Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.
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Articolo metodologico
Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fagocitosi è un processo in cui una cellula avvolge materiale (intera cella, parti di una cellula, detriti, ecc) nel suo ambiente extracellulare circostante e successivamente digerisce questo materiale, comunemente mediante degradazione lisosomiale. Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) la cui funzione fagocitica è stata descritta in una vasta gamma di condizioni di malattia neurodegenerativa (es. pallone beta-amiloide nella malattia di Alzheimer) allo sviluppo del cervello sano (ad esempio, sinaptica potature) 1-6. Il protocollo che segue è un test fagocitazione sviluppato per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate topo in via di sviluppo 7. Mentre questo test è stato utilizzato per valutare la funzione microglia in questo particolare contesto, un approccio simile può essere utilizzato per valutare altri fagociti tutto il cervello (ad esempio, astrociti) e il resto del corpo(ad esempio, macrofagi periferici) nonché altri contesti in cui avviene il rimodellamento sinaptico (ad esempio, il trauma cranico / malattia).
Introduzione
Circuiti sinaptici rimodellare tutta la vita di un animale. Nel cervello in via di sviluppo, le sinapsi si formano in eccesso e devono subire la potatura sinaptica che comporta la rimozione selettiva di un sottoinsieme di sinapsi e la manutenzione e il potenziamento di quelle sinapsi che rimangono 8-10. Questo processo è necessario per conseguire la connettività precisa caratteristica del sistema nervoso adulto. Nell'adulto, sinapsi possono anche essere di plastica, in particolare nel contesto di apprendimento e memoria. Le correlazioni strutturali di questa plasticità si pensa di includere l'aggiunta e / o l'eliminazione delle spine dend....
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Protocollo
1. Anterograda Etichettatura di RGC presinaptici ingressi
Nota: Tutti gli esperimenti che comportano l'uso di animali sono stati esaminati e supervisionate dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale (IACUC) in conformità a tutte le direttive NIH.
- Sterilizzare campo e gli strumenti.
- Anestetizzare mouse con 4 vol% isoflurano in una camera di induzione plexiglas (questa vol% isoflurano lavora per topi neonati-adulti). Osservare i topi strettamente per evitare un eccesso di anestetizzante. ATTENZIONE: Evitare l'inalazione con una evacuazione dei gas di scarico sotto vuoto.
- Dopo 1-3 minut....
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Risultati
Recentemente, abbiamo utilizzato questo test fagocitazione per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate in via di sviluppo (Figura 1) 7. RGC da CX3CR1-EGFP topi eterozigoti sono stati rintracciati anterogradely con CTB-594 e CTB-647 negli occhi sinistro e destro rispettivamente. A seguito di tale tracciato, microglia EGFP-positivi all'interno del dLGN sono stati ripresi. Queste immagini sono state successivamente .......
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Discussione
Al fine di misurare con precisione la fagocitosi, materiale inghiottito deve essere etichettato in modo tale che il ricercatore può visualizzare una volta è verificato degradazione lisosomiale. Inoltre, è necessaria imaging ad alta risoluzione, seguito dall'uso di software che permetterà al ricercatore di visualizzare il volume dell'intera cella e quantificare il contenuto. In questo protocollo, si descrive un metodo altamente affidabile e quantitativo per la misurazione fagocitazione phagocyte-mediata con CTB c.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Famiglia Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Termoforo | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Fonte di acqua calda per termoforo | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereomicroscopio | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Microscopio | |
| Microtomo scorrevole con tavolino di congelamento | Leica | SM2010 R | |
| Lama per microtomo | Leica | 14021607100 | |
| Microscopio da dissezione fluorescente | Nikon | SMZ800 con Microscopio | |
| confocale a disco rotante | Perkin Elmer | UltraView Vox Disco rotante confocale | |
| 10 &; l Siringhe a tenuta di gas | Hamilton Hamilton | 80030 | Utilizzare una siringa diversa per ogni colorante/tracciante |
| Aghi Hamilton | Hamilton | 7803-05, specifiche: smussato, tossina | |
| e subunità beta (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Ricostituire in soluzione fisiologica sterile, 80 &; l (488), 100 & micro; l (594), 20 µ l (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Soluzione salina tamponata con fosfato ( PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomicina e polimixina B solfati e bacitracina Zinco Unguento oftalmico USP (unguento antibiotico) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| Ago da 30,5 G | Becton Dickinson | 305106 | |
| Forbici a molla | Roboz | RS-5630 | |
| Applicatore con punta in cotone | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Scienze della microscopia elettronica | 15710 | Diluire dal 16% al 4% in PBS. La paraformaldeide è tossica, utilizzare in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale. |
| Strumenti di dissezione – forbici, pinze, spatola | Forbici piccole: Fine Science Tools | Forbici piccole: 14370-22 | |
| Forbici grandi: Roboz | Forbici grandi: RS-6820 | ||
| #55 pinze: Fine Science Tools | #55 pinze: 11255-20 | ||
| Spatola: Ted Pella, Inc. | Spatola: 13504 | ||
| Saccarosio | Sigma | S8501-5KG | Produce il 30% di saccarosio in PBS (peso/volume) |
| OCT Composto | VWR | 25608-930 | |
| Pesa USA | Scientific | 2347-1426 | |
| Piastre a 24 pozzetti | BD Biosciences | 353047 | |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma | S6566-500G | Produrre 0,2 M di fosfato di sodio monobasico (PB-A) in ddH2O e 0,2 M di fosfato di sodio bibasico (PB-B) in ddH2O. Per ottenere 0,1 M di PB, combinare 19 ml di PB-A e 81 ml di PB-B, riempire fino a 200 ml con ddH2O |
| Sodio fosfato bibasico | Sigma | S5136-500G | |
| Vetrini coprioggetti, 22 X 50 mm, n. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Vetrino per microscopio carico | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
Riferimenti
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. ....
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Ristampe e permessi
