riposizionare, se necessario. Pulire la coda con un tessuto ad asciugare.
    3. In alternativa, caldo mouse posizionando la gabbia sotto una lampada di calore per non più di 2 min. Se si utilizza una lampada di calore, cautela per evitare il surriscaldamento del mouse.
  3. Iniezione coda vena di grandi volumi
    1. Immobilizzare un accesso restrainer dorsale su una superficie piana nastro laboratorio.
    2. Tenendo per la coda, posizionare il mouse delicatamente nel dispositivo di immobilizzazione e inserire la spina. Uso come poco fermo come necessario per mantenere la coda immobilizzato. Assicurarsi che il mouse respira liberamente.
    3. Se il mouse è in grave crisi in qualsiasi momento durante la procedura, rimuovere il mouse dalla immobilizzazione immediatamente e lasciarlo riposare.
    4. Posizionare il mouse in modouna delle vene caudale laterale è visibile. Individuare le vene caudali laterali da visto direttamente sul retro del mouse: la linea rossa scorre al centro della coda è un'arteria, mentre le linee blu su entrambi i lati della coda sono le vene caudali laterali.
    5. Pulire la coda del topo accuratamente con alcool.
    6. Usando la mano non iniezione, tenere la coda stretta tra l'indice e il medio in modo che la coda passa sotto l'indice, il medio e l'anulare e sotto il mignolo. Lasciare che il pollice di rimanere libero di muoversi. (Figura 1A)
    7. Con l'altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona.
    8. Raccogliete la siringa caricata con il iniezione-mano e tenere per la canna tra il pollice e le altre quattro cifre. Non tenere su lo stantuffo.
    9. Posizionare la siringa parallela alla coda con la punta dell'ago verso il corpo del mouse ela smussatura (bordo inclinato) dell'ago rivolta verso l'alto.
    10. Inserire l'ago nella vena della coda. Procedere con l'iniezione solo se la vena è posizionata correttamente, che è evidente dall'ago scorrevole in senza resistenza. Si noti che la profondità di inserimento dell'ago è una questione di preferenze personali però, pieno di inserimento non è raccomandato a causa di un aumentato rischio di taglio della vena. Evitare di spostare l'ago.
    11. Usando il pollice della mano-coda tenendo, chiudere sul mozzo dell'ago e premere mozzo contro la coda di tenere l'ago in posizione. Non applicare una pressione estrema e non tenere sull'albero ago, in quanto questi saranno ostacolare il flusso di liquido nella vena. Tenere la coda con il dito indice liberamente a questo punto in modo da non ostacolare l'iniezione (Figura 1A).
    12. Riposizionare la mano-siringa che tiene in modo che il dito indice e medio stanno trattenendo la flangia e il pollice si trova all'estremità dello stantuffo (Figure 1A).
    13. Premere verso il basso sul pistone in un movimento continuo ed iniettare l'intero volume del liquido in 6-8 sec.
    14. Rimuovere l'ago dalla vena e fermare l'emorragia applicando una leggera pressione alla coda con un fazzoletto.
    15. Rimuovere il mouse dal dispositivo di immobilizzazione e il luogo topo in una gabbia di recupero posta sulla cima di una piastra elettrica (biancheria da letto dovrebbe essere 37-38 ° C). Se la camera di iniezione è fredda, questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza del mouse. Tenere su la coda del topo fino sanguinamento si arresta completamente.
    16. Osservare il mouse per 1 ora dopo la consegna del DNA idrodinamica. Un periodo iniziale di ansimare e di immobilità è normale a causa dell'aritmia temporanea causata da HGD ma fare in modo che il mouse mostra segni di ripresa in circa 5 min. Se il respiro del mouse diventa estremamente superficiale, massaggiare delicatamente l'addome del mouse per facilitare la respirazione. Si noti che il tasso di recupero può essere leggermente influenzata dal ceppo di topi utilizzato.
    17. Topo di ritornoa gabbia alloggi e garantire che il mouse ha un abbondante approvvigionamento di cibo e acqua.
  4. Large-volume di iniezione coda vena con una posizione alternativa a mano
    1. Posizionare il mouse nel dispositivo di immobilizzazione e prepararsi per l'iniezione seguendo i punti 4.3.1 tramite 4.3.5, come descritto in precedenza.
    2. Appoggiare la mano non iniezione su una superficie piana con quattro dita piegate con un angolo di novanta gradi. Le dita (tutti tranne pollice) devono appoggiare su di loro, creando una piattaforma. Tenere la coda del topo tra il pollice e il dito di puntamento (Figura 1B).
    3. Con l'altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona.
    4. Afferrare siringa con l'iniezione mano tenendolo per la flangia e l'estremità dello stantuffo, pronto per l'iniezione.
    5. Completare la procedura seguendo questo protocollo dal punto 4.3.9 fino al passo 4.3.17, come descritto in precedenza.

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Risultati

Il corretto posizionamento dell'ago nella vena della coda del topo (come illustrato nella Figura 1) è un prerequisito per ottenere con successo un transgene mediante trasfezione basato idrodinamica. Spesso la parte più impegnativa della tecnica, tuttavia, è il mantenimento dell'ago all'interno della vena caudale senza movimento in modo che l'intero volume di iniezione può essere formulato entro 6-8 s. Piccoli errori durante il processo di iniezione possono causare notevolmente ridotta ef...

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Discussione

Quando eseguito correttamente, HGD è un mezzo straordinariamente efficace e sicuro di consegna transgene. I passaggi critici di successo HGD sono: 1) fornire la giusta quantità di DNA in un grande volume di soluzione salina veicolo 2) nella vena della coda del topo 3) in meno di 8 sec.

Sebbene il processo di iniezione stesso richiede innegabilmente una certa destrezza manuale, il successo di questa procedura sei secondi si trova spesso in preparazione accurata dell'esperimento. La quanti...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Ringraziamo Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) per averci insegnato inizialmente la tecnica HGD e il dottor Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) per la sua continua guida in vari aspetti della tecnologia. Questo lavoro è stato finanziato da Hunter College, CUNY start up fondi e premio NSF Pane IOS-1249166. Ringraziamo il NYULMC Istopatologia Nucleo NYUCI Support Center Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 per l'esame istologico sui fegati di topo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Salvietta imbevuta di alcolWebcol6818
AST kit, Amplite ColorimetricoAAT Bioquest13801
Tubo conico, 50 mlBD Falcon352070
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
Illuminatore per coda di topoBraintree ScientificAgo MTI RSTo equivalente
, 20 Gx 1 (0,9 mmx25 mm)Ago305175
27 Gx 1/2 (0,9 mmx25 mm)BD305109
pRG977 (vettore di espressione dei mammiferi)Contratto di trasferimento materialeRegeneron Pharmaceuticals
Cloruro di sodio, 0,9% INJ USP 10 ml, Hospira Fisher NC9054335
, 3 ml, punta Luer-LokBD309657Luer Lock necessaria per resistere alla pressione dell'HGD
BD, richiestoSiringa

Riferimenti

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